專利名稱：重組制備的人類因子viii和ix的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組制備的具有類人糖基化模式(pattern)的人類因子VIII和/或 因子IX糖蛋白。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物界和植物界以及微生物界中有豐富的糖蛋白。糖蛋白中的糖部分已經(jīng)顯示 出具有多種功能，如就細(xì)胞與細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞發(fā)信號(hào)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保護(hù)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定 和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用而言具有重要作用。大多數(shù)糖蛋白的糖鏈通過(guò)與天冬酰胺殘基 的游離氨基鍵合的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc) (N-連接的糖)或通過(guò)與絲氨酸或蘇氨酸殘 基的羥基鍵合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) (0-連接的糖)與蛋白質(zhì)連接。在每個(gè)位置上 的糖部分通常由若干個(gè)形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的單糖單元構(gòu)成。大多數(shù)糖蛋白在一個(gè)分子中含有若 干不同的糖鏈。天冬酰胺連接的糖的結(jié)構(gòu)具有三種類型，高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型。所 有這些類型具有共同的五糖核心，Man α 1-6 (Man α 1-3)Man β 1_4G1cNAc3 l_4GlcNAc。在高 甘露糖型結(jié)構(gòu)中，其他甘露糖單元與這一核心連接，在復(fù)合型結(jié)構(gòu)中，通常發(fā)現(xiàn)巖藻糖、半 乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸。可能從共同核心伸出兩個(gè)或多個(gè)單糖單元的觸角。雜合 型糖鏈含有高甘露糖型和復(fù)合型二者的觸角。血友病是一組遺傳性遺傳病癥，其降低人體控制血液凝結(jié)或凝固的能力。在其最 普通的形式血友病A中，凝血因子VIII是缺乏的。在血友病B中，因子IX是缺乏的。血友 病A在每5，000-10, 000個(gè)男嬰中出現(xiàn)約1例，而血友病B在約20，000-34, 000個(gè)中出現(xiàn)約 1例。在血液凝固中因子VIII蛋白質(zhì)是重要的協(xié)同因子，其中因子DCa將因子X(jué)轉(zhuǎn)變?yōu)槠?激活的形式?？梢苑謩e使用因子VIII和因子IX的血漿源性濃縮物或使用重組制備的因子 VIII和因子IX來(lái)治療因子VIII和因子IX的缺乏。使用因子VIII或因子IX濃縮物的治 療已經(jīng)使血友病患者過(guò)上正常生活。然而，一定百分率的血友病A患者產(chǎn)生抗輸入的因子 VIII產(chǎn)品的抑制抗體，造成治療效果受損。近年來(lái)，產(chǎn)生于倉(cāng)鼠細(xì)胞系的重組產(chǎn)品變得更為 常用。然而，一些報(bào)道可能暗示這些產(chǎn)品導(dǎo)致比血漿源性產(chǎn)品更高的抑制因子形成發(fā)生率 (Ettingshausen 禾口 Kreuz，2006 ；Hay,2006)。因子VIII的新生形式是約300kDa的單鏈，所述單鏈由描述為A1-A2-B-A3-C1-C2 的結(jié)構(gòu)域組成(Gitschier 等，1984 ；Toole 等，1984 ；Vehar 等，1984 ；Wood 等，1984)。在 分泌到血液中之前蛋白質(zhì)經(jīng)歷處理，產(chǎn)生由A1-A2結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域的主要部分組成的約 200kDa的重鏈和由A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域組成的80kDa的輕鏈(在此稱為全長(zhǎng)因子VIII)。已 經(jīng)證明B結(jié)構(gòu)域?qū)σ蜃覸III的凝固活性而言是非必要的(Andersson等，1986 ；Brinkhous 等，1985 ；Pittman等，1993)。因此，有可能在治療血友病A的治療用途中使用B結(jié)構(gòu)域剔 除的因子 VIII (Courter 和 Bedrosian，2001)。在血液循環(huán)中完整的因子VIII以與高分子量蛋白質(zhì)馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor, vffF)的緊復(fù)合體存在。vWF不是酶并因此不具有催化活性。其主要功 能是結(jié)合其他蛋白質(zhì)特別是因子VIII，并且其對(duì)于與傷口部位的血小板附著是重要的。vWF是由多種單體組成的總分子量最多20，OOOkDa的大蛋白質(zhì)。作為在血液循環(huán)中因子VIII 的載體蛋白質(zhì)，vWF保護(hù)其不發(fā)生蛋白質(zhì)水解降解并因此提高因子VIII的體內(nèi)留存。此外， 已經(jīng)建議vWF與因子VIII的結(jié)合具有防止免疫系統(tǒng)識(shí)別因子VIII的保護(hù)作用并由此導(dǎo)致 發(fā)展抗因子VIII抑制抗體的降低的風(fēng)險(xiǎn)(Gensana等，2001 ；Kallas和Talps印，2001)。全長(zhǎng)因子VIII是具有25個(gè)N-鏈接糖基化潛在位點(diǎn)的高度糖基化蛋白質(zhì)，所述潛 在位點(diǎn)中的大部分位于B結(jié)構(gòu)域中。這些位點(diǎn)中僅有6個(gè)位于A和C結(jié)構(gòu)域內(nèi)。此前公布 的數(shù)據(jù)表明在因子VIII A和C結(jié)構(gòu)域中的潛在位點(diǎn)中的4個(gè)是被糖基化的。這些位點(diǎn)是重 鏈中的 Asn 41 和 Asn 239 以及輕鏈中的 Asn 1810和 Asn 2118 (Lenting等，1998 ;Sandberg 等，2001)。在全長(zhǎng)重組因子VIII中發(fā)現(xiàn)13個(gè)0-鏈接糖基化位點(diǎn)，它們中的大部分位于B 結(jié)構(gòu)域中(Lenting等，1998)。據(jù)報(bào)道，B結(jié)構(gòu)域剔除的因子VIII，ReFacto 具有2個(gè)用 0-鏈接糖鏈取代的位點(diǎn)(Sandberg等，2001)。通常在鼠科細(xì)胞系中表達(dá)重組的人類蛋白質(zhì)。這意味著，雖然人類基因構(gòu)建已 經(jīng)被用于表達(dá)，但是蛋白質(zhì)具有鼠科糖基化模式。一個(gè)這樣的實(shí)例是抗原性糖基非支化 的Gala l-3Gal，其存在于從這些細(xì)胞系制備的重組蛋白質(zhì)中(Galili等，1985 ； Hokke等， 1995)。然而，這種糖基并不存在于自然人類糖蛋白中。另一個(gè)實(shí)例是存在多種類型唾液 酸的組合。已經(jīng)報(bào)道了源自鼠科細(xì)胞系的重組蛋白質(zhì)除了主要形式的唾液酸、N-乙酰神 經(jīng)氨酸(Neu5Ac)之外還含有一些百分含量的抗原性唾液酸、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc) (Hokke等，1990)。由于編碼酶CMP-N-乙?；窠?jīng)氨酸羥化酶的基因中的突變的原因， Neu5Gc通常不存在于自然人類蛋白質(zhì)中，而是存在于所有其他哺乳動(dòng)物糖蛋白中(Chou 等，2002)。然而，已經(jīng)報(bào)道了 Neu5Gc存在于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞如人類癌細(xì)胞中以及存在于人 類胚胎細(xì)胞中(Kawashima 等，1993 ；Marquina 等，1996 ；Tangvoranuntakul 等，2003)。已經(jīng)表明多數(shù)人類具有針對(duì)Gal α l-3Gal抗原決定部位和Neu5Gc的循環(huán)抗體。目前，用于治療用途的重組人類因子VIII產(chǎn)品全部源自鼠科細(xì)胞系，這意味著它 們具有鼠科糖基化模式。因此抗原性糖基，非支化的Gala l_3Gal可以存在于從這些細(xì)胞 系制備的因子VIII中(Hironaka等，1993)。然而，這種糖基不存在于血漿源性人類因子 VIII中。另一個(gè)實(shí)例是抗原性唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸存在于得自鼠科細(xì)胞系的因子 VIII 中?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開了在人類細(xì)胞系中制備重組因子VIII的方法。 US-A-2006/099685涉及一種在人類胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞中制備重組因子VIII蛋白質(zhì)的方法， 所述方法關(guān)注所述細(xì)胞表達(dá)至少一種腺病毒的ElA蛋白質(zhì)的重要性。據(jù)說(shuō)根據(jù)這一方法制 備的重組蛋白質(zhì)具有與分離的人類副本(counterpart)不同的人類糖基化模式。W0-A-2007/003582提供了一種在無(wú)血清和無(wú)蛋白質(zhì)條件下在人類細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染 和制備人類重組蛋白質(zhì)特別是血蛋白質(zhì)的方法，使用攜帶編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的基因的特殊 載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染所述人類重組蛋白質(zhì)。US-A-2003/0077752涉及具有人類因子VIII活性的糖基化蛋白質(zhì)。這種產(chǎn)品的 糖基化模式含有α，6)-鏈接的唾液酸和與核心β甘露糖鏈接的截開型N-乙酰葡萄糖胺。ΕΡ-Α-0774261公開了因子VIII和vWf的復(fù)合體以及它們的治療價(jià)值。B. Mei ^t Molecular Biotechnology Volume 34, 2006, 165-178 中；V. Picanco-Castro 等 ^t Genetics and Molecular Research 7(2) :314-325(2008) 中；Μ·-H.Rodriguez, British Journal of Haematology,127,568-575 ；G.-Ch.Gil, Glycobiology vol. 18 no. 7pp. 526-539 以及 W0-A-2008/092643 公開了重組因子 IX或因子 VIII在人類細(xì)胞系中的制備?？梢云谕褂镁哂腥祟愄腔Ｊ降闹亟M人類因子VIII產(chǎn)品和重組人類因子IX 產(chǎn)品從而在用于治療時(shí)將重組蛋白質(zhì)的免疫原性最小化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及具有類人糖基化模式的重組人類因子VIII或IX蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì) 沒(méi)有唾液酸、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或糖基Gal α -3GaL·與在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中制備的 相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)相比，這種蛋白質(zhì)還顯示與馮維勒布蘭德因子更好的結(jié)合。當(dāng)用于治療 時(shí)，人類糖基化模式可能具有對(duì)蛋白質(zhì)的有益影響，因?yàn)槠淇赡芨纳乒δ苄再|(zhì)和/或降低 免疫原性。本發(fā)明還涉及具有人類糖基化模式的重組人類因子VIII蛋白質(zhì)，其中與在非哺 乳動(dòng)物細(xì)胞系中制備的相應(yīng)的重組蛋白質(zhì)相比所述蛋白質(zhì)顯示與馮維勒布蘭德因子更好 的結(jié)合。通過(guò)以下說(shuō)明書和所附包括其全部?jī)?nèi)容的權(quán)利要求書，進(jìn)一步的實(shí)施方案是清楚 的。


圖1是示出1 IU FVIII :C/mL的三批次的人類細(xì)胞系rhFVIII和鼠科細(xì)胞系 rhFVIII X和鼠科細(xì)胞系rhFVIII Y穿過(guò)vWF表面兩分鐘注射的傳感圖的示意圖。所有注 射重復(fù)三次。為清楚起見，僅示出每種FVIII分子的一次注射。將所有響應(yīng)歸一化為在注 射終點(diǎn)具有最高響應(yīng)的FVIII分子的響應(yīng)。圖2是示出在注射1 IU/mL不同rhFVIII產(chǎn)品終止10秒之后用標(biāo)準(zhǔn)偏差歸一化的 響應(yīng)的示意圖。人類細(xì)胞系rhFVIII線條代表三個(gè)人類細(xì)胞系rhFVIII批次的平均響應(yīng)。 將所有響應(yīng)歸一化為在注射終止10秒之后具有最高響應(yīng)的FVIII分子的響應(yīng)。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的并 且不用于限定，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求書及其等同物來(lái)限定。必須注意，當(dāng)在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中使用時(shí)，除非上下文明確指出，否則 單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)對(duì)象。另外，術(shù)語(yǔ)“大約”用于表示在合適的情況下給定值的+/-2%的偏差，優(yōu)選為 +/-5 %，并且最優(yōu)選數(shù)值的+/-10 %。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“沒(méi)有”是指不具有具體特征或特性以及不具有 不可用標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法檢測(cè)的具體特征或特性，所述標(biāo)準(zhǔn)液相色譜法例如但不限于 HPAEC-PAD (使用脈沖電流檢測(cè)的高效陰離子交換色譜法)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“唾液酸”涉及9碳羧基化糖家族的任何成員。唾 液酸族最常見成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸O-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘 油-D-galactononulopyranos-l-onic acid) (2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-l-onic acid)(通?？s寫為 Neu5Ac、NeuAc 或 NANA)。所述族 的第二成員是N-羥乙?；?神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙?；涣u基 化。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“親和力”涉及某些原子或分子具有聚集或結(jié)合趨勢(shì)的 現(xiàn)象。例如，通常使用平衡解離常數(shù)(Kd)描述配體與蛋白質(zhì)之間的親和力，即配體與具體 蛋白質(zhì)結(jié)合的有多緊密。Kd具有摩爾單位(M)，其等于具體蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)一 半的配體濃度，即配體結(jié)合的蛋白質(zhì)的濃度等于沒(méi)有配體結(jié)合的蛋白質(zhì)的濃度時(shí)的配體濃 度。Kd越小配體結(jié)合的越緊密，或者配體與蛋白質(zhì)之間的親和力越高。例如，與具有微摩爾 (μΜ)的Kd的配體相比，具有納摩爾(HM)Kd的配體與具體蛋白質(zhì)結(jié)合的更緊密。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合能力，，涉及重組人類因子VIII能夠與馮維勒布 蘭德因子(vWF)結(jié)合的程度，即其涉及在具有與vWF結(jié)合能力的產(chǎn)品中因子VIII分子的數(shù) 量。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法評(píng)價(jià)結(jié)合能力。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“無(wú)限增殖化的人類細(xì)胞系”涉及不是直接從組織獲取 的初級(jí)細(xì)胞的人類細(xì)胞。具體而言，其涉及永久性建立的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)物給予 新鮮培養(yǎng)基和空間時(shí)會(huì)無(wú)限增殖，并因此已經(jīng)突破了海弗利克(Hayflick)極限(即在由于 端粒達(dá)到臨界長(zhǎng)度的原因而停止分裂之前細(xì)胞分裂的倍數(shù))。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種新型重組人類因子VIII和/或IX糖蛋白。本發(fā)明的重組制備的 因子VIII和/或IX蛋白質(zhì)在人類細(xì)胞系中制備，這意味著所述蛋白質(zhì)將具有類人糖基化 模式。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠預(yù)見人類因子VIII和/或IX顯示人類糖基化模式。然而，出乎意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重組制備的因子VIII和/或IX蛋白質(zhì)沒(méi)有抗原 性唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或抗原性糖基Gal α -3GaL·由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類癌細(xì)胞或 快速生長(zhǎng)的人類胎兒細(xì)胞表達(dá)N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，預(yù)計(jì)所述重組制備的因子VIII和/或 IX蛋白質(zhì)能夠具有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，因?yàn)樗鼈冊(cè)谌祟悷o(wú)限增殖化的胎兒細(xì)胞系中制備。 預(yù)計(jì)這一特征和/或缺少抗原性糖基Gal α -3Gal以及重組因子VIII和/或因子IX蛋白 質(zhì)的整個(gè)人類糖基化模式具有對(duì)產(chǎn)品有益的影響，因?yàn)槠浣档兔庖咴圆⑶疫€改善蛋白質(zhì) 的功能性質(zhì)。重組因子VIII的一個(gè)這種性質(zhì)是更好地與馮維勒布蘭德因子(vWF)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種具有人類糖基化模式并且沒(méi)有抗原性N-羥 乙酰神經(jīng)氨酸和/或Gal α l-3Gal的重組因子VIII和/或IX蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種沒(méi)有抗原性N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或 Gal α l-3Gal的重組因子VIII和/或IX蛋白質(zhì)，與在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如但不限于鼠 科細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和倉(cāng)鼠崽腎(BHK)細(xì)胞中制備的重組因子VIII蛋白質(zhì) 相比，所述蛋白質(zhì)顯示更好地與vWF結(jié)合。更好的結(jié)合涉及比在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制 備的重組因子VIII更高的與人類vWF親和力。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，與vWF的親和力比 在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備的重組因子VIII與vWF的親和力高至少大約10-60%，優(yōu)選 高大約 20%、30%、40%、50% 或 60%。親和力還可以通過(guò)平衡解離常數(shù)(Kd)來(lái)評(píng)價(jià)。因此，在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中， 重組蛋白質(zhì)與vWF之間的親和力具有比在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如但是不限于鼠科細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和倉(cāng)鼠崽腎(BHK)細(xì)胞中制備的因子VIII更低的KD。另外，與vWF更好地結(jié)合還涉及結(jié)合能力。因此，本發(fā)明還涉及一種重組制備的因 子VIII糖蛋白，其具有比在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如但是不限于鼠科細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵 巢(CHO)細(xì)胞和倉(cāng)鼠崽腎(BHK)細(xì)胞中制備的重組因子VIII更高的與VWF的結(jié)合能力。在 一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)在相同實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)時(shí)，與vWF的結(jié)合能力比在非人類哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中制備的重組因子VIII與vWF的結(jié)合能力高至少大約10-60%，優(yōu)選高大約20%、30%、 40%、50%或 60%。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的沒(méi)有抗原性唾液酸N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或抗 原性糖基Gala-3Gal的重組因子VIII蛋白質(zhì)是自然因子VIII的剔除衍生物，其部分或整 體缺少自然因子VIII的B結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，剔除的B結(jié)構(gòu)域被連接肽代替，所 述連接肽包括10至25個(gè)優(yōu)選14至20個(gè)氨基酸殘基。對(duì)于關(guān)于B結(jié)構(gòu)域剔除衍生物和連 接肽的更多細(xì)節(jié)，參見W0-A-01/70968和W0-A-2007/003582，本文包括它們的全部?jī)?nèi)容。因此，本發(fā)明涉及一種重組因子VIII糖蛋白，其具有類人糖基化模式并且具有比 在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如但是不限于鼠科細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和倉(cāng)鼠崽腎 (BHK)細(xì)胞中制備的重組因子VIII更好的與vWF的結(jié)合。與vWF更好的結(jié)合涉及如上定義 的與vWF的親和力和結(jié)合能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有類人糖基化模式和比在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備的重 組因子VIII更好的與人vWF的結(jié)合的重組蛋白質(zhì)是自然因子VIII的剔除衍生物，其部分 或整體缺少自然因子VIII的B結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，剔除的B結(jié)構(gòu)域被連接肽代替， 所述連接肽包括10至25個(gè)，優(yōu)選14至20個(gè)氨基酸殘基。對(duì)于關(guān)于B結(jié)構(gòu)域剔除衍生物 和連接肽的更多細(xì)節(jié)，參見W0-A-01/70968和W0-A-2007/003582，本文包括它們的全部?jī)?nèi) 容。如上定義的重組人類因子VIII和/或IX糖蛋白優(yōu)選在人類細(xì)胞系中制備，所述 人類細(xì)胞系優(yōu)選為無(wú)限增殖化的人類細(xì)胞系。這種細(xì)胞系的非限定性的實(shí)例為腎臟、膀胱、 肝臟、肺、心肌、平滑肌、卵巢、視網(wǎng)膜、神經(jīng)和胃腸細(xì)胞系。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在無(wú)限增殖化的人類胚胎腎細(xì)胞系(HEK)中制備本 發(fā)明的蛋白質(zhì)。這些細(xì)胞系的非限定性實(shí)例是HEK293(ATCC CRL-1573 ；DSM ACC 305 ； ECACC ref :85120602),HEK293T(ATCC CRL 11268 ；DSM ACC 2494)和 HEK293F(Invitrogen R79007)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述人類細(xì)胞系是HEK293Fanvitrogen R79007)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，與在非人類細(xì)胞系例如但是不限于鼠科細(xì)胞，如中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢(CHO)細(xì)胞和倉(cāng)鼠崽腎(BHK)細(xì)胞中制備的人重組因子VIII或IX蛋白質(zhì)相比，本發(fā) 明涉及具有更低免疫原性的如上所定義的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含與藥學(xué)可接受賦形劑混合的如上定義的本 發(fā)明的蛋白質(zhì)。所述藥物組合物包含治療有效劑量的重組因子VIII或IX蛋白質(zhì)。劑量和 治療期取決于因子VIII和/或因子IX缺失的嚴(yán)重程度、流血的位置和程度以及患者的臨 床病情。個(gè)體患者可以隨他們對(duì)因子VIII和因子IX的反應(yīng)而變化，實(shí)現(xiàn)不同水平的體內(nèi) 回收率和顯示不同的半衰期。所施用的劑量應(yīng)當(dāng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)患者的臨床反應(yīng)漸 漸增加。在抑制劑的存在下，可能要求更高的劑量或適當(dāng)?shù)奶厥庵委?。所施用的因子VIII 或因子IX的數(shù)量單位用國(guó)際單位(IU)表示，其與因子VIII或IX產(chǎn)品的當(dāng)前WHO標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。因子VIII在血漿中的活性表示為百分比(相對(duì)于正常人類血漿)或國(guó)際單位(相對(duì) 于血漿中因子VIII的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))。一個(gè)國(guó)際單位(IU)的因子VIII活性大約相當(dāng)于ImL正常人類血漿中因子VIII 活性的量。因子VIII的所需劑量的計(jì)算基于每kg體重的IIU因子VIII使血漿因子VIII 活性提高大約2IU/dL的經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)。在血友病A的治療中要施用的劑量和施用的頻率依賴于個(gè)體患者的臨床效果。通 常的預(yù)防劑量為每2-3天20-40IU/kg體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療與因子VIII和/或因子IX有關(guān)的病癥如血 友病A和血友病B的方法，其中如上定義的重組蛋白質(zhì)與藥學(xué)可接受賦形劑一起以治療可 接受量施用。藥學(xué)可接受賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明還涉及如上定義的重組蛋白質(zhì)在治療與因子VIII和/或因子IX有關(guān)的病 癥如血友病A和血友病B中的用途。根據(jù)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)可以通過(guò)本治療領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn) 方法例如但不限于注射和輸液，經(jīng)皮下或靜脈來(lái)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上定義的重組蛋白質(zhì)在制造用于治療與因子 VIII和/或因子IX有關(guān)的病癥如血友病A和血友病B的藥物中的用途。所述藥物可以通 過(guò)本治療領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法例如但不限于注射和輸液，經(jīng)皮下或靜脈來(lái)施用。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上定義的蛋白質(zhì)與馮維勒布蘭德因子之間的 復(fù)合體，其中所述蛋白質(zhì)是重組因子VIII。所述復(fù)合體具有本發(fā)明蛋白質(zhì)與VWF之間改善 的結(jié)合親和力，導(dǎo)致重組因子VIII在體內(nèi)延長(zhǎng)的存留。下面將在以下非限定性實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1根據(jù)EP-A-I 739 179 ( SchrSder等，2007b ； SchrSder等，2007a)中描述的方 法在人類細(xì)胞系HEK293F中制備人類B結(jié)構(gòu)域剔除的因子VIII蛋白質(zhì)，人類細(xì)胞系重組人 類因子VIII (人類細(xì)胞系rhFVIII)。提純方法由5個(gè)色譜步驟組成并產(chǎn)生高純因子VIII 蛋白質(zhì)(Winge 等，2008)。使用0. IM鹽酸將其中已經(jīng)加10 μ g尤羅索尼克酸(Ketodeoxynonulosonic acid) (KDN ；內(nèi)標(biāo))的提純的因子VIII蛋白質(zhì)GOO-eOOyg)的唾液酸酸水解(80°C下1小時(shí))。 使用Dowex陽(yáng)離子交換色譜提純產(chǎn)物，并將所得溶液凍干，重新混懸于水中并用HPAEC-PAD 分析。將含有Neu5Ac和NeuGc各5 μ g以及10 μ g KDN的標(biāo)準(zhǔn)混合物和具有10 μ gKDN的 試劑空白水解并與樣品平行分析。表1和表2表示人類細(xì)胞系rhFVIII的兩個(gè)樣品A和B的Neu5Ac和NeuGc的分 析結(jié)果。其表明檢測(cè)不到唾液酸類型NeuGc。僅發(fā)現(xiàn)Neu5Ac。從rhFVIII由酸釋放的N-乙酰基神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸 (NeuGc)的 HPAEC-PAD 定量
權(quán)利要求
1.一種具有類人糖基化模式的重組人類因子VIII或IX蛋白質(zhì)，但是所述蛋白質(zhì)沒(méi)有 N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或糖基Gal α -3GaL·
2.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是因子VIII并且是自然因子 VIII的剔除衍生物，所述剔除衍生物部分或整體缺少自然因子VIII的B結(jié)構(gòu)域。
3.如權(quán)利要求2所述的重組蛋白質(zhì)，其中部分或整體剔除的B結(jié)構(gòu)域被包括10至25 個(gè)，優(yōu)選14至20個(gè)氨基酸殘基的連接肽代替。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組因子VIII并 且與在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是鼠科細(xì)胞中制備的重組因子VIII相比具有更高的與馮 維勒布蘭德因子的親和力。
5.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組因子VIII并 且與在非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是鼠科細(xì)胞中制備的重組因子VIII相比具有更高的與馮 維勒布蘭德因子的結(jié)合能力。
6.如權(quán)利要求1所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組因子VIII并且與在非人類 哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是鼠科細(xì)胞中制備的重組因子VIII相比具有更高的與馮維勒布蘭德因 子的親和力。
7.如權(quán)利要求6所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是重組因子VIII并且與在非人類 哺乳動(dòng)物細(xì)胞特別是鼠科細(xì)胞中制備的重組因子VIII相比具有更高的與馮維勒布蘭德因 子的結(jié)合能力。
8.如權(quán)利要求6和/或7中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)是因子VIII并 且是自然因子VIII的剔除衍生物，所述剔除衍生物部分或整體缺少自然因子VIII的B結(jié) 構(gòu)域。
9.如權(quán)利要求8所述的重組蛋白質(zhì)，其中部分或整體剔除的B結(jié)構(gòu)域被包括10至25 個(gè)，優(yōu)選14至20個(gè)氨基酸殘基的連接肽代替。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，其中在人類細(xì)胞系特別是選自腎臟、 膀胱、肝臟、肺、心肌、平滑肌、卵巢、視網(wǎng)膜、神經(jīng)和胃腸細(xì)胞系的無(wú)限增殖化細(xì)胞系中制備 所述蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求10所述的重組蛋白質(zhì)，其中所述人類細(xì)胞系是人類胚胎腎細(xì)胞系 (HEK)，特別是選自 HEK 293 (ATCC CRL-1573 ；DSM ACC 305 ；ECACC ref :85120602)和 293F(Invitrogen R79007)的人類胚胎腎細(xì)胞系。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可以通過(guò)在選自HEK 293 (ATCC CRL-1573 ；DSM ACC 305 ；ECACC ref :85120602)和 293F (Invitrogen R79007)的 人類胚胎細(xì)胞系(HEK)中制備蛋白質(zhì)獲得。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的重組蛋白質(zhì)在治療與因子VIII和/或因子IX 有關(guān)的病癥中的用途。
14.包含治療有效量的如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)和藥學(xué)可接受賦形劑 的藥物組合物。
15.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的重組因子VIII與馮維勒布蘭德因子的復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有人類糖基化模式的重組人類因子VIII或IX蛋白質(zhì)，但是所述蛋白質(zhì)沒(méi)有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和/或糖基Galα-3Gal。
文檔編號(hào)C07K14/755GK102119172SQ200980131411
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月21日
發(fā)明者伊麗莎白·卡薩德蒙特, 卡羅拉·施羅德, 彼得·斯滕倫德, 海倫娜·桑德伯格, 馬亞·蒂邁爾 申請(qǐng)人:奧克塔法馬股份有限公司