用于純化重組因子Xa衍生物的方法
【專利摘要】本文中公開了用于純化絲氨酸蛋白酶的方法和試劑盒。所述方法需要將所述絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的親和力色譜儀，并且利用包含能破壞所述STI與所述絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液來(lái)洗脫所述絲氨酸蛋白酶。
【專利說(shuō)明】用于純化重組因子Xa衍生物的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考 本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C. § 119(e)要求2012年6月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào) 61/659,821的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容以全文引用的方式并入本公開中。
[0002] 背景 抗凝血?jiǎng)M足了市場(chǎng)上在治療或預(yù)防傾向于形成血液凝塊的患者（舉例來(lái)說(shuō)，諸如具 有凝血障礙、長(zhǎng)期不能移動(dòng)或正進(jìn)行醫(yī)療手術(shù)的那些患者）的不希望有的血栓形成時(shí)的需 求。然而，抗凝療法的主要局限性之一是與治療相關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)，而且在用藥過(guò)量的情況下 或在需要進(jìn)行緊急手術(shù)程序時(shí)在快速逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┗钚缘哪芰Ψ矫娲嬖谥T多局限性。因 而，針對(duì)所有抗凝療法形式的特效解毒劑是非常合乎需要的。出于安全考慮，在新型抗凝血 藥的開發(fā)中得到抗凝血?jiǎng)?解毒劑配對(duì)也是有利的。
[0003] 先前報(bào)告的因子Xa (fXa)蛋白的經(jīng)修飾衍生物可用作靶向fXa的抗凝血?jiǎng)┑慕?毒劑，諸如美國(guó)專利號(hào)8, 153, 390和8, 268, 783中所描述的那些。fXa蛋白的經(jīng)修飾衍生 物能結(jié)合和/或基本上中和抗凝血?jiǎng)?。然而，引入至這些fXa衍生物中的某些修飾對(duì)純化 提出了若干項(xiàng)挑戰(zhàn)，這是因?yàn)橛糜诩兓Y(jié)因子的常規(guī)方法不能有效地用于這些經(jīng)修飾的 fXa蛋白。
[0004] 概要 本文中公開了用于純化絲氨酸蛋白酶的方法和試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述方法 需要將絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，諸如樹脂或 柱，并且用洗脫緩沖液來(lái)洗脫多肽。在一些實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液包含諸如競(jìng)爭(zhēng)劑等 能破壞STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液 還包含鹽和/或清潔劑。
[0005] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種純化絲氨酸蛋白酶的方法，該方法包括將絲氨酸 蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和用包含能破壞STI與絲 氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液來(lái)洗脫絲氨酸蛋白酶。
[0006] 在一些方面，所述洗脫緩沖液還包含鹽、清潔劑和/或離液劑。
[0007] 在一些方面，所述試劑是競(jìng)爭(zhēng)劑，所述競(jìng)爭(zhēng)劑可以選自苯甲脒、對(duì)氨基苯甲脒、精 氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬物類fXa抑制劑。在一些方面，所述競(jìng) 爭(zhēng)劑是精氨酸。
[0008] 在一些方面，絲氨酸蛋白酶是包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或與 SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點(diǎn)上具 有突變的多肽。
[0009] 在一些方面，絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 2 具有至少約95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點(diǎn)上具有突變的多肽。在 一些方面，所述絲氨酸蛋白酶包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
[0010] 在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約10. 5。在一些方面，所述洗脫 緩沖液的pH值為約5. 0。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約7. 4。
[0011] 在一些方面，所述洗脫緩沖液包含約250 mM精氨酸至約1000 mM精氨酸。在一些 方面，所述洗脫緩沖液包含約500 mM精氨酸。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH值為約 5. 0〇
[0012] 在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括用離子交換柱對(duì)經(jīng)過(guò)洗脫的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行 純化。
[0013] 還提供了利用本公開的方法制備的經(jīng)過(guò)純化的絲氨酸蛋白酶。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，該試劑盒包括基于大豆胰蛋白酶抑制劑 (STI)的親和力色譜儀，和包含能破壞STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的競(jìng)爭(zhēng)劑的洗 脫緩沖液。
[0015] 在一些方面，所述洗脫緩沖液還包含精氨酸。在一些方面，所述洗脫緩沖液的pH 值為約4. 5至約10. 5。在一些方面，所述洗脫緩沖液包含約250 mM精氨酸至約1000 mM精 氨酸。在一些方面，所述試劑盒還包含洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖液包含約250 mM處于中 性pH值下的NaCl。
[0016] 附圖簡(jiǎn)述 圖1示出了在氨基酸106-111處具有連接子-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)的SEQ ID NO: 1，即一種fXa衍生物（也稱為r-解毒劑前體）。
[0017] 圖2示出了從所述r-解毒劑前體去除了所述連接子的SEQ ID NO: 2,即一種fXa 衍生物（也稱為r-解毒劑）。
[0018] 圖3示出了如實(shí)施例1中所描述在苯甲脒-瓊脂糖親和樹脂上使用經(jīng)過(guò)純化的 r-解毒劑的負(fù)載曲線。
[0019] 圖4示出了如實(shí)施例1中所描述在L-賴氨酸-瓊脂糖親和樹脂上使用經(jīng)過(guò)純化 的r-解毒劑的負(fù)載曲線。
[0020] 圖5示出了如實(shí)施例1中所描述在抑肽酶-瓊脂糖親和樹脂上使用經(jīng)過(guò)純化的 r-解毒劑的負(fù)載曲線。
[0021] 圖6示出了如實(shí)施例1中所描述在STI-瓊脂糖親和樹脂上使用經(jīng)過(guò)純化的r-解 毒劑的負(fù)載曲線。
[0022] 圖7示出了使用從細(xì)胞培養(yǎng)物收集的條件培養(yǎng)基（所收集的細(xì)胞培養(yǎng)液）時(shí)的 STI-瓊脂糖負(fù)載曲線，表明功能蛋白被STI樹脂俘獲（如實(shí)施例2中所描述）。
[0023] 圖8示出了如實(shí)施例2中所描述在HQ-瓊脂糖前置柱上（以流過(guò)模式）使用所收 集的細(xì)胞培養(yǎng)液的負(fù)載曲線。
[0024] 圖9示出了被裝載到STI-瓊脂糖的HQ-瓊脂糖FT級(jí)分的負(fù)載曲線，其表明功能 蛋白被STI-樹脂俘獲。
[0025] 圖10A-B示出了如實(shí)施例2中所描述用I M苯甲脒洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。將使用1 M苯甲脒的洗脫曲線示于圖IOA中，并且將對(duì)經(jīng)STI洗脫并匯集的級(jí)分進(jìn)行的西方印跡分析 (Western blot)結(jié)果示于圖IOB中。分子標(biāo)記被裝載到圖IOB的第1道和第IA道中；FXa 被裝載到第2道和第2B道中；并且從STI-瓊脂糖柱洗脫的r-解毒劑被裝載到第4道和第 4B道中。
[0026] 圖11示出了如實(shí)施例2中所描述在苯甲脒梯度下的洗脫曲線。
[0027] 圖12示出了在實(shí)施例2中所描述的按比例放大的程序的洗脫曲線。
[0028] 圖13示出了針對(duì)25 L培養(yǎng)基的r-解毒劑純化方案（波狀袋）。UF =超濾；MWCO =分子量截止值；UF/DF =超濾/透濾。
[0029] 圖14繪示了如實(shí)施例2中所描述對(duì)經(jīng)過(guò)純化的r-解毒劑的SDS-PAGE分析結(jié)果。
[0030] 圖15示出了如實(shí)施例3中所描述使用精氨酸洗脫緩沖液的STI親和柱的洗脫曲 線。
[0031] 圖16繪示了如實(shí)施例3中所描述利用來(lái)自于具有不同的STI樹脂（A-E)的各種 STI親和柱的負(fù)載洗脫劑的還原銀染凝膠分析結(jié)果。利用精氨酸緩沖液洗脫產(chǎn)生了與利用 苯甲脒洗脫類似的產(chǎn)物分布。
[0032] 詳細(xì)描述 定義 除非另有指示，否則本公開的實(shí)踐將采用屬于本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)的常規(guī)組織培養(yǎng)、免 疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。參見例如Sambrook等，（1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第 2 版；Ausubel 等編，（1987) Current Protocols In Molecular Biology ;MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編，（1995) PCR 2: A Practical Approach ;Harlow 和 Lane 編，(1988) Antibodies, A Laboratory Manual ;Harlow 和 Lane 編，(1999) Using Antibodies, a Laboratory Manual ;和 R. I. Freshney 編，（1987) Animal Cell Culture。
[0033] 如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)"約" 一般意指所述值加上或減去該值的10%的范圍。
[0034] 如本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式"一 (種）"、"一個(gè)"和"所述"包括復(fù)數(shù)個(gè)引用對(duì)象。
[0035] 術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"肽"和"多肽"可互換使用且在其最廣泛意義上是指具有兩個(gè)或更 多個(gè)亞單位氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物的化合物。所述亞單位可通過(guò)肽鍵連接。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述亞單位可通過(guò)其它鍵，例如酯、醚等連接。蛋白質(zhì)或肽必須含有至 少兩個(gè)氨基酸，且對(duì)蛋白質(zhì)或肽序列中可包含的氨基酸的最大數(shù)目并無(wú)限制。如本文中所 使用，術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D與L光 學(xué)異構(gòu)體兩者、氨基酸類似物和肽模擬物。"肽模擬物"是旨在模擬肽的小蛋白質(zhì)樣鏈。其 可由修飾現(xiàn)有的肽，或通過(guò)設(shè)計(jì)能模擬肽的類似系統(tǒng)（諸如類肽和￠-肽）來(lái)制得。
[0036] 如本文中關(guān)于諸如DNA或RNA等核酸使用的術(shù)語(yǔ)"分離"或"重組"是指與其它DNA 或RNA分離的分子。術(shù)語(yǔ)"分離"在本文中還用于指與其它細(xì)胞蛋白質(zhì)分離的多核苷酸、多 肽和蛋白質(zhì)且意在涵蓋經(jīng)過(guò)純化的和重組的多肽。舉例來(lái)說(shuō)，分離的細(xì)胞是與具有不相似 的表型或基因型的組織或細(xì)胞分離的細(xì)胞。分離的多核苷酸是與其在其原生或天然環(huán)境中 (例如，在染色體上）在正常情況下所締合的3'和5'連續(xù)核苷酸分離。如本領(lǐng)域技術(shù)人員 所了解，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要"分離"以將其與其 天然存在的對(duì)應(yīng)物相區(qū)別。
[0037] 術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)、肽或多核苷酸的"生物學(xué)等效物"是指具有至少約80%同源性或序列 同一性，且可選地至少約85%、或可選地至少約90%、或可選地至少約95%、或可選地98%同源 性或序列同一性，并且展現(xiàn)與參考蛋白質(zhì)、多肽或核酸基本上等同的生物活性的蛋白質(zhì)、肽 或多核苷酸。
[0038] "雜交"是指可在不同"嚴(yán)格度"的條件下進(jìn)行的雜交反應(yīng)。增加雜交反應(yīng)的嚴(yán)格 度的條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且已經(jīng)公布：參見例如Sambrook等，見下文。相關(guān) 條件的例子包括（按照嚴(yán)格度增加的順序）：孵育溫度25°C、37°C、50°C和68°C ;緩沖液濃 度 10XSSC、6XSSC、1XSSC、0. IXSSC (其中 SSC 是 0? 15 M NaCl 和 15 mM 檸檬酸鹽緩沖液） 以及其使用其它緩沖液系統(tǒng)的等效物；甲酰胺濃度〇%、25%、50%和75% ;孵育時(shí)間5分鐘至 24小時(shí)，和持續(xù)時(shí)間增加、頻率增加或緩沖液濃度降低的洗滌。
[0039] 與另一個(gè)序列具有某一百分比（例如，80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%)的"序列 同一性"的多核苷酸或多核苷酸區(qū)（或多肽或多肽區(qū)）意指在比較兩個(gè)序列的過(guò)程中，當(dāng)對(duì) 準(zhǔn)時(shí)，該百分比的堿基（或氨基酸）是相同的。比對(duì)和百分比同源性或序列同一性可使用本 領(lǐng)域中已知的軟件程序來(lái)測(cè)定，例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等編，1987)增刊30,章節(jié)7. 7. 18,表7. 7. I中所描述的軟件程序。優(yōu)選地，使用缺省參數(shù) 進(jìn)行比對(duì)。優(yōu)選比對(duì)程序是BLAST，使用缺省參數(shù)。確切地說(shuō)，優(yōu)選程序是BLASTN和BLASTP， 使用以下缺省參數(shù)：遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾器=無(wú)；股=兩股；截止值=60 ;期望值=10 ;基 質(zhì)=BL0SUM62 ;描述=50個(gè)序列；排序方式=得分高低；數(shù)據(jù)庫(kù)=非冗余GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 翻譯 + SwissProtein + SPupdate + PIR。這些程序的細(xì)節(jié) 可見于以下互聯(lián)網(wǎng)地址：ncbi. nlm. nih. gov/cgi-bin/BLAST。
[0040] "同源性"或"同一性"或"相似性"是指兩個(gè)肽之間或兩個(gè)核酸分子之間的序列相 似性。同源性可以通過(guò)對(duì)可能出于比較目的而被對(duì)準(zhǔn)的各序列中的位置進(jìn)行比較來(lái)確定。 當(dāng)被比較的序列中的位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置處是同源的。序列 之間的同源性程度隨所述序列所共有的匹配位置或同源位置的數(shù)目而變化。舉例來(lái)說(shuō)，"非 相關(guān)"或"非同源"序列與本公開的序列之一共有小于40%的同一'丨生，或可選地小于25%的 同一I"生。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"級(jí)分"當(dāng)被用于蛋白質(zhì)分離的情形下時(shí)是指基于特定性質(zhì)分離的材料集合。 所述特定性質(zhì)可以包括（但不限于）尺寸、質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷等等。
[0042] "因子Xa"或"fXa"或"fXa蛋白"是指血液凝聚路徑中的絲氨酸蛋白酶，其是由 非活性因子X (fX)產(chǎn)生。因子Xa被因子IXa與其輔因子因子VIIIa的復(fù)合物（稱為內(nèi)在 Xase)或因子Vila與其輔因子組織因子的復(fù)合物（稱為外在Xase)激活。fXa與因子Va 形成膜結(jié)合凝血酶原酶復(fù)合物，并且是凝血酶原酶復(fù)合物中能催化凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶 的活性組分。凝血酶是能催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白的酶，其最終導(dǎo)致血液凝塊形成。
[0043] 如本文中所使用，"fXa衍生物"是指在組裝至凝血酶原酶復(fù)合物中的方面不與fXa 競(jìng)爭(zhēng)，但結(jié)合和/或基本上中和諸如fXa抑制劑等抗凝血?jiǎng)┑慕?jīng)過(guò)修飾的fXa蛋白。在一 些實(shí)施方案中，fXa衍生物具有降低的促凝血活性或不具有促凝血活性。fXa衍生物的一個(gè) 例子在本文中被提供為SEQ ID NO: 2 (圖2)或其生物等效形式。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"活性位點(diǎn)"是指酶或抗體中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的部分。"經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)"是 在結(jié)構(gòu)上經(jīng)過(guò)修飾以提供具有增加或降低的化學(xué)反應(yīng)性或特異性的活性位點(diǎn)的活性位點(diǎn)。 活性位點(diǎn)的例子包括但不限于人類因子X的包含235-488個(gè)氨基酸殘基的催化域和人類因 子Xa的包含fXa的195-448個(gè)氨基酸殘基的催化域。經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)的例子包括但 不限于人類因子Xa的在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414或Arg424處具有至 少一個(gè)氨基酸取代的催化域。
[0045] 如上文所述，本發(fā)明的衍生物可具有經(jīng)過(guò)修飾的Gla域或被去除了整個(gè)Gla域。 fXa的Gla域是指野生型fXa蛋白的氨基酸殘基1-45。在一些實(shí)施方案中，所述衍生物完 全（1-45)或部分缺失Gla域（例如1-44、1-39或6-39)。
[0046] "r-解毒劑前體"是指由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物，其相對(duì)于人類野生型 fXa含有三個(gè)突變。第一個(gè)突變是缺失野生型fX蛋白在位置6-39處的Gla域。第二個(gè)突 變是用-RKR-置換活化肽序列氨基酸143-194。這就產(chǎn)生了連接輕鏈和重鏈的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)連接子。在分泌后，這個(gè)連接子在CHO中被裂解，產(chǎn)生裂解的雙鏈多肽。術(shù) 語(yǔ)"裂解的雙鏈多肽"是指SEQ ID NO: 2的多肽，或與SEQ ID NO: 2具有80%同一性、具 有兩條鏈并且通過(guò)二硫鍵連接在一起的多肽。N末端鏈由SEQ ID NO: 2的氨基酸1-105組 成，且C末端鏈由SEQ ID NO: 2的氨基酸106-359組成。任選地，LC鏈可含有所述連接子 的1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸殘基。這樣的附加殘基由不完全去除連接子多肽產(chǎn)生。第三個(gè) 突變是活性位點(diǎn)殘基S379突變成Ala殘基（氨基酸編號(hào)是基于分泌的人類fX序列）。這 個(gè)氨基酸取代分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1和2的氨基酸296和290。
[0047] 術(shù)語(yǔ)"r-解毒劑"可以是指去除所述連接子之前的多肽（SEQ ID NO: 1)或去除連 接子之后的多肽（SEQ ID NO: 2)。以全文引用的方式并入本文中的美國(guó)申請(qǐng)13/766, 652 描述了用于對(duì)單鏈r-解毒劑前體進(jìn)行改良型或增強(qiáng)型加工以使充當(dāng)針對(duì)fXa抑制劑的解 毒劑的雙鏈r-解毒劑蛋白裂解的方法和細(xì)胞。
[0048] "STI"或"大豆胰蛋白酶抑制劑"是指從大豆分離的胰蛋白酶抑制劑或其生物等效 物。胰蛋白酶抑制劑的大小為約20 kDa，并且能降低胰蛋白酶（一種蛋白水解酶）以及血漿 激肽釋放酶、因子Xa和纖溶酶活性。STI可購(gòu)自諸如Life Technologies (Grand Island, NY)等供應(yīng)商。STI的一個(gè)例子是得自于毛豆（大豆）的GenBank登錄號(hào)為NP_001238611 的KTI3 Kunitz胰蛋白酶抑制劑。
[0049] 術(shù)語(yǔ)"競(jìng)爭(zhēng)劑"是可通過(guò)破環(huán)STI與絲氨酸蛋白酶之間的電荷-電荷相互作用或 通過(guò)與STI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于絲氨酸蛋白酶來(lái)幫助從STI親和柱洗脫絲氨酸蛋白酶的分子。非限 制性例子包括苯甲脒、對(duì)氨基苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬 物類fXa抑制劑。
[0050] 術(shù)語(yǔ)"因子Xa抑制劑"或"因子Xa的抑制劑"是指能在體外和/或體內(nèi)直接或 間接地抑制凝血因子Xa催化凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的活性的化合物、肽、肽模擬物。已知 fXa抑制劑的例子包括但不限于磺達(dá)肝癸（fondaparinux)、艾卓肝素（idraparinux)、經(jīng)過(guò) 生物素標(biāo)記的艾卓肝素、依諾肝素（enoxaparin)、法安明（fragmin)、NAP-5、rNAPc2、組織 因子路徑抑制劑、DX_9065a (例如，如 Herbert, J.M.等，//7Aazmaco/ /-- 1996 276 (3) :1030-8 中所描述）、YM-60828 (例如，如Taniuchi, Y?等，VaewoW. 1998 79(3):543-8 中所描述）、YM-150 (例如，如 Eriksson, B.I?等，財(cái) oot/ 2005;106(11)， Abstract 1865 中所描述）、阿哌沙班（apixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)、^)-348292 (例如，如Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007 中所描述）、奧米沙班（otamixaban)、雷扎沙班（razaxaban) (DPC906)、BAY 59-7939 (例如，如 Turpie, A. G?等，7； ?你 ewost 2005，3 (11) :2479-86 中所 描述）、DU-176b (例如，如 Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9) :778-783 中所 描述）、LY517717 (例如，如 Agnelli, G?等，7； VaewoW. 2007 5(4):746-53 中所描述）、GSK913893、貝曲西班（betrixaban)(如下文所描述）以及其衍生物。低分子 量肝素（"LMWH"）也被視為因子Xa抑制劑。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"離液劑"意指能破壞諸如蛋白質(zhì)和核酸等大分子的結(jié)構(gòu)并且使其變性的物 質(zhì)。離液劑包括例如丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸鋰、氯化鎂、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫 脲和尿素。
[0052] 方法 本公開描述了用于對(duì)來(lái)自于含絲氨酸蛋白酶的樣品的呈活性形式的絲氨酸蛋白酶進(jìn) 行純化的方法。這些方法優(yōu)于常規(guī)的絲氨酸蛋白酶純化方法。此外,所述方法在對(duì)甚至經(jīng) 過(guò)修飾的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行純化時(shí)也是有效的，所述修飾，諸如與野生型fXa相比在r-解 毒劑中的那些修飾，能影響蛋白酶的結(jié)合和/或酶促活性。
[0053] 已經(jīng)證明，因子Xa和其它絲氨酸蛋白酶可使用苯甲脒-瓊脂糖親和色譜儀進(jìn)行純 化。初步測(cè)試（參見例如實(shí)施例1)指示，缺乏Gla域的某些fXa衍生物由于缺失Gla域而 對(duì)諸如Q-瓊脂糖等常規(guī)離子交換色譜儀具有低親和力。令人驚訝的是，r-解毒劑不能結(jié) 合于苯甲脒-瓊脂糖親和色譜儀，或其它類似的市售小配體親和色譜儀。本公開描述了使 用基于STI的親和色譜儀純化絲氨酸蛋白酶，和利用競(jìng)爭(zhēng)劑和任選地存在的鹽和清潔劑的 洗脫步驟。
[0054] 可以如先前所描述（例如在13/766, 652中）或利用本領(lǐng)域中已知的其它重組蛋 白質(zhì)產(chǎn)生方法來(lái)重組產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶。舉例來(lái)說(shuō)，可將蛋白質(zhì)克隆到DNA構(gòu)筑體（即質(zhì) 粒、病毒載體、粘粒、表達(dá)載體、噬菌粒、福斯質(zhì)粒和人工染色體，諸如細(xì)菌人工染色體、酵母 人工染色體和人類人工染色體）中，并且通過(guò)諸如基于化學(xué)的轉(zhuǎn)染（諸如磷酸鈣轉(zhuǎn)染和 多聚轉(zhuǎn)染）和非基于化學(xué)的轉(zhuǎn)染（諸如電穿孔、光學(xué)轉(zhuǎn)染和基因電轉(zhuǎn)移）等基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 引入合適的宿主細(xì)胞中。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，包括但不限于細(xì)菌 細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鼠類細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、綿羊細(xì)胞、猿細(xì) 胞和人類細(xì)胞。接著可通過(guò)諸如超聲處理或凍融等物理技術(shù)或通過(guò)使用諸如含有150 mM NaCl、1.0% IGEPAL? CA - 630、0.5% 脫氧膽酸鈉、0.1% SDS 和 50 mM Tris 的 RIPA 緩沖液 (Radi-免疫沉淀測(cè)定）（pH 8. 0)等清潔劑或溶解緩沖液，或通過(guò)物理分離（諸如離心或過(guò) 濾）來(lái)溶解細(xì)胞，以便從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中收集澄清培養(yǎng)液。然后可將所得可溶性蛋 白質(zhì)提取物用于本文中所描述的純化方法中。
[0055] 將蛋白質(zhì)提取物施加于基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和色譜儀。大豆胰 蛋白酶抑制劑是20 kDa蛋白質(zhì)，并且可以被固定在固體載體樹脂上以用于純化某些蛋白 質(zhì)。除了大豆胰蛋白酶抑制劑以外，還可以使用其它胰蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)，諸如從血清、 利馬豆、牛胰腺或卵類粘蛋白或其經(jīng)修飾形式中分離的那些胰蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)。還預(yù) 期某些蛋白酶抑制劑，確切地說(shuō)是絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以用于制備親和樹脂，以便純化 r_解毒劑、絲氨酸蛋白酶或其它因子Xa衍生物?？梢岳帽疚闹兴_的方法從這些蛋白 酶抑制劑中鑒別出合適的。
[0056] 然后可以用包含競(jìng)爭(zhēng)劑、鹽、清潔劑或離液劑的洗脫緩沖液來(lái)洗脫絲氨酸蛋白 酶。競(jìng)爭(zhēng)劑中斷STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用或通過(guò)與STI競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于絲氨酸蛋 白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。競(jìng)爭(zhēng)劑的非限制性例子包括苯甲脒、精氨酸、小分子fXa抑制劑、肽類fXa 抑制劑或肽模擬物類fXa抑制劑。直接因子Xa抑制劑包括NAP-5、rNAPc2、組織因子路 徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292、奧米 沙班、依杜沙班（edoxaban)、LY517717、GSK913893、雷扎沙班、貝曲西班或其藥學(xué)上可接 受的鹽以及其組合。肽類fXa抑制劑包括如Betz等，"Inhibition of Factor Xa by a Peptidyl-a-ketothiazole Involves Two Steps. Evidence for a Stabilizing Conformational Change"，Biochemistry (1999)，38，14582-14591 中所描述的三膚酮 噻唑和相應(yīng)的醛，該文獻(xiàn)出于所有目的以引用的方式并入。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，競(jìng)爭(zhēng)劑是精氨酸。用精氨酸洗脫是有利的，因?yàn)樗荊RAS ( - 般認(rèn)為是安全的）賦形劑，并且不需要從經(jīng)過(guò)純化的蛋白質(zhì)中去除。精氨酸的另一個(gè)益處 是它實(shí)際上提高了絲氨酸蛋白酶（例如，r-解毒劑）的溶解度，并且可以被用作最終制劑 中的賦形劑。
[0058] 洗脫緩沖液中所采用的精氨酸或競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度可為約250 mM至約1000 mM。在一 個(gè)實(shí)施方案中，洗脫緩沖液中的精氨酸或競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度為約500 mM。在其它實(shí)施方案中， 所述濃度為約250 mM、或約300 mM、或約350 mM、或約400 mM、或約450 mM、或約550 mM、 或約600 mM、或約650 mM、或約700 mM、或約750 mM、或約800 mM、或約850 mM、或約900 mM、或約I M。所述洗脫緩沖液任選地還包含鹽、清潔劑或離液劑?？捎糜诒疚闹兴_的 方法和試劑盒的洗脫緩沖液中的鹽包括氯化鈉、氯化銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、氯化鉀、氯化 鎂、氯化鈣、磷酸鈉、磷酸鈣、磷酸銨、磷酸鎂、磷酸鉀、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸 鈣等等?？捎糜诒疚闹兴_的方法和試劑盒的洗脫緩沖液中的清潔劑包括例如聚山梨醇 醋80、尿素、狐等等。
[0059] 本文中所描述的方法和試劑盒中的洗脫緩沖液的pH值是允許有效洗脫吸附在樹 脂上的絲氨酸蛋白酶蛋白而不造成絲氨酸蛋白酶失活和/或沉淀的pH值。某些fXa衍生 物，諸如r-解毒劑，在低pH值下會(huì)失活或沉淀。在某些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH值為 約4. 5至約10. 5。在另一個(gè)實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH值為約pH 5.0。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，洗脫緩沖液的pH值為約pH 7.4。可選地，洗脫緩沖液的pH值為至少約4. 5、約5. 5、 約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8. 0、約8. 5、約9、約9. 5或至少約10。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 洗脫緩沖液的pH值不高于約5. 5、約6、約6. 5、約7、約7. 5、約8. 0、約8. 5、約9、約9. 5、約 10或不高于約10. 5。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗脫緩沖液的pH值當(dāng)使用苯甲脒作為競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí) 為約7. 4且當(dāng)使用精氨酸作為競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)為pH 5. 0。
[0060] 在某些實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是fXa衍生物，舉例來(lái)說(shuō)，其為包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的多肽，或與SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或 99%序列同一性的多肽。在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: 1或2具有序列同一性的多肽 具有基本上與SEQ ID NO: 1或2相同的活性。由SEQ ID NO: 1表示的fXa衍生物相對(duì) 于fXa含有三個(gè)突變。第一個(gè)突變是缺失野生型蛋白質(zhì)中FX在位置6-39處的Gla域。第 二個(gè)突變用-RKR-置換活化肽序列143-194 aa。這就產(chǎn)生了連接輕鏈和重鏈的-RKRRKR- (SEQ ID NO: 3)連接子。在分泌后，這個(gè)連接子在CHO中被裂解，產(chǎn)生雙鏈fXa分子（SEQ ID NO: 2)。第三個(gè)突變是活性位點(diǎn)殘基S379突變成Ala殘基（基于分泌的人類fX氨基 酸序列）。這個(gè)氨基酸取代分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1和2的位置296和位置290處的氨基 酸。fXa衍生物在組裝至凝血酶原酶復(fù)合物中的方面不與fXa競(jìng)爭(zhēng)，而是結(jié)合和/或基本上 中和諸如fXa抑制劑等抗凝血?jiǎng)??？捎米鹘舛緞┑难苌锝?jīng)過(guò)修飾以減少或去除內(nèi)在促凝 血和抗凝血活性，同時(shí)保留結(jié)合抑制劑的能力。在結(jié)構(gòu)上，所述衍生物經(jīng)過(guò)修飾以便無(wú)促凝 血活性或降低促凝血活性。"促凝血活性"在本文中稱為藥劑引起血液凝固或形成凝塊的能 力。降低的促凝血活性意指促凝血活性與野生型fXa相比降低了至少約50%或約90%以上 或約95%以上。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基 酸序列與野生型因子Xa相比具有降低的促凝血活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列不組裝至凝血酶原酶復(fù)合物中。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在允許絲氨酸蛋白酶吸附至柱上的條件下將絲氨酸蛋白 酶添加（裝載）至柱上，并且可以用允許絲氨酸蛋白酶繼續(xù)吸附至柱上且污染流經(jīng)物中的 蛋白質(zhì)或分子的洗滌緩沖液對(duì)柱進(jìn)行洗滌。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌緩沖液可以包含鹽并 且處于中性pH值下。術(shù)語(yǔ)"中性pH值"意在指約6至約8的pH值。在某些實(shí)施方案中， 洗滌緩沖液包含約200至約500 mM處于中性pH值下的NaCl。在其它實(shí)施方案中，pH值為 約6或約7或約8。
[0062] 本文中所公開的方法還可以包括其它純化和色譜步驟，舉例來(lái)說(shuō)，諸如過(guò)濾、離子 交換色譜、混合模式樹脂、排阻色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、親和色譜法或等電點(diǎn)聚焦。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將含有所述多肽的溶液施加于離子交換柱。
[0063] 合適的陽(yáng)離子交換樹脂包括本領(lǐng)域中已知的多種材料，包括能夠在較寬pH值范 圍內(nèi)結(jié)合多肽的那些材料。舉例來(lái)說(shuō)，羧甲基化的、磺化的、瓊脂糖基的或聚合的聚苯乙烯/ 二乙烯基苯陽(yáng)離子交換基質(zhì)是特別優(yōu)選的。其它可用基質(zhì)材料包括但不限于纖維素基質(zhì)， 諸如纖維狀、微粒狀和珠粒狀基質(zhì)；右旋糖酐、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅和 聚醚基質(zhì)；和復(fù)合物。其它適合用于陽(yáng)離子交換色譜的材料在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍 內(nèi)。
[0064] 陰離子交換色譜是使用如本領(lǐng)域中已知的對(duì)其適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)來(lái)進(jìn)行。合適的介質(zhì) 包括例如聚合的聚苯乙烯/二乙烯基苯樹脂和瓊脂糖基的樹脂，以及瓊脂糖珠粒、右旋糖 酐珠粒、聚苯乙烯珠粒、包含經(jīng)衍生化而具有叔氨基或季氨基的不溶性顆粒狀載體和經(jīng) 衍生化而具有三甲基氨基乙基的載體的介質(zhì)。合適的這樣的介質(zhì)的例子包括DE92 (二 乙基氛基乙基纖維素，Whatman) ;DEAE 纖維素（Sigma)、BAKERB0ND ABX 40 mu (J. T. Baker, Inc.) ;DEAE 樹脂，諸如 FRACTOGEL EMD DEAE-650 (EM Separations)、FRACT0GEL EMDTMAE-650 (S)TM (EM Science， Gibbstown，NJ)、 TSK 凝膠 DEAE-SPW (Tosohaas)、 DEAE-SEPHAROSE CL-6BT" 和螯合 SEPHAROSE (Amersham Pharmacia Biotech AB)、DEAE MERE SEP. I000TM ( Millipore)和 DEAE SPHERODEX (S印racor) !RESOURCE QTm 和 Q SEPHAROSE (QSFF) (Amersham Pharmacia Biotech AB) ；MACR〇-PEP QTM (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA) ；Q-HYPERD (BioSepra, Inc. ,Marlborough,Mass);等等。其 它合適的陰離子交換色譜材料以及用于本申請(qǐng)的這些材料的選擇和使用在本領(lǐng)域中是常 規(guī)的。
[0065] 可以在STI親和色譜法之前或之后進(jìn)行離子交換色譜、過(guò)濾、納米過(guò)濾或附加純 化步驟。附加步驟還可以包括通過(guò)例如對(duì)蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行溶劑和清潔劑處理或通過(guò)納米 過(guò)濾進(jìn)行病毒滅活步驟。
[0066] 一般來(lái)說(shuō)，"純化"是指增加蛋白質(zhì)或肽在樣品中的濃度和/或純度。在一些實(shí)施 方案中，純化過(guò)程對(duì)樣品進(jìn)行分餾以去除各種其它組分，在此期間蛋白質(zhì)或肽基本上保持 其生物活性。組合物中經(jīng)過(guò)充分純化的蛋白質(zhì)或肽形成了該組合物的主要組分，諸如構(gòu)成 樣品溶液的干組分中的蛋白質(zhì)的至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約 90%、至少約95%或以上。
[0067] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開將會(huì)獲知用于對(duì)蛋白質(zhì)或肽的純化程度進(jìn)行定量的 各種方法。這些方法包括例如測(cè)定活性級(jí)分的比活性或通過(guò)SDS/PAGE分析來(lái)估計(jì)級(jí)分內(nèi) 的多肽的量。用于估計(jì)級(jí)分的純度的一種優(yōu)選方法是計(jì)算該級(jí)分的比活性，將它與初步提 取物的比活性相比較并且由此計(jì)算純度程度，在本文中通過(guò)"純化倍數(shù)"來(lái)估計(jì)。用于表示 活性的量的實(shí)際單位當(dāng)然將取決于用于追蹤純化和所表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽是否展現(xiàn)可檢測(cè) 活性的所選特定測(cè)定技術(shù)。
[0068] 適用于蛋白質(zhì)純化的各種技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將為熟知的。這些技術(shù)包括例 如與硫酸銨、PEG (聚乙二醇）、抗體等等一起沉淀或利用熱變性，隨后離心；色譜步驟，諸 如離子交換、凝膠過(guò)濾、逆相、羥基磷灰石和親和色譜；等電點(diǎn)聚焦；凝膠電泳；和這些與其 它技術(shù)的組合。
[0069] 本文中所公開的另一個(gè)方面涉及一種經(jīng)過(guò)純化的絲氨酸蛋白酶，其包含SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1或2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、 至少約95%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列同一性的多肽，其中所述多肽是通過(guò) 本文中所描述的方法產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: 1或2具有序列同一'丨生的多 肽具有基本上與SEQ ID NO: 1或2相同的活性。
[0070] 本申請(qǐng)還描述了一種試劑盒，其包含大豆胰蛋白酶抑制劑親和樹脂；包含競(jìng)爭(zhēng)劑 和/或精氨酸的洗脫緩沖液；和使用說(shuō)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含洗滌緩沖 液。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液包含約250 mM處于中性pH值下的NaCl。
[0071] 實(shí)驗(yàn)實(shí)施例 參考以下實(shí)施例進(jìn)一步了解本公開，所述實(shí)施例意在單純地例示本公開。本公開在范 圍方面不受所例示的實(shí)施方案限制，所述實(shí)施方案僅意在說(shuō)明本公開的單一方面。功能上 等效的任何方法都在本公開的范圍之內(nèi)。根據(jù)以上描述和附圖，除了本文中所描述以外對(duì) 本公開的各種修改將變得為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見。所述修改屬于所附權(quán)利要求書的 范圍內(nèi)。
[0072] 除非另有說(shuō)明，否則所有溫度都是以攝氏度表示。還有，在這些實(shí)施例和其它部分 中，縮寫具有以下含義：
【權(quán)利要求】
1. 一種純化絲氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括： 將所述絲氨酸蛋白酶裝載到基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和 利用包含能破壞所述STI與所述絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的試劑的洗脫緩沖液 來(lái)洗脫所述絲氨酸蛋白酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述洗脫緩沖液還包含鹽、清潔劑和/或離液劑。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述藥劑是能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合所述絲氨酸蛋白酶 的STI的競(jìng)爭(zhēng)劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述競(jìng)爭(zhēng)劑選自苯甲脒、對(duì)氨基苯甲脒、精氨酸、小 分子fXa抑制劑、肽類fXa抑制劑和肽模擬物類fXa抑制劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述競(jìng)爭(zhēng)劑是精氨酸。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶是包含SEQIDNO: 1或2的氨 基酸序列的多肽，或與SEQIDNO: 1或2具有至少約80%序列同一性、缺失至少一部分Gla 域且在活性位點(diǎn)上具有突變的多肽。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列，或與SEQIDNO: 2具有至少約95%序列同一性、缺失至少一部分Gla域且在活性位點(diǎn) 上具有突變的多肽。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述絲氨酸蛋白酶包含SEQIDNO: 2的氨基酸序 列。
9. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約 10. 5。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約5. 0。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約7. 4。
12. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約250mM精氨酸至約1000mM 精氨酸。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述洗脫緩沖液包含約500mM精氨酸。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約5. 0。
15. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括利用離子交換柱對(duì)所述經(jīng)過(guò)洗 脫的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行純化。
16. 如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括在洗脫所述絲氨酸蛋白酶之前， 用包含鹽且處于中性pH值下的洗滌緩沖液來(lái)洗滌所述色譜儀。
17. -種經(jīng)過(guò)純化的絲氨酸蛋白酶，其是由如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法制 備。
18. -種試劑盒，其包括： 基于大豆胰蛋白酶抑制劑（STI)的親和力色譜儀，和 包含能破壞所述STI與絲氨酸蛋白酶之間的相互作用的競(jìng)爭(zhēng)劑的洗脫緩沖液。
19. 如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液還包含精氨酸。
20. 如權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液的pH值為約4. 5至約10. 5。
21. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中所述洗脫緩沖液包含約250mM精氨酸至約1000 mM精氨酸。
22.如權(quán)利要求18至21中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包含洗滌緩沖液，所述洗滌緩沖 液包含處于中性pH值下的約250mMNaCl。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK104379594SQ201380033420
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】盧根民, 烏馬·辛哈 申請(qǐng)人:博爾托拉制藥公司