專利名稱：重組日本腦炎分子及其使用方法
東方國家發(fā)生腦炎的主要原因是由于日本腦炎病毒(JEV)，一種黃色病毒感染的結果。該病毒是以當?shù)氐咎镒躺奈米訛槊浇閭鞑サ摹?br> 直至最近，唯一普遍公認的有效的黃色病毒疫苗是減毒的黃色發(fā)熱病毒疫苗(Thieler et al)試圖生產(chǎn)用于其它黃色病毒的減毒疫苗，大多數(shù)只取得有限成功(Bancroft et al.;Innis et al.)。
自1965年以來，一直使用高度純化的、福爾馬林失活的、來源于小鼠腦的JEV疫苗，事實表明，該疫苗安全而且有效(Hoke et al)。對高度純化的需求通常意味著成本比較高。因此，希望有一種不從小鼠腦得到的疫苗(Monath，Editorial，NEJM，8 Sept，1988)。期望通過采用重組DNA技術，能生產(chǎn)這類疫苗。
本發(fā)明目的之一在于提供一種重組日本腦炎分子，該分子能用于檢測JEV感染，對JEV的感染免疫以及治療JEV感染。本發(fā)明另一個目的在于提供檢測受試者的日本腦炎感染的方法。
本發(fā)明目的還在于提供一種安全而有效的疫苗，該疫苗能以較低的成本制造。
本發(fā)明提供重組日本腦炎DNA分子，載體及由它們產(chǎn)生的重組旦白質。
本發(fā)明還提供了檢測，免疫和治療受試者的日本腦炎感染的方法，包括在適當?shù)臈l件下利用重組日本腦炎旦白質。


圖1表示JEV的限制性內(nèi)切酶圖譜;
圖2說明重組JEV病毒載體的克隆過程;
圖3表示通過重組產(chǎn)生的蛋白質與JEV抗體的反應;
圖4表示接受了桿狀病毒表達的、JEV多旦白或E糖旦白的小鼠的存活情況;
圖5表示噬菌斑試驗結果，其中可看到在接受重組JEV E旦白的小鼠中JEV特異性噬菌斑減少;
圖6表示免疫沉淀分析結果;
圖7概述了JEV質粒重組體的結構;
圖8表示重組旦白質的Western印跡分析。
通過與JEV E特異性單克隆抗體反應測定載體8283表達的一種旦白質。該結果表明表達是通過pM和M基因進行的。Western印跡還顯示了強度大致相同的三個多肽兩條接近的附加帶在約45K，另一條帶在約65K。這個結果表明45K的二條帶代表E-基因產(chǎn)物，它是由預定大小為66-72K的pM/M/E前體分裂產(chǎn)生的。Western吸印試驗測定結果表明，重組載體8302沒有顯示E特異性抗體;
圖9表示與抗-NS-1單克隆抗體反應的重組旦白質的Western印跡;
圖10表示與抗-M和抗-E特異性抗體反應的重組體的Western印跡;
圖11表示抗JE-E HMAF只與JE-E表達重組體反應，而DEN1-E HMAF特異性地與DEN 1-E表達重組體反應;
圖12表明NS-1表達重組體具有可測量程度的交叉反應性;
圖13表示某些重組載體產(chǎn)生全長度NS-1基因產(chǎn)物。
本發(fā)明提供一種重組DNA分子，它包含全長或部分JEV被膜蛋白編碼區(qū)。
本發(fā)明還提供一種重組DNA載體構建物，它包含全長或部分JEV被膜蛋白編碼區(qū)和一種病毒載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，該病毒載體是一種桿狀病毒載體。該桿狀病毒載體含有ATG起始密碼子、一個疏水膜插入(信號)序列和一個TAA轉譯終止密碼子。可用于實施本發(fā)明的合適載體包括(但不限于這些)，選自命名為MGS3+1、PUC19、MGS12、MGS3和MGS3+2的這組載體的桿狀載體。
本發(fā)明還提供了重組JEV病毒載體，例如命名為8302、8437、8501、8929、8469、8468、8650、8590和8716的載體，以及重組JEV RNA和它們各自表達的被膜蛋白。
本發(fā)明還提供了一種昆蟲細胞，該細胞含有一種重組DNA分子，該分子包含全長或部分JEV被膜旦白編碼區(qū)。
本發(fā)明還提供了一種組合物，該組合物含有旦白質和一種醫(yī)藥上可接受的載體，該旦白質由命名為8302、8437、8501、8929、8469、8468、8650、8590和8716的重組載體表達。這里所用的術語“醫(yī)藥上可接受的載體”包括任一種標準藥用載體，如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液，水和乳狀液如，油/水乳液和各種類型的潤濕劑。這些組合物也可含有一種合適的輔藥。
本發(fā)明提供的上述組合物中還包括與重組JEV被膜旦白質相結合的可檢測成分，如，放射性同位素如32P和35S，染料和光化學試劑。
本發(fā)明提供了一種檢測受試者(如病人)中存在的日本腦炎病毒的方法，該方法包括在生成抗體-抗原復合體的條件下，將來自試驗對象的合適樣品與上述重組JEV被膜旦白相接觸，檢測生成的復合體，從而可檢測日本腦炎的存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，該重組JEV被膜旦白質是用上述可檢測成分標記的。用于實施本發(fā)明的合適樣品包括(但不限于這些)血清;中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織;和脊髓液。
本發(fā)明為日本腦炎患者(如病人)提供了治療和/或預防方法，該方法包括給患者施用可接受治療量的所說的JEV被膜旦白組合物，可有效地防止和/或治療日本腦炎。該組合物可用任何合適的方法給藥，如靜脈注射或肌內(nèi)注射。
JEV的CDNA克隆按前述McAda等人，Mason等人的方法克隆日本腦炎病毒(Nakayama株)且進行序列分析。選擇包含編碼E(pE-7)，NSI(pM-6)或該病毒的全部多旦白的編碼區(qū)的克隆。
桿狀病毒的克隆和表達圖7概述了質粒JEV重組體的結構。
E糖旦白編碼區(qū)來源于通過用HpaⅡ和EcoRⅠ限制性消化克隆pM-7(Y1)而產(chǎn)生的核苷酸656-1919的一個1263堿基對(BP)片段(參見圖1)。NS1糖旦白編碼區(qū)來源于克隆PM-6，即用ApsⅠ切割后產(chǎn)生的核苷酸2063-3340的一個1277bp片段。稱為“多旦白”的preM至E的JEV基因編碼區(qū)是通過將在核苷酸1620處有一個共同SacⅠ限制性位點的克隆系Y1和pM-6融合而構建成的。然后將該基因克隆到桿狀病毒重組載體(pAcMGs)。將E基因克隆到一種可提供一個起始ATG密碼子、一個疏水膜插入(信號)序列和一個TAA轉譯終止密碼子的載體上。將NS1和多蛋白基因克隆到一種載體上，由該載體提供ATG和終止密碼子，但信號序列是由插入物供給的。用病毒和載體DNA共轉染草地粘蟲(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞，將重組載體上的基因重組到桿狀病毒(Autographa californica，核多角體病毒)的多角(Pn)基因(參見圖2)。根據(jù)噬菌斑形態(tài)學可鑒定多角陰性(Pn-)重組體。為表達該JEV基因，以每細胞生成10個噬菌斑單位的多重性用重組病毒感染單層或懸浮培養(yǎng)物的昆蟲細胞。感染后72小時，收集細胞，并在含SDS和2-巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液中溶解。在聚丙烯酰胺-SDS凝膠中電泳該溶胞產(chǎn)物，用考馬斯(coomassie)藍染色或轉移到硝酸纖維膜上。用合適的抗血清通過Western吸印試驗檢測抗原帶。
鼠保護試驗用生長6周的雌性C57黑鼠作為一個鼠免疫激發(fā)模型。將等體積未純化的草地粘蟲細胞溶胞物(約3.3×107細胞/ml)和弗氏完全佐劑混合制得免疫制劑作為第一次劑量;將上述溶胞產(chǎn)物與不完全佐劑混合制得免疫制劑作為依次的二次劑量。從腿部肌肉注入0.2ml該混合物，再由腹膜注入另外0.2ml沒有佐劑的細胞溶胞產(chǎn)物。在0，3和14天對鼠接種，在第21天即它們被激發(fā)的前一天抽血。由感染日本腦炎病毒(Nakayama株)的乳鼠腦的20%懸浮液的1/10稀釋液制備免疫激發(fā)病毒。該免疫激發(fā)制劑含有約100個日本腦炎病毒的鼠LD50′S。在第22天由腹膜內(nèi)注入該免疫制劑，此后每天觀察鼠，記錄其死亡日期。
噬菌斑減少中和試驗按曾描述的Russell和Nisalak的方法，用稀釋10倍的血清進行試驗，根據(jù)噬菌斑的減少測定其中和JEV的能力。使用大約形成50個噬菌斑單位的日本腦炎病毒的Nakayama菌株。將病毒和血清混合，在36℃保持60分鐘。將該病毒-血清混合物接種在含融合LLCMK2細胞的25cm2燒瓶中，在室溫下保溫2小時后，用含1%純化瓊脂(Difco，Detroit，MI)的199培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，N.Y.)中覆蓋燒瓶，在36℃培養(yǎng)7天后，用溶于鹽水中的0.02%中性紅染色細胞，對噬菌斑計數(shù)。每種鼠血清做二個重復試驗，所記錄的噬菌斑數(shù)目是二次測定結果的平均值。然后與對照鼠血清的測定結果相比較，可算出噬菌斑減少的百分數(shù)。
放射性免疫一點吸印試驗用純化的、福爾馬林失活的JEV(Biken Vaccine，Japan)或未純化的、JEV感染的貓腎(CRFK)溶解細胞(Crandall等人)，或未感染的CRFK細胞作為試驗用抗原進行放射免疫一點吸印試驗。將用重組桿狀病毒制劑免疫的鼠的血清稀釋1/500。用JEV特異性的超免疫的鼠腹水(HMAF)(按McCown和Brandt所述方法制備)稀釋1/500作陽性血清對照，用未免疫鼠的腹水作陰性對照。將抗原滴在硝酸纖維濾紙上，用5%脫脂干牛奶、0.001%疊氮化鈉阻滯該紙20分鐘。將血清加到紙上，在室溫下保溫過液。用125I標記的山羊抗鼠IgG檢測被束縛的抗體。徹底清洗后，在LKBγ計數(shù)器中對紙計數(shù)。通過扣除背景值以校正結果，結果以cpm表示。等于或大于陰性對照2.5倍的計數(shù)值可認為顯示出特異性抗體。
免疫沉淀反應將取自各免疫接種組的貯存的鼠血清稀釋1/100進行免疫沉淀反應。試驗用抗原是用35S-蛋氨酸體內(nèi)標記的JEV感染的CRFK細胞的溶胞產(chǎn)物。將該抗體和抗原在4℃保溫過夜，然后用旦白A瓊脂糖珠(pharmacia，piscataway，NJ)吸收免疫復合物。徹底清洗后，在Laemmli樣品緩沖液中煮沸且在12.5%含十二烷基硫酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺中電泳，以洗脫抗原。
圖6表示用來自重組體免疫的鼠的血清進行的JEV旦白的免疫沉淀。JEV抗原是由用JEV(Nakayma菌株)感染的并用35S-旦氨酸標記的Crandell′s貓腎細胞(CRFK，Crandell等人，1976)的SDS溶胞產(chǎn)物制備的，免疫沉淀后，在12.5%聚丙烯酰胺-SDS凝膠中電泳分析旦白質。1道表示用重組E旦白免疫接種的鼠進行的實驗結果;2道表示重組體NS1蛋白;3道表示重組多旦白;4道表示β-半乳糖苷酶;5道表示純化的福爾馬林失活的JEV病毒(Biken vaccine);6-10道如同1-5道，所不同的是用未感染的CRFK細胞的溶胞產(chǎn)物進行免疫沉淀。
實驗結果桿狀病毒中JEV基因的表達選擇顯示能編碼病毒粒子E糖蛋白和NS1糖旦白的JEV基因(McAda等人;Mason等人)進行表達，產(chǎn)物作為疫苗候選物(圖1)。此外，選擇從結構性前體preM到非結構性旦白NS3的完整多旦白編碼區(qū)進行表達。獲得表達這些JEV基因的桿狀病毒重組體使用的一般方法如圖2所示。重組桿狀病毒可用于感染草地粘蟲(spodoptera frugiperda)細胞，細胞溶胞產(chǎn)物通過在聚丙烯酰胺-SDS凝膠中電泳，然后用考馬斯亮藍R250染色或將其用JEV特異性抗血清進行Western吸印試驗(Brunett等人)，以分析JEV旦白質。如圖3所示，產(chǎn)生了與JEV抗體反應的旦白。將染色的凝膠與Western印跡對照，對某些重組體來說，在相同位置具有的染色的旦白質帶作為免疫反應帶。在用B-yol表達重組桿狀病毒感染的細胞中不存在這些帶。因此可認為是JEV特異的。通過染色凝膠的密度計掃描，測得每106細胞所產(chǎn)生的E和ES1旦白的量分別約10和30μg。
雖然用多旦白重組體感染的細胞沒有產(chǎn)生足夠多的能在染色凝膠中清楚地看到的旦白，但在Western印跡中看到的旦白表明所形成的多旦白已進行了適當?shù)募庸ぬ幚?。Western印跡表明加工過的JEV量約為E重組體表達量的1/20(參見圖8和9)圖10表示與抗-M和抗-E特異抗體反應的重組體的Western印跡。結果說明產(chǎn)生一個大約66-72K的多旦白前體，接著又被切割產(chǎn)生多種產(chǎn)物。然而，脈沖追蹤實驗未能證明前體/產(chǎn)物的關系。由此看出，該多旦白顯然是在合成過程中分裂。如圖10所示，重組體V8929，以及較短的重組體V8283，表達且產(chǎn)生全長E基因產(chǎn)物。而且，圖12表明重組體V8929產(chǎn)生全長MS1基因產(chǎn)物。這些結果說明，在桿狀病毒感染的細胞中JEV旦白進行精確分裂，且通過糖基化該旦白質已被修飾。
JEVE表達設計兩種構建物以表達JEV E基因V8302和V8501。重組體V8501設計成用桿狀病毒特異信號肽表達E基因。該重組體的表達水平是高的，產(chǎn)生大小在46-50K范圍內(nèi)的大量的多肽。該大小范圍說明該產(chǎn)物已糖基化。如圖3所示，在考馬斯亮藍染色的凝膠中可看到這些旦白質，如圖10所示。在Western印跡中它們是強抗原。
JEVNS-1表達將重組體V8524設計成用上述E基因C末端的34個氨基酸供給的信號表達NS-1基因。該重組體的表達水平是高的，它產(chǎn)生大小約50K范圍的大量的多肽，該大小范圍說明產(chǎn)物已糖基化。如圖3所示，在考馬斯亮蘭染色凝膠中可看見該蛋白質，如圖10所示，在Western印跡中它是強抗原的。
DEN1E表達設計4個重組體以表達DEN1E基因。重組體V8590設計成利用由載體提供的信號表達一個C端截短的E基因，V8716設計成利用由上述M基因C端36個氨基酸提供的真正信號來表達。重組體V8590的表達水平是高的，它產(chǎn)生大量的大小約為55-58K的多肽(參見圖11)。其大小說明該產(chǎn)物已糖基化。但是，重組體V8716表達差。重組體V8468/69和V8650的表達也差。重組體V8468/69和V8590之間的差別僅在于C端平截。
DEN1NS1表達重組體V8858設計成利用上述E-基因的55個氨基酸作信號，表達出全長的NS-1產(chǎn)物。該重組體的表達水平是好的，它產(chǎn)生大量的大小約50K范圍的多肽。該大小范圍說明該產(chǎn)物已糖基化(參見圖12)。
對所有的E構建物和NS-1構建物進行比較以確定血清中是否存在用Western吸印試驗測得的那樣的交叉反應。圖11表明抗JE-E HMAF僅與JE-E的表達重組體反應，同樣，DEN1-E HMAF特異性地與DEN1-E的表達重組體反應。但是，圖12表明對NS-1表達重組體有可測量程度的交叉反應?？笵EN2，NS-1 HMAF對JENS-1和DEN1 NS-1發(fā)生交叉反應，而JE NS-1 HMAF(對克隆32)僅與JE NS-1反應。在Western試驗中JE NS-1 HMAF與克隆32反應有困難。若該血清更活潑，可期望它與DEN NS-1有交叉反應。
通過用糖基化抑制劑衣霉素處理細胞和用3H氨基葡糖標記重組旦白可鑒定蛋白質的糖基化(資料未顯示)。
用桿狀重組JEV旦白抗活JE病毒以保護鼠接受由桿狀病毒表達的、JEV多旦白或E糖蛋白的鼠存活數(shù)明顯高于接受NS-1糖旦白或β-半乳糖苷酶鼠的存活數(shù)(見圖4和表1)。
表Ⅰ 免疫鼠的存活數(shù)和免疫狀況活死組 早晚 P 抗體存在 平均噬菌班減少多蛋白 13 3 3＊＜.05 15＊58%＊E 15 2 3＊＜.05 18＊62＊NS1 6 9 4 NS 1 14
表Ⅰ 免疫鼠的存活數(shù)和免疫狀況(續(xù))活 死組 早晚 P 抗體存在 平均噬菌班減少β-gal. 6 13 1 - 0 8JE病毒 20 0 0＊＜0.001 20 98＊粒子＊當與負對照受體(在相同的桿狀病毒體系中表達的β-半乳糖苷酶)相比較時P＜0.00568%接受多旦白的鼠以及75%接受E糖旦白的鼠在用活的JEV免疫試驗后存活了下來，與此相比，30%接受β-半乳糖苷酶的鼠和32%接受NS1的鼠存活下來(當與負對照相比時二者P＜0.005)。這些結果表明甚至在死亡的鼠中施用重組體E糖旦白和多旦白制劑而不是給與β-半乳糖苷酶能延長其存活期。對于死亡的14個β-半乳糖苷酶受體，有13個早死，即在活病毒進行免疫激發(fā)試驗后約6天死亡。而對于多蛋白受體，僅3/6早死(P＝0.06，用Fisher′s精確試驗)，對E受體，僅2/5早死(P＝0.04，與對照相比)。
與重組抗原相比，用福爾馬林失活的JEV病毒粒子制劑可保護100%已給藥的鼠。這是確實的，即使病毒稀釋110000也這樣(數(shù)據(jù)未表明)。
在重組E蛋白和多旦白免疫的鼠中JEV中和抗體的檢測用接受純化的、福爾馬林失活JEV(Biken疫苗制劑)、桿狀病毒重組多旦白或E糖旦白的鼠血清稀釋液(1/10)進行試驗時，可看到JEV特異噬菌斑減少(圖5)。該稀釋試驗(P＜1×10-7)表明來自15/19多旦白受體和18/20E糖旦白受體的血清其噬菌斑減少50%或更多，而只有0/20β-半乳糖苷酶和1/19NS1受體產(chǎn)生相應的減少量。對多旦白受體噬菌斑平均減少58%，對E糖旦白受體，平均減少62%(P＜0.005，當與β-半乳糖苷酶對照組中觀察到平均減少8%相比時)。若所有組一起考慮，鼠中中和抗體的存在與它們的存活有明顯關系。
重組體E、NS1和多旦白抗原的免疫原性測定重組體免疫鼠對病毒特異抗原的抗體應答。試驗的抗原是純化的，福爾馬林失活的JE病毒(Biken疫苗)和JEV感染的CRF K細胞的未純化溶胞產(chǎn)物。用放射性免疫分析測定免疫應答的量。來自用桿狀病毒重組體β-半乳糖苷酶免疫的鼠和未免疫對照鼠的血清明顯地不與任何JEV特異抗原制劑反應。但是，來自用純化的福爾馬林失活的病毒或用JEV感染的鼠腦(HMAF)免疫的鼠的血清對兩種抗原制劑有強烈反應。桿狀病毒重組E糖旦白的受體對純化的病毒和粗制的細胞溶胞產(chǎn)物也均有抗體。桿狀病毒重組NS1糖旦白的受體只對JEV溶胞產(chǎn)物有抗體，這意味著在純化的病毒制劑中不存在NS1。
與用純化的福爾馬林失活的JEV或用JEV感染的小鼠腦免疫的鼠相比，顯然接受重組蛋白的鼠產(chǎn)生的抗體少或抗體親合力低。為確定免疫原性中該差別是否能定量，用逐次稀釋的重組抗原以及福爾馬林失活的病毒進行JEV特異性HMAF的放射性免疫分析。分析結果表明該重組蛋白至少具有和病毒一樣的抗原性反應，而E糖旦白重組體的反應性幾乎是它們的雙倍。
為了確定用重組旦白免疫的鼠是否特異性地對合適的真正的JEV旦白產(chǎn)生應答，將免疫后血清與來自JEV感染的CRFK細胞的35S-旦氨酸標記的旦白質進行免疫沉淀(圖6)。來自用桿狀病毒重組E糖旦白免疫鼠的收集的血清如同來自用純化JE病毒(Biken疫苗)免疫鼠的血清一樣可免疫沉淀出相同的旦白質(雖然其作用不如后者有效)，該旦白質包括E的預定大小旦白質(約50kd)和21kd旦白質(這可能是一種降解產(chǎn)物)。用桿狀病毒重組NS1糖旦白免疫的鼠血清可免疫沉淀出非均一的旦白質，其大小與NS1一致(靠近40kd)。該非均一性可反映NS1旦白質的糖基化狀態(tài)的差異(Russell等人，1980)。有趣的是，用來自含有多旦白編碼區(qū)(C、preM、E和NS1)的桿狀病毒重組體的旦白質免疫的鼠可產(chǎn)生可檢測的對E而不是對NS1的免疫沉淀抗體。來自用桿狀病毒重組β-半乳糖苷酶免疫鼠的負對照貯存血清不能免疫沉淀任何JEV旦白質。
實驗討論有很多體系都能表達日本腦炎病毒基因，至今最廣泛應用的是用大腸桿菌表達這些基因。雖然已制得病毒旦白質，但生物檢定證明它們不能起保護作用(Hoke和McCown，Personal Communication)這也許是由于沒有糖苷化、折疊變化或降解的緣故。
現(xiàn)已使用桿狀病毒體系，因為它比較容易操作，而且安全，還因為表達出許多天然形式的旦白質(reviewed by summers等人)。許多病毒抗原也已表達，包括人體免疫缺陷病毒，輪風病毒皰疹(rotavirus herpes)單性病毒和肝炎B病毒。
桿狀病毒表達的HIV-1旦白質形成疫苗的主要成分，該疫苗可用于這種疾病，目前正在人體中進行試驗。
實驗證明，在桿狀病毒感染的草地粘蟲細胞中表達的日本腦炎病毒E糖旦白和多旦白可保護動物抗活的JE病毒。
用桿狀病毒表達的，JEV多旦白或E糖旦白免疫接種鼠，可保護它們抗活的病毒激發(fā)。該桿狀病毒表達的旦白質不僅是抗原，還能在鼠中引發(fā)中和抗體。相反，大腸桿菌表達的旦白質，雖然用單克隆抗體免疫測定表明它們含有中和抗原決定基，但它們不能引發(fā)中和抗體，也不能起保護作用(Hoke and McCown，未公開結果)。
這些結果表明在免疫接種的鼠中存在的中和抗體顯然與保護作用有關。只有接受多旦白或E糖旦白(二者均能刺激中和抗體應答)的那些小鼠被受到保護而免受活的病毒激惹。因此，免疫動物血清中中和抗體試驗可預測免疫原在體內(nèi)引發(fā)保護性免疫的能力。
由JEV多旦白編碼區(qū)的表達所介導的保護作用顯然是由于那些試劑中存在加工處理過的E糖旦白，因為其它主要成分，NS1糖旦白本身不起保護作用(見下文)。
由重組E糖旦白引發(fā)的抗體數(shù)量或親合力以及保護程度比由純化的失活JE病毒粒子引發(fā)的要小。這反映了免疫原的數(shù)量或性質的差異。然而，該結果可能是重組E糖旦白缺少存在于與病毒粒子相關形式的旦白質的某些結構特性。關于這一點，Wengler等人已提出證據(jù)，與另一種黃色病毒的E糖旦白有關的病毒粒子，蜱生腦炎病毒是以三聚體存在的。
由重組NS1糖旦白傳遞的保護性缺失是由于它在草地粘蟲細胞中沒有真正表達。但是，事實上用重組NS1免疫的鼠產(chǎn)生的抗體可與來自JEV感染細胞的這種旦白質反應，對這種可能性尚有爭論，雖然所產(chǎn)生的抗體不屬于如溶細胞的種類，可認為它們是有保護作用的(Schle-Singer)。另一方面，這反映了與黃色熱病病毒或dengue熱病毒感染相比，JEV的發(fā)病機理不同，對NS1的抗體是有保護作用的(schle singer等人;Henchal等人)。例如，只要對NS1的免疫可在后代成熟前消除病毒感染的細胞，那么復制越快的病毒受到的影響越小。應記住JEV是高度親神經(jīng)的，而黃色登革熱病毒一般是親內(nèi)臟的。
總之，實驗結果說明，用重組桿狀病毒感染的草地粘蟲細胞中表達的JEV旦白質是具免疫原性的和有保護作用的。用表達的旦白質刺激的病毒中和抗體是體內(nèi)保護的標記。
權利要求
1.一種重組DNA分子，它包含全長或部分JEV被膜旦白編碼區(qū)。
2.一種重組DNA載體構建物，它包含權利要求1的重組DNA分子和一種病毒載體。
3.權利要求2的一種重組DNA載體構建物，其特征為該病毒載體是一種桿狀病毒載體。
4.權利要求3的重組DNA載體構建物，其特征為該桿狀病毒載體是選自定名為MGS3+1，PUC19，MGS12，MGS3和MGS3+2的載體。
5.一種定名為8302的重組病毒載體。
6.一種定名為8437的重組病毒載體。
7.一種定名為8501的重組病毒載體。
8.一種定名為8929的重組病毒載體。
9.一種定名為8469的重組病毒載體。
10.一種定名為8468的重組病毒載體。
11.一種定名為8650的重組病毒載體。
12.一種定名為8590的重組病毒載體。
13.一種定名為8716的重組病毒載體。
14.一種昆蟲細胞，包含有權利要求1的重組DNA分子。
15.用權利要求5，6，7，8，9，10，11，12和13的重組病毒載體表達的重組JEV被膜旦白質。
16.一種組合物，包含有權利要求15的旦白質和一種醫(yī)藥上可接受的載體。
17.檢測試驗對象中存在日本腦炎病毒的方法，該方法包括使取自試驗對象的合適樣品與權利要求15的重組JEV被膜旦白質相接觸，在合適的條件下生成一種抗體一抗原復合物，檢測所生成的復合物，從而檢測存在的日本腦炎病毒。
18.權利要求17的方法，其特征為該試驗對象是人。
19.權利要求17的方法，其特征為該合適的樣品選自血清、中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織和脊髓液。
20.日本腦炎患者的治療方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求16的組合物。
21.日本腦炎患者的預防方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求16的組合物，以有效預防日本腦炎。
22.權利要求20和21的方法，其特征為該患者是人。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組日本腦炎DNA分子，載體和由它們生產(chǎn)的重組蛋白質。本發(fā)明還提供檢測、免疫和治療感染日本腦炎的對象的方法，該方法包括在合適條件下使用重組日本腦炎蛋白質。
文檔編號C07K14/18GK1052506SQ9010793
公開日1991年6月26日 申請日期1990年8月18日 優(yōu)先權日1989年8月18日
發(fā)明者馬克·A·科克倫, 蓋爾·E·史密夫, 簡·A·塔納西 申請人:微基因系統(tǒng)公司