專利名稱：重組生長(zhǎng)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組生長(zhǎng)因子及其合成方法，尤其涉及具有表皮生長(zhǎng)因子生物活性的重組分子。
各種多肽生長(zhǎng)因子已由不同的哺乳類動(dòng)物中分離得到，并且具有廣譜活性，其中表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(TGFα)已經(jīng)進(jìn)行了廣泛深入的研究。
表皮生長(zhǎng)因子涉及多種活性，包括促進(jìn)腸子成熟，從而刺激幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)，以及傷口的愈合。
Moore及其同事們(1982a，b;1983)業(yè)已發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子是一種非常有希望的脫羊毛劑。
羊注射鼠表皮生長(zhǎng)因子(mEGF)后，可使羊毛纖維變得很松軟，因此很容易迅速地手工去除全部羊毛(Moore等，1983)。采用這種方法可以期望避免傳統(tǒng)的剪羊毛方法中所需昂貴的勞務(wù)費(fèi)用和傷害羊的危險(xiǎn)。但是從老鼠涎腺中純化得到的表皮生長(zhǎng)因子的量非常有限，費(fèi)用也過(guò)高。
后來(lái)在大腸桿菌中通過(guò)重組手段產(chǎn)生鼠表皮生長(zhǎng)因子的方法的成功，促進(jìn)了在羊體內(nèi)進(jìn)行大量的研究(Allen等，1985;1987)。
這種制備重組鼠表皮生長(zhǎng)因子的方法受到許多限制。首先，為了得到穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物的高水平的表達(dá)，需要將鼠表皮生長(zhǎng)因子制備成一部分大的融合蛋白，由于該產(chǎn)物僅約含15%的鼠表皮生長(zhǎng)因子，其余均為非表皮生長(zhǎng)因子載體蛋白。因此，需要表達(dá)非鼠表皮生長(zhǎng)因子部分減少的融合蛋白。在控制tac啟動(dòng)子-操縱子和具有TrpE核糖體結(jié)合位點(diǎn)的條件下，制備Met表皮生長(zhǎng)因子和超過(guò)表皮生長(zhǎng)因子6或7個(gè)N端的結(jié)構(gòu)，但是檢測(cè)不到表達(dá)，這是由于宿主細(xì)菌中蛋白質(zhì)迅速分解的緣故(Allen，私人通訊)。其次，融合蛋白必須用特殊的酶或化學(xué)方法予以裂解。盡管作了種種認(rèn)真的努力，將對(duì)各種裂解劑敏感的順序結(jié)合到鄰近表皮生長(zhǎng)因子的順序(Allen，私人通訊)，這項(xiàng)足夠有效和專門的技術(shù)是使用賴氨酸特異蛋白酶，但也不能在化學(xué)上改變鼠表皮生長(zhǎng)因子本身，這證明非常不易，而且酶也不能得到可靠的供給。
業(yè)已證明，TrpE-表皮生長(zhǎng)因子的融合失去了生物活性(參閱本說(shuō)明書表3)，這說(shuō)明融合蛋白需要裂解。已經(jīng)發(fā)表的工作證明，相關(guān)的生長(zhǎng)因子TGFα是在體內(nèi)產(chǎn)生的，這是一種大的前體分子。其大小約為TGFα1的3倍。然而TGFα生物活性僅為游離生長(zhǎng)因子活性的1-2%。這說(shuō)明類似大融合可能也相對(duì)失去生物活性(Brachmann等，1989)。
就脫羊毛方法而言，采用該方法生產(chǎn)重組的或質(zhì)粒衍生的鼠表皮生長(zhǎng)因子(rec-mEGF)的費(fèi)用遠(yuǎn)高于開(kāi)發(fā)市場(chǎng)商品所容許的費(fèi)用。其他許多研究工作者也已研究了生產(chǎn)重組體表皮生長(zhǎng)因子的方法(例如Oka等，1985;Smith等，1982;Urdea等，1983;Sumi等，1985)。然而這些方法的費(fèi)用也都很高，一般說(shuō)來(lái)適宜于生產(chǎn)每單位表皮生長(zhǎng)因子的價(jià)格可以顯著高于脫羊毛用的表皮生長(zhǎng)因子的那些產(chǎn)品。
已知上述的一個(gè)例外是日本專利6240924，其要求保護(hù)高水平的表達(dá)，但是在明顯相似內(nèi)容的文獻(xiàn)中(Oka等1985)，卻報(bào)導(dǎo)了低水平的表達(dá)。因此，看來(lái)該專利的方法可能僅僅取得部分的成功。
表皮生長(zhǎng)因子的應(yīng)用并不限于脫除上述的綿羊毛，也可應(yīng)用于其他動(dòng)物的脫毛，例如可用于收獲山羊和兔子的毛，駱駝科動(dòng)物的毛(如羊駝，無(wú)峰駝或駱馬)，以及在屠宰前去除牛、鹿和豬的鬃毛或其他皮毛。
將表皮生長(zhǎng)因子由母體的奶中轉(zhuǎn)移到幼齡哺乳動(dòng)物，能起到促進(jìn)腸子生理成熟的作用。對(duì)幼齡動(dòng)物施用表皮生長(zhǎng)因子可以加速其成熟，因此可以加速小豬和其他動(dòng)物的早期生長(zhǎng)和提早斷奶。在醫(yī)學(xué)上，人表皮生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)胃潰瘍的愈合，還可用于皮膚和眼睛的傷口愈合。在動(dòng)物治療方面，也可進(jìn)行類似的施用，例如為了避免羊兩腿間綠繩叮咬而切除過(guò)份松馳的皮膚后，可以加速由此引起的傷口的愈合，尤其是馬或狗的潰瘍和傷口的愈合。生長(zhǎng)因子還可用于細(xì)胞和組織的合成或半合成培養(yǎng)基中，尤其用于含有少量血清或不含血清的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明提供的分子涉及表皮生長(zhǎng)因子，但結(jié)構(gòu)上與其不同，基本上具有類似的生物活性，但易于低成本大規(guī)模地進(jìn)行生產(chǎn)。這些特征使這類分子特別適用于某些動(dòng)物的治療，可以廣泛使用，但單位成本很低。此外，本發(fā)明還提供克服以往已知合成方法中存在的問(wèn)題的方法，而又能連續(xù)在重組宿主細(xì)胞中大量產(chǎn)生。
雖然本發(fā)明著重介紹表皮生長(zhǎng)因子，但是表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)之間順序的同源性說(shuō)明，本發(fā)明還可應(yīng)用于TGF，應(yīng)理解為這也屬于本發(fā)明的范圍。
出乎意料的是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子能以銜接重復(fù)分子產(chǎn)生，而且該產(chǎn)物具有生物活性，不需要裂解融合蛋白或釋放天然表皮生長(zhǎng)因子。此外，該產(chǎn)物還能在大腸桿菌中以包涵體產(chǎn)生。
本發(fā)明的任務(wù)之一，在于提供重組DNA分子，其順序能編碼具有動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白(生長(zhǎng)因子順序)，所述動(dòng)物生長(zhǎng)因子選自表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFα)，所述重組DNA包括主要順序和至少一個(gè)編碼生長(zhǎng)因子的順序。
TGFα在結(jié)構(gòu)和功能上與EGF相似，與EGF一樣，TGFα具有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(Marguardt et al，1983 & 1984;Massague，1983a;Smith et al.，1985;Lee et al.，1985)。通過(guò)若干離體分析，說(shuō)明TGFα在功能上與EGF可以互相取代(Pike et al.，1983;Massague，1983b;Derynck et al.，1984;Tam et al.，1984)。在本文中術(shù)語(yǔ)TGF也應(yīng)被視為TGFα。
當(dāng)編碼生長(zhǎng)因子的順序多于一個(gè)時(shí)，這些順序相互連接。生長(zhǎng)因子最好源于哺乳動(dòng)物，尤以源于羊、鼠、人或豬為佳。
編碼生長(zhǎng)因子順序的適宜數(shù)目為1-30個(gè)，1-10個(gè)較好，1-5個(gè)更好，尤以1-2個(gè)為最佳。
主要順序可由各種來(lái)源得到，例如可源于質(zhì)?；蚱渌袡C(jī)體，也可進(jìn)行合成。主要順序的適宜長(zhǎng)度為1-50個(gè)氨基酸，12-50個(gè)氨基酸較好，15-30個(gè)氨基更好，尤以21個(gè)氨基酸為最佳。
本申請(qǐng)說(shuō)明書中所述“生長(zhǎng)因子順序”意指編碼具有鼠、其他哺乳動(dòng)物或鳥類生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白的DNA順序，該順序可以是天然的，也可以是合成的。生長(zhǎng)因子應(yīng)理解為包括等位的、突變的、減短的、延長(zhǎng)的或其他各種形式。采用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法都可得到各類形式的生長(zhǎng)因子，例如采用位點(diǎn)誘變劑，限制酶，連接酶，寡核苷酸合成方法。例見(jiàn)Maniatis等編著的一書(1982)。
本發(fā)明的任務(wù)之二，在于提供含有上述重組DNA分子的質(zhì)粒。質(zhì)粒尤以下面將要詳述的pCW9-RI為佳。
本發(fā)明的任務(wù)之三，在于提供由含上述重組DNA分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，但以細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞較好，大腸桿菌則更好，出乎意料的最佳宿主細(xì)胞為lac Ⅰσ-(-)株的大腸桿菌，例如BL21，HB101和N5151。業(yè)已證明，某些菌株是不適宜的，例如SG936，DH5。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能很容易通過(guò)常規(guī)的篩選方法確定適宜的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的任務(wù)之四，在于提供合成具有選自EGF和TGF的動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白的方法，包括將含有上述重組DNA的微生物或細(xì)胞系培養(yǎng)在可同化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中，分離由微生物或細(xì)胞系產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，以及回收具有活性的生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的任務(wù)之五，在于提供上述質(zhì)粒的合成方法，該方法包括下列步驟(a)用核酸內(nèi)切限制酶裂解含編碼具有選自EGF和TGFα動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性蛋白的順序的DNA順序(生長(zhǎng)因子順序)，切斷所述的生長(zhǎng)因子順序;
(b)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶裂解表達(dá)質(zhì)粒;
(c)用DNA連接酶將至少一個(gè)生長(zhǎng)因子順序插入已裂解的表達(dá)質(zhì)粒;
(d)回收重組質(zhì)粒。
步驟(a)中的DNA順序最好是一種質(zhì)粒，尤以pEGF3為最佳。
較好的方法包括下列步驟(a)用核酸內(nèi)切限制酶消化含編碼EGF或TGFα的DNA順序的質(zhì)粒，切斷編碼EGF或TGFα的順序或其生物活性片段;
(b)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶消化表達(dá)質(zhì)粒;
(c)純化步驟(a)和(b)的產(chǎn)物;
(d)將所述產(chǎn)物混合和連接;
(e)用連接的混合物轉(zhuǎn)化微生物;
(f)鑒定編碼EGF或TGFα順序是否正確位置上的轉(zhuǎn)化株;
(g)用核酸內(nèi)切限制酶消化含編碼EGF或TGFα的DNA順序的質(zhì)粒，切斷編碼EGF或TGFα順序或其生物活性片段;
(h)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶消化步驟(d)的產(chǎn)物;
(i)將步驟(g)和(h)的產(chǎn)物混合，通過(guò)N端和/或C端上短外順序的兩側(cè)連接形成編碼一個(gè)或多個(gè)EGF或TGFα的銜接拷貝或其生物活性片段;
(j)回收由此形成的質(zhì)粒。
最好步驟(a)中的質(zhì)粒是pEGF3，步驟(b)中的質(zhì)粒是pUC19，步驟(a)和(b)的產(chǎn)物在步驟(d)中用DNA連接酶連接，步驟(c)中的微生物是大腸桿菌，步驟(g)中的質(zhì)粒是pWRL525。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，質(zhì)粒合成方法包括下列步驟(a)將質(zhì)粒pEGF3用核酸內(nèi)切限制酶消化，切斷EGF編碼片段;
(b)將質(zhì)粒pUC19用同樣的核酸內(nèi)切限制酶消化;
(c)純化所述EGF編碼片段和經(jīng)過(guò)消化的5′-磷酸鹽裂解的pUC19;
(d)混合經(jīng)純化的產(chǎn)物，并將其用DNA連接酶連接;
(e)用連接的混合物轉(zhuǎn)化宿主微生物;
(f)鑒定具有EGF片段的重組質(zhì)粒是否在正確的位置上(pUC19-EGF);
(g)將質(zhì)粒pWRL525用核酸內(nèi)切限制酶消化，并純化由此產(chǎn)生的EGF片段;
(h)將pUC19-EGF用與步驟(g)相同的核酸內(nèi)切限制酶消化，并純化由此產(chǎn)生的片段;
(i)混合EGF片段和pUC19-EGF，并用T4 DNA連接酶連接，產(chǎn)生質(zhì)粒PCW9;
(j)回收質(zhì)粒pCW9。
步驟(a)和(b)中的核酸內(nèi)切限制酶最好是EcoRⅠ。
步驟(g)和(h)中的核酸內(nèi)切限制酶最好是BstEⅡ。
步驟(b)中的消化也可以用堿性磷酸酶處理，防止再連接。
本發(fā)明的任務(wù)之六，在于提供去除動(dòng)物體上的皮毛，該方法的步驟包括給所述動(dòng)物施用有效量的新的上述去毛重組EGF或由其所產(chǎn)生的EGF。
為了方便起見(jiàn)，下面將著重介紹鼠表皮生長(zhǎng)因子(mEGF)，但是應(yīng)明確地理解為本發(fā)明同樣也適用于其他EGF和TGFα。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，所產(chǎn)生的mEGF是一種銜接二聚體，其中在2個(gè)mEGF順序之前是1個(gè)由細(xì)菌質(zhì)粒DNA編碼的氨基酸短順序。與由許多其他短融合蛋白所得結(jié)果相反，該產(chǎn)物是在大腸桿菌中有效地產(chǎn)生的，并且非常穩(wěn)定。此外，其主要是由mEGF順序組成，因而極少產(chǎn)物被廢棄。出乎意料的是如同mEGF一樣，該產(chǎn)物幾乎在分子對(duì)分子的水平上具有生物活性，使被融合的二聚體mEGF的裂解不需要釋放天然的mEGF。應(yīng)該注意的是含EGF的常規(guī)融合蛋白并無(wú)生物活性。在生物測(cè)定中，已經(jīng)證明TrpE-EGF和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-EGF沒(méi)有活性(分別參閱表3和6)。最后，還發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物在細(xì)菌細(xì)胞中幾乎是不溶解的包涵體。這就可以有效地收集和在早期進(jìn)行純化。
mEGF銜接二聚體即以上所述的“蛋白-pCW9”的發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。為了生產(chǎn)非融合mEGF、其他的含mEGF的短融合多肽和含mEGF多重銜接拷貝的長(zhǎng)融合蛋白，進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)，在不同產(chǎn)物之間，大腸桿菌中的表達(dá)水平差別很大，但任何一種方法都不涉及分子量或mEGF拷貝數(shù)。根據(jù)與低分子量相一致的高水平表達(dá)，選擇了較佳產(chǎn)物“蛋白pCW9”，而且無(wú)需進(jìn)行任何裂解但卻具有生物活性。
現(xiàn)就參考下述非限制性實(shí)施例和


本發(fā)明，

如下圖1 表示由pWRL525和pEGF3構(gòu)建質(zhì)粒pCW9-RI;
圖2 說(shuō)明用于pWRL525起始原料的質(zhì)粒pWRL500的結(jié)構(gòu);
圖3 表示質(zhì)粒pWRL525的構(gòu)建;
圖4 表示質(zhì)粒pET3b-1和pET3b-2的構(gòu)建;
實(shí)施例1由質(zhì)粒pEGF3和pWRL525制備質(zhì)粒pCW9起始遺傳物質(zhì)是由Wellcome Biotechnology Ltd.獲得的質(zhì)粒pEGF3、pWRL500和pWRL525和由Pharmacia South Seas Pty.Ltd.得到的質(zhì)粒pUC19(Yanisch-Perron等，1985)。
所有其他原料，包括限制酶和其他酶均由商業(yè)途徑得到，分析級(jí)試劑是可用由任何途徑得到的試劑。
遺傳操作方法基本按Maniatis等(1982)所述方法進(jìn)行。
pEGF3由Wellcome Biotechnology Ltd.按G.Allen等(J.Biote chnology 5(1987)93-114，p.102)所述方法制備。pEGF3除一個(gè)堿基不同外，其他都與pEGF6相同。在pEGF6中編碼Cys 42的密碼子TGC，在pEGF3中已改為TGT。在由此改變所產(chǎn)生的編碼氨基酸并沒(méi)有任何改變。
pWRL500由Wellcome Biotechnology Ltd.按G.Allen等(J.Cell Sci.Suppl.3(1985)29-38)所述方法制備。設(shè)計(jì)該質(zhì)粒是用于表達(dá)TrpE-lys-EGF融合蛋白(參閱圖2)。
所有上述起始原料都可通過(guò)商業(yè)途徑得到，也完全可按本文引用的參考文獻(xiàn)所述方法制備。
pWRL525按圖3所示由pWRL500制備，該質(zhì)?；旧蠟楹铣傻墓押塑账幔?dāng)其與pWRL500的BstEⅡ/EcoRⅠ片段連接時(shí)，形成了編碼EGF的C端部分的順序，末端由Lys53取代Arg53，其后為EGF順序的N端殘余部分。該順序通過(guò)BstEⅡ限制位點(diǎn)連接，標(biāo)記為B-E-B(EGF)，再由1-4拷貝插入到由BstEⅡ切割的pWRL500中。最終的結(jié)構(gòu)含有1-5個(gè)EGF的銜接拷貝，其中1個(gè)是(Arg53)和殘余部分(Lys53)。關(guān)于這個(gè)5拷貝結(jié)構(gòu)，我們稱之為pWRL525。
pCW9是由Wellcome所得的原料按下述方法制備的(參閱圖1)1.用EcoRⅠ消化pEGF3，并經(jīng)由瓊脂糖電泳凝膠切下純化EGF片段，然后用GenecleanTM處理;
2.用EcoRⅠ切割pUC19，并用牛腸堿性磷酸酶處理，除去5′端磷酸鹽基團(tuán)，從而防止再連接，按同樣方法純化;
3.將2個(gè)片段混合，并用T4DNA連接酶連接，連接后的混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌株JM101;
4.以由pUC19得到多連接子區(qū)中的限制位點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)，繪出內(nèi)SphⅠ和BstEⅡ位點(diǎn)的位置圖，鑒定含有插在正確位置上的EGF片段的重組質(zhì)粒(pUC19-EGF);
5.用BstEⅡ切割pWRL525，并純化B-E-B(EGF)片段;
6.用BstEⅡ切割pUC19-EGF，并按同樣方法進(jìn)行純化;
7.將2個(gè)片段混合，并用T4DNA連接酶連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pCW9-RⅠ。
所有上述步驟均采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟悉的標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法和條件(參閱Maniatis，見(jiàn)本文引用的參考文獻(xiàn))進(jìn)行。
實(shí)施例2蛋白pCW9的制備將質(zhì)粒pCW9-RⅠ轉(zhuǎn)移到大腸桿菌株JM101、JM109或XL-lBlue中。
用由pUC19衍生的并通過(guò)加入異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子產(chǎn)生表達(dá)。
還可以使用在結(jié)構(gòu)上可進(jìn)行表達(dá)的其他大腸桿菌株BL21，BL21(DE3)，BL21(DE3)plysE，BL21(DE3)plysS和DHS。
所有這些大腸桿菌株，對(duì)本領(lǐng)專業(yè)人員而言都很容易得到。
實(shí)施例3轉(zhuǎn)化細(xì)菌的培養(yǎng)將由質(zhì)粒pCW9-RⅠ轉(zhuǎn)化的大腸桿菌株JM109(JM109(pCW9-RⅠ))培養(yǎng)在裝有適宜培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中(例見(jiàn)表1)。溶解氧保持在25%以上的飽和空氣中，按需要加入2M NaOH，將pH保持在6.8。按基本需要量加入葡萄糖(5%)。
在收集前5小時(shí)，將IPTG加至最終濃度為0.2mM，促進(jìn)pCW9的合成。所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)很難溶解，以包涵體形成幾乎完全控制在細(xì)胞內(nèi)。24小時(shí)后收集細(xì)胞。在pH7.2的0.03M磷酸鹽緩沖鹽水中(8g/L NaCl，0.8g/L KCl，1.15g/L Na2HPO4，0.2g/L KH2PO4)均勻化，再懸浮于水中。將尿素加到懸浮液中，最終濃度為8M。
將懸浮液離心，潷出碎片，將上清液涂在Q-瓊脂糖柱(Pharmacia)上，再將該柱用8M尿素的NaCl(0-2.0M)洗脫溶液，用20mM Tris-HCl緩沖至pH6.0，含有pCW9蛋白(經(jīng)SDS-PAGE)的部份經(jīng)離心后，涂在經(jīng)8M尿素的緩沖液平衡過(guò)的Sephadex G-75柱(Pharmacia)上。將峰值的各部份合并，通過(guò)透析過(guò)濾緩慢除去尿素。
實(shí)施例4提取和純化蛋白pCW9的另一方法通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法，收集和破碎細(xì)胞，包括使用機(jī)械勻化器或球磨機(jī)，或溶菌酶的內(nèi)生生產(chǎn)。
根據(jù)所用的細(xì)胞破碎方法，需要用DNA酶處理減低粘稠度。在37℃下，用2mM MgCl2和0.2μg/ml DNA酶對(duì)勻漿溫育2-3小時(shí)。
通過(guò)離心收集含包涵體的細(xì)胞漿，并用2體積的緩沖液B(10mMDETA，0.2M NaH2PO4，pH7.5)洗滌細(xì)胞漿，然后將其溶解于重量為包含物40倍的緩沖液C(6M尿素，5mM半胱氨酸，25mM碳酸氫鈉，21mM碳酸鈉，pH9.8)中。包涵物碎片用機(jī)械搗碎機(jī)充分分散。
在室溫下，將溶液緩慢攪拌3小時(shí)，然后用1/2體積的緩沖液CB(25mM碳酸氫鈉，21mM碳酸鈉，pH9.8)稀釋。在室溫下緩慢攪拌24小時(shí)，將蛋白質(zhì)氧化。
加入pH為9.0的20mM乙醇胺緩沖液(與緩沖液C體積相同)進(jìn)一步稀釋該溶液，繼之先后通過(guò)100000標(biāo)稱分子量截止(NMWC)過(guò)濾器和10000 NMWC過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
半純化的濃縮pCW9蛋白還可通過(guò)各種常規(guī)的層析方法進(jìn)一步純化，例如用離子交換層析法。
對(duì)本發(fā)明而言，還應(yīng)該明確理解的是，用于提取和純化pCW9的方法并不嚴(yán)格限制，本領(lǐng)域中許多可能取得本發(fā)明結(jié)果的方法都可使用。
能夠進(jìn)行純化的蛋白pCW9的優(yōu)點(diǎn)之一是其在宿主細(xì)胞中的溶解度很低，基本上限制在包涵體之內(nèi)。
實(shí)施例5離體pCW9蛋白的生物活性將蛋白pCW9與ree-m EGF(Wellcome Biotechnology Ltd.)的生物活性進(jìn)行比較。
對(duì)試驗(yàn)中的各種物質(zhì)都在瑞士Albino 3T3靜置纖維細(xì)胞生成器(國(guó)家血清實(shí)驗(yàn)室)中測(cè)定其在刺激DNA合成中的刺激作用。
將細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)在組織培養(yǎng)穴中，其培養(yǎng)基為經(jīng)過(guò)Dulbecco改進(jìn)的含有10%胎牛血清的3ml Eagles培養(yǎng)基(DMEM)。24小時(shí)后，用新鮮的DMEM稀釋培養(yǎng)基，得到的最終血清濃度為1%。培養(yǎng)3天后，加入試驗(yàn)物質(zhì)，測(cè)定其結(jié)合DNA的速率。pCW9蛋白的效果至少應(yīng)與刺激胸苷結(jié)合中的EGF相同。胸苷結(jié)合完全被羥基脲抑制(Steinert，1969)，該結(jié)合是測(cè)定DNA合成的方法。結(jié)果列于表2-5。
實(shí)施例6pCW9蛋在鼠體內(nèi)的活性EGF能誘導(dǎo)幼鼠的生理應(yīng)答。最明顯的是加速出牙和眼睛張開(kāi)，變化較大而通常又被公認(rèn)的是皮毛的改變。皮膚上的皮屑、皮毛卷曲和皮毛生長(zhǎng)降低都是表現(xiàn)出來(lái)的特征。所有這些作用都是由蛋白pCW9引起的，而且提前張開(kāi)眼睛和長(zhǎng)牙，完全類似于由rec-m EGF引起的那些特征。結(jié)果示于表6和7。
將EGF衍生物與Methocel A-15載體配制成配制劑，施用于羊。該標(biāo)準(zhǔn)載體按下述方法制備1.將18.375 g Methocel A-15分散在120ml熱水(80-90℃)中;
2.加入240ml冷水，將該溶液冷卻至5℃;
3.加入10ml芐醇后混勻;
4.加水混合至500ml。
將凍干的EGF衍生蛋白(例如pCW9)加到標(biāo)準(zhǔn)載體中，得到的最終濃度為1-10mg/ml。經(jīng)Turrax超勻化器處理3分鐘，使其分散。
實(shí)施例7蛋白pCW9在羊體內(nèi)的生物活性按與rec-mEGF的同樣方法和劑量范圍，將蛋白pCW9施用于羊，在與rec-m EGF同樣劑量使用時(shí)，可以看到所有相同的作用，即食物吸入量短暫減少，在一周內(nèi)羊毛纖維的稀少達(dá)到最高程度，因此很容易手工去毛。
結(jié)果示于表8和9。
在處理1至8中的蛋白pCW9制劑完全不同的純化方法制備的，除制劑7外，所有制劑的活性都很高。應(yīng)該注意的是制劑7在配制時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的沉淀。
根據(jù)體內(nèi)和體外的生物測(cè)定，本發(fā)明的重組EGF在活性方面完全可與已有技術(shù)的rec-m EGF相比擬，而且還可與天然的EGF相比擬。
實(shí)施例8met EGF和met EGF二聚體結(jié)構(gòu)的制備蛋白pCW9在大腸桿菌中表達(dá)良好，而較短的類似物，例如含有與2個(gè)銜接拷貝的EGF相連接的質(zhì)粒pUC18的3個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，表達(dá)卻很差。此外，先前企圖用tac啟動(dòng)子系統(tǒng)表達(dá)met EGF已告失敗。然而出乎意料的是作為本發(fā)明的一部分，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種方法，能夠在大腸桿菌中非常有效地表達(dá)含有與2個(gè)銜接拷貝的EGF相連接的蛋氨酸的蛋白(“met EGF二聚體”)。
成功的結(jié)果是由2個(gè)分離的因子中得到的。第一，啟動(dòng)子選擇所起的作用。使用T7表達(dá)系統(tǒng)(Rosenberg，A.H.等，1987)使met EGF在大腸桿菌中顯著地表達(dá)。第二，在相同的系統(tǒng)中，以顯著高于met EGF的水平表達(dá)met EGF二聚體。
起始遺傳物質(zhì)pEGF3和pUC19已在實(shí)施例1中介紹過(guò)，pUC18與pUC19的來(lái)源相同。
pUC19載體通過(guò)在合成的小片段DNA中的克隆進(jìn)行修飾，pUC19 DNA先用EcoRⅠ和SacⅠ消化，然后在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。從凝膠上切下大片段，并用GenecleanTM純化。合成的DNA具有下列順序5′CCATGGCTAGCCATATG 3′3′TCGAGGTACCGATCGGTATACTTAA 5′
混合后，在適當(dāng)?shù)臈l件下用T4DNA連接酶連接經(jīng)切割的pUC19載體片段(Maniatis，參閱本文引用的參考文獻(xiàn))?；厥沾竽c桿菌株JM101中的轉(zhuǎn)化株。形成的質(zhì)粒pUC19-L用EcoRⅠ消化，并將由含EGF基因的pEGF3中的EcoRⅠ片段進(jìn)行克隆。分析轉(zhuǎn)化株中的DNA，并選擇EGF片段已經(jīng)插在pUC19 Lac啟動(dòng)子中表達(dá)所需正確位置的克隆(pUC19-2-1)。
在pUC18中進(jìn)行類似的構(gòu)建。將EGF EcoRⅠ片段插入在pUC18 Lac啟動(dòng)子中表達(dá)所需的正確位置中，得到質(zhì)粒pUC18-8b。
用Eco 0109Ⅰ和BstEⅡ消化pUC19-1-1和pUC18-8b，將pUC18-8b的小片段與pUC19-L-1的大片段相連接，得到質(zhì)粒pUC19-L-1-2。用酶Nde Ⅰ和BamH Ⅰ從pUC19-L-1-2上切下含EGF基因的片段，并將其連接到與已經(jīng)由同樣的酶消化過(guò)的質(zhì)粒pET3b中。連接產(chǎn)生了能夠表達(dá)met-EGF的質(zhì)粒pET3b-1。通過(guò)用Bst EⅡ和連接含EGF基因的pWRL525的BstE Ⅱ片段，構(gòu)建表達(dá)met-EGF二聚體(pET3b-2)的質(zhì)粒(如同實(shí)施例1中pCW9-RⅠ的構(gòu)建)。質(zhì)粒pET3b-1和pET3b-2的構(gòu)建說(shuō)明示于圖4。
實(shí)施例9met-EGF和met-EGF二聚體的表達(dá)、提取和純化在pET3b-Ⅰ和pET3b-2中，met-EGF和met-EGF二聚體的表達(dá)分別在由T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子控制下進(jìn)行的。因此，對(duì)需要表達(dá)的蛋白而言，質(zhì)粒應(yīng)用于能產(chǎn)生T7 RNA聚合酶的宿主細(xì)胞中。我們選擇使用的宿主是BL21(DE3)(Rosenberg等，1987，參閱本文引用的參考文獻(xiàn))。在該菌株中，當(dāng)加入IPTG誘導(dǎo)T7 RNA聚合酶表達(dá)時(shí)，產(chǎn)生T7啟動(dòng)子的表達(dá)。
met-EGF和met-EGF二聚體的提取和純化采用與純化蛋白pCW9同樣的方法(參閱實(shí)施例4)。met-EGF生物活性的測(cè)定如實(shí)施例7，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其活性可與蛋白pCW9相比擬。
實(shí)施例10
為了有效地表達(dá)二聚體的EGF類似物及其出乎意料的生物活性，對(duì)具有大量EGF銜接重復(fù)的其他類似物進(jìn)行了構(gòu)建和研究。
表達(dá)相當(dāng)于蛋白pCW9的蛋白但具有3，4和5拷貝數(shù)的EGF的質(zhì)粒，可按類似于構(gòu)建質(zhì)粒pCW9-RⅠ(實(shí)施例1)的方法進(jìn)行構(gòu)建。其區(qū)別僅在于進(jìn)行部份消化，而不是用Bst EⅡ?qū)WRL525完全消化。采用該方法，可以分離到含2，3和4個(gè)銜接拷貝的EGF基因的片段，并將其克隆到經(jīng)Bst EⅡ裂解的pUC19-EGF中，得到具有3，4和5拷貝EGF基因的質(zhì)粒(pUC19-11-4，pUC19-11-5和pUC19-11-6)。
由pUC19-11-4表達(dá)的EGF-三聚體蛋白基本上按與蛋白pCW9同樣的方法(參閱實(shí)施例4)提取和純化。該蛋白在羊體內(nèi)也具有活性。
顯然本領(lǐng)域的專業(yè)人員采用各種重組和合成DNA構(gòu)建的方法，都能夠制備本發(fā)明的重組生長(zhǎng)因子，而且根據(jù)生長(zhǎng)因子的重復(fù)數(shù)和N端附加(主要)順序的長(zhǎng)度和性質(zhì)，所產(chǎn)生的重組生長(zhǎng)因子能具有各種氨基酸順序。
雖然我們還不能對(duì)精確的重復(fù)數(shù)或主要順序的長(zhǎng)度或性質(zhì)的生物活性給予任何預(yù)測(cè)，但是能很簡(jiǎn)單地測(cè)定任何特定的氨基酸順序是否能產(chǎn)生具有活性的生長(zhǎng)因子。例如所需蛋白的量能用免疫測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，而其生物活性可用生物測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，這種最簡(jiǎn)單快速測(cè)定方法就是細(xì)胞有絲分裂測(cè)定法，例如上述實(shí)施例5所用方法。
階層篩選法可用于測(cè)定(a)表達(dá)量;
(b)體外活性;
(c)體內(nèi)活性。
其他適宜的方法也是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知的，他們無(wú)需過(guò)多的試驗(yàn)即能鑒定具有“活性”的順序。
應(yīng)該明確地理解本發(fā)明的普通意義，而不限于上述特定的細(xì)節(jié)。
本文所引用的文獻(xiàn)列后。
表1適宜于表達(dá)蛋白pCW9的大腸桿菌株JM109生長(zhǎng)的培養(yǎng)基per L(NE4)2SO420gKH2PO43g檸檬酸蘭鈉 0.5g加痕量元素溶液＊ 2ml50% MgSO47H2O 3ml50%葡萄糖
20ml0.2g/ml氨芐青霉素 1ml＊痕量元素溶液 (g/L)CaCl2·6H2O 20FeCl·26H2O 25CaCl2·6H2O 2.5MnSO4·nH2O 5ZnSO4·7H2O 5(NH4)6MO7O24·4H2O 2.5AlCl3·6H2O 5CuSO4·4H2O 1H3BO30.5
表2蛋白pCW9對(duì)離體細(xì)胞的生物活性(Swiss Albino 3T3 細(xì)胞系，DMEM+1%胎牛血清)3H-胸苷的結(jié)合(總量cpm) 刺激指數(shù) P處理 (Lord范圍的測(cè)定)對(duì)照1.不加 13，966 1.00 -2.尿素對(duì)照 13，936 1.00 -rec-m EGF1.10 ng/ml 24，059 1.72 ＜0.05蛋白 pCW91.不純制劑 26，353 1.89 ＜0.01表3在離體細(xì)胞中蛋白TrpE-EGF生物活性的缺失(Swiss Albino 3T3 細(xì)胞系，DMEM+1% 胎牛血清)3H-胸苷的結(jié)合(總量cpm) 刺激指數(shù)處理對(duì)照 12，632 -EGF(10ng) 34，495 2.73TrpE-EGF(10ng) 12，228 -TrpE-EGF(100ng) 13，317 -
表4蛋白pCW9在離體細(xì)胞中的生物活性(Swiss Albino 3T3 細(xì)胞系，DMEM+1% 胎牛血清)3H-胸苷的結(jié)合刺激指數(shù)處理 (受羥基脲的抑制)對(duì)照1.不加 6，938 (1.00)2.對(duì)照細(xì)菌產(chǎn)物(a) 4，046 0.583.對(duì)照細(xì)菌產(chǎn)物(b) 4，044 0.58rec-m EGF1.10 ng/ml 12，417 1.792.1000 ng/ml 5，690 0.82蛋白 pCW91.250 ng/ml 15，754 2.27(a)含有β-半乳糖苷酶和牛蜱蛋白順序的融合蛋白。
(b)重組β-半乳糖苷酶。
表5蛋白pCW9在離體細(xì)胞中的生物活性(Swiss Albino 3T3 細(xì)胞系 in DMEM+0.25% 胎牛血清)3H-胸苷的結(jié)合刺激指數(shù)處理 (受羥基脲的抑制)對(duì)照加緩沖液 1，850 1.00rec-m EGF1 ng/ml 3，667 1.980.3 ng/ml 3，430 1.850.1 ng/ml 2，343 1.27蛋白 pCW9次數(shù) 141 ng/ml 3，004 1.620.3 ng/ml 3，609 1.950.1 ng/ml 3，439 1.86次數(shù) 2，28/51 ng/ml 4，465 2.40.3 ng/ml 2.685 1.450.1 ng/ml 1，725 0.93
表6蛋白pCW9在新生鼠中的生物活性組(n-3)1窩 其他 劑量 出牙天數(shù) 張眼天數(shù)3 對(duì)照-未處理 10 13/141 pCW9-a 12 μg x 4 9 10/113，4，5，6天齡 2 pCW9-b 12 μg x 4 9 10/113 pCW9-c 12 μg x 4 9 9/10的劑量 4 pCW9-d 12 μg x 4 9 1015 對(duì)照1-未處理 11/12 14/161 1β-a半乳糖苷酶 10/12 14/163，4，5，6天齡 2 1大EGF 融合-a211 14/163 1大EGF 融合-b 11/12 14/16的劑量 4 大融合的對(duì)照311/12 14/1621 對(duì)照-未處理 10 141，2，3，4天齡 rec-mEGF 12 μg x 4 7 9/10的劑量1.僅測(cè)定(不純制劑)pCW9-a，-b，-c，-d是不同次數(shù)的蛋白pCW9。
用pUR288在細(xì)菌中產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。
2.大EGF融合-a，b是含有與EGF順序融合的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白δ。
3.大融合對(duì)照是含有與牛蜱蛋白順序融合的谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白。
表9蛋白pCW9在羊體內(nèi)的生物活性羊的處理＊ 去毛效率(5個(gè)讀數(shù)的平均值)N/ktexNo. 劑量 天數(shù)，劑量μg/kg -4 0 +6 +10 +14 121650 1-120 8.81 11.78 2.01 2.19 0.85 0.37 去毛647 1-150 7.67 9.52 3.57 2.72 1.99 0.63669 1-300 10.85 13.62 4.38 2.16 0.75 0.21 去毛666 2-150 7.38 7.21 2.02 0.93 0.39 0.72646 3-120 6.86 6.29 1.88 0.68 0.31 去毛645 3-150 7.68 7.95 1.72 1.79 1.38 1.06 去毛659 3-300 7.52 8.77 1.97 1.66 0.88 去毛658 4-120 6.29 7.92 0.91 0.20 去毛677 4-150 14.79 13.51 2.08 1.01 0.24 去毛668 4-300 6.31 6.40 1.70 0.97 0.63 0.61679 5-150 11.86 15.95 4.83 1.73 1.31 2.09663 6-136 11.19 10.56 0.55 0.70 去毛674 7-120 14.54 15.88 14.17 21.33 16.59 20.61654 7-150 7.94 6.70 7.20 6.96 8.09 8.68657 7-300 7.49 7.06 5.89 6.02 5.32 6.00676 8-120 7.47 8.62 1.68 0.81 去毛665 8-150 6.86 6.89 2.85 1.48 0.77 0.31667 8-300 9.94 11.29 2.21 1.51 0.53 去毛＊連字符號(hào)“-”前的數(shù)字(1-8)表示所用蛋白pCW9制劑(參閱說(shuō)明書)。
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權(quán)利要求
1.一種重組DNA分子，其順序編碼具有選自表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFα)的動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白(生長(zhǎng)因子順序)，所述重組DNA包括主要順序和至少一個(gè)編碼生長(zhǎng)因子的順序。
2.按權(quán)利要求1的重組DNA分子，包括2個(gè)或多個(gè)編碼生長(zhǎng)因子蛋白的順序，所述順序是相互連接的。
3.按權(quán)利要求1或2的重組DNA分子，包括1至30個(gè)生長(zhǎng)因子順序。
4.按權(quán)利要求1至3之任一項(xiàng)的重組DNA分子，其中主要順序具有1至50個(gè)氨基酸長(zhǎng)。
5.按權(quán)利要求1至4之任一項(xiàng)的重組DNA分子，其中生長(zhǎng)因子來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
6.按權(quán)利要求1至5之任一項(xiàng)重組DNA分子，其中生長(zhǎng)因子是EGF。
7.體內(nèi)或離體的DNA復(fù)制自主單位，包括按權(quán)利要求1至6之任一項(xiàng)所述的重組DNA分子。
8.按權(quán)利要求7的DNA復(fù)制自主單位，選自質(zhì)粒、cosmids、表達(dá)載體和病毒。
9.一種質(zhì)粒，含有權(quán)利要求1至6之任一項(xiàng)的重組DNA分子。
10.如文中所限定的質(zhì)粒pCW9-RI。
11.一種由權(quán)利要求8的DNA復(fù)制自主單位或權(quán)利要求9或10的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原核或真核的宿主細(xì)胞。
12.按權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其是細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
13.按權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌(Escherichiacoli)。
14.按權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其是lacⅠσ-(-)株的大腸桿菌。
15.合成具有選自EGF或TGF動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白的方法，包括在能同化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中培養(yǎng)含有權(quán)利要求1至6之任一項(xiàng)所限定的重組DNA的微生物或細(xì)胞系，分離由該微生物或細(xì)胞系產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子，和回收具有活性的生長(zhǎng)因子。
16.按權(quán)利要求15的方法產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子。
17.按權(quán)利要求16的生長(zhǎng)因子，其是EGF。
18.按權(quán)利要求16的生長(zhǎng)因子，其是TGFα。
19.去除動(dòng)物羊毛、皮毛或鬃毛的方法，包括給所述動(dòng)物施用去除羊毛、皮毛或鬃毛有效劑量的權(quán)利要求16或17的EGF或由此產(chǎn)生的EGF。
20.按權(quán)利要求19的方法，其中所述動(dòng)物選自山羊、綿羊、兔、牛、鹿和豬。
21.按權(quán)利要求19的方法，其中動(dòng)物選自羊駝、無(wú)峰駝和駱馬。
22.促進(jìn)傷口、潰瘍或損傷愈合的方法，包括給需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求16至18之任一項(xiàng)的生長(zhǎng)因子。
23.促進(jìn)幼齡動(dòng)物腸成熟的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的權(quán)利要求17或18的生長(zhǎng)因子。
24.合成權(quán)利要求8限定的質(zhì)粒的方法，該方法包括下列步驟(a)用核酸內(nèi)切限制酶裂解含編碼具有選自EGF和TGFα動(dòng)物生長(zhǎng)因子生物活性蛋白的順序的DNA順序(生長(zhǎng)因子順序)，切斷所述的生長(zhǎng)因子順序;(b)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶裂解表達(dá)質(zhì)粒;(c)用DNA連接酶將至少一個(gè)生長(zhǎng)因子順序插入已裂解的表達(dá)質(zhì)粒;(d)回收重組質(zhì)粒。
25.按權(quán)利要求24的方法，該方法包括下列步驟(a)用核酸內(nèi)切限制酶消化含編碼EGF或TGFα的DNA順序的質(zhì)粒，切斷編碼EGF或TGFα的順序或其生物活性片段;(b)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶消化表達(dá)質(zhì)粒;(c)純化步驟(a)和(b)的產(chǎn)物;(d)將所述產(chǎn)物混合和連接;(e)用連接的混合物轉(zhuǎn)化微生物;(f)鑒定編碼EGF或TGFα順序是否在正確位置上的轉(zhuǎn)化株;(g)用核酸內(nèi)切限制酶消化含編碼EGF或TGFα的DNA順序的質(zhì)粒，切斷編碼EGF或TGFα順序或其生物活性片段;(h)用同樣的核酸內(nèi)切限制酶消化步驟(d)的產(chǎn)物;(i)將步驟(g)和(h)的產(chǎn)物混合，通過(guò)N端和/或C端上短外順序的兩側(cè)連接形成編碼一個(gè)或多個(gè)EGF或TGFα的銜接拷貝或其生物活性片段;(j)回收由此形成的質(zhì)粒。
26.按權(quán)利要求24或25的方法產(chǎn)生的質(zhì)粒。
27.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求16至18之任一項(xiàng)的生長(zhǎng)因子和藥物上可接受的稀釋劑，載體或賦形劑。
28.一種合成或半合成細(xì)胞或組織培養(yǎng)基，包括權(quán)利要求16至18之任一項(xiàng)的生長(zhǎng)因子和無(wú)毒性的稀釋劑或載體。
29.一種去除羊毛、皮毛或鬃毛的組合物，包括權(quán)利要求16或17的EGF和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼具有表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子生物活性的蛋白的重組DNA，所述重組DNA包括主要順序和至少一個(gè)編碼生長(zhǎng)因子的順序。
文檔編號(hào)C07K14/495GK1051198SQ90108420
公開(kāi)日1991年5月8日 申請(qǐng)日期1990年10月11日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月11日
發(fā)明者羅伯特·約翰·穆?tīng)?申請(qǐng)人:皮特曼-穆?tīng)柊拇罄麃営邢薰?br>