專利名稱：：用于降低羥考酮和其它組分中雜質邁克爾受體水平的方法用于降低羥考酮和其它組分中雜質邁克爾受體水平的方法
背景技術：
：通常不希望在藥劑、食物或其它可被生命有機體內化的組分中存在作為雜質的邁克爾受體，因為邁克爾受體可以與親核性細胞成分進行細胞毒性反應。尤其值得關心的是邁克爾受體與核酸親核體之間的潛在的基因毒性反應(例如Chem.Res.Toxicol.2004，17,827-838、Chem.Res.Toxicol.1991,4,50-7、EnvironmentalHealthPerspectives19卯,88,99-106)。令人感興趣的是，動物具有用于滅活內化的或代謝產生的邁克爾受體的防御系統(tǒng)。一種這樣的滅活系統(tǒng)涉及邁克爾受體與內源性細胞親核體(還原型谷胱甘肽)的反應，以形成谷胱甘肽加成物(見AdvancesinEnzymeRegulation1993,33,281-296的論述)。最近的研究(Bioorg.Med.Chem.1999，7，2849-2855;Chem.Commun.2005,886-888)表明該反應是可逆的。因此，邁克爾受體的基因毒性可能性和致癌可能性反映了邁克爾受體未能成功地與谷胱甘肽完全反應或者反映了逆轉的硫醇加成反應。從而，有必要將存在于藥物和其它意欲施用給生命有機體的產物中的邁克爾受體雜質(或邁克爾受體前體)的量最小化。最近>^開的名稱為"Processforpreparingoxycodonehydrochloridehavinglessthan25PPM14-hydroxycodeinone，,的專利申請(20050222188A1)描述了從鎮(zhèn)痛組分羥考酮中去除邁克爾受體14-羥可待因酮的方法，所述方法涉及在酸性溶液中氫化含有雜質14-羥可待因酮的羥考酮鹽酸鹽組分。盡管已經存在如20050222188A1(以及別處)所述的用于除去和檢測邁克爾受體雜質的技術，繼續(xù)改進仍將提高藥物和其它由生命有機體消耗的組分的安全性。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個方面涉及所附權利要求中所述的方法。本發(fā)明涉及從藥物或其它含有可被生命有機體內化成分的組分中或者從可與意欲由生命有機體內化的成分相接觸的組分中除去邁克爾受體和/或其前體的方法，其中在足以除去邁克爾受體和硫醇-邁克爾加成物的條件下，利用含巰基化合物處理所述組分。當下文提及方法時，應當理解可使用本文所述的任何方法。在一個方面，本發(fā)明提供一系列方法。一種方法包括從組分中除去至少一種邁克爾受體，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適用于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在足以除去至少一種邁克爾受體和/或硫醇-邁克爾加成物的至少部分的條件下利用含巰基化合物處理所述組分，所述硫醇-邁克爾加成物可通過含巰基化合物與至少一種邁克爾受體的加成反應形成。本發(fā)明的另一種方法包括從組分中除去至少一種邁克爾受體，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適用于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在足以與至少一種邁克爾受體反應的條件下利用合適的可溶性含巰基化合物處理所述組分，并且從所述組分中除去所得硫醇-邁克爾加成物和未反應的含巰基化合物，其中所述含巰基化合物根據其形成可從所述組分中除去的可溶性硫醇-邁克爾加成物的能力進行選擇，所述硫醇-邁克爾加成物可從所述組分中除去，并且在需要時可以被定量以便確定所述組分中邁克爾受體的含量。在本發(fā)明的方法中，利用被固定到固體載體上的適當^!L醇處理所述組分。所述組分選自下述組分之一或其任意組合羥考酮、氫可酮、羥嗎啡酮、氫嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽、相關生物堿或其可接受的鹽。本發(fā)明的方法包括生成產物，其中任何單一邁克爾受體或其鹽的量都不超過5ppm，或者不超過10ppm或25ppm?？芍苽溥@樣的產物中，其中任何單一硫醇-邁克爾加成物或其鹽的量都不超過25ppm。還可制備這樣的產物，其中含有羥考酮或其可接受的鹽，而14-羥可待因酮或其鹽的量小于25ppm、小于10ppm、小于5ppm、或小于lppm?？芍苽浜辛u考酮或其可接受鹽的產物，其中含有的14-羥可待因酮或其鹽的量小于lppm?？芍苽浜屑{曲酮或其可接受鹽的產物，其中含有的7，8-脫氫納曲酮或其鹽的量小于25ppm、小于10ppm、小于5ppm、或小于lppm。本發(fā)明的方法還包括定量至少一種邁克爾受體，其中測量>5危醇-邁克爾加成物的量并與組分的邁克爾受體含量相關聯，其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限是10ppm或更小，或其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限在0.001至10ppm的范圍內。本發(fā)明的方法還包括定量下述組分之一或其任意組合中邁克爾受體的含量，羥考酮、氫可酮、羥嗎啡酮、氫嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽，相關生物堿或其可接受的鹽；其中測量硫醇-邁克爾加成物的量并將之與所述組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限是10ppm或更小，或l卯m或更小，或在0.001至10ppm的范圍內。本發(fā)明的方法還包括定量羥考酮或其可接受鹽的14-羥可待因酮含量，其中14-羥可待因酮的硫醇-邁克爾加成物之量被測量并與組分的14-羥可待因酮含量相關聯，并且其中14-羥可待因酮雜質水平的定量極限是10ppm或更小，或lppm或更小，或在0.001至10ppm的范圍內。在本發(fā)明的方法中，所述感興趣組分可以是水中溶解度隨pH增加而降低的有機堿；并且其中在適當pH值的水溶液中利用適當的含巰基化合物處理所述感興趣組分以便(與雜質邁克爾受體)形成可溶性硫醇-邁克爾加成物；并且其中隨后通過提高pH到適當值使所述感興趣組分從可溶性硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀，由此從所述硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中分離所述感興趣的有機堿。在本發(fā)明的方法中，所述感興趣組分可以是水中溶解度隨pH降低而降低的有機酸；并且其中在適當pH值的水溶液中，利用適當的含巰基化合物處理所述感興趣組分以便(與雜質邁克爾受體)形成可溶性硫醇-邁克爾加成物；并且其中通過隨后降低pH到適當值使所述組分從可溶性硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀，由此從所述硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中分離所述感興趣的有機酸。在本發(fā)明的方法中，可通過利用水和/或其它溶劑的選擇性沉淀和/或萃取、和/或通過選擇性吸附到介質上而將所述感興趣組分從硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中分離，所述介質例如為但不限于離子交換樹脂和/或其它固體載體，其中所含有固定化配體金屬離子和/或固定化馬來酰亞胺和/或固定化活性二^t化物和/或固定化抗體和/或固定化酶。本發(fā)明的另一種方法包括從組分中除去至少一種邁克爾受體和/或至少一種邁克爾受體水合物，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適用于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在通過將至少一種邁克爾受體水合物轉化成邁克爾受體而足以除去所述至少一種邁克爾受體7jc合物的條件下，利用酸催化劑處理所述組分；然后在足以從所述組分中除去未反應含巰基化合物、至少一種最初存在于所述組分中的邁克爾受體、和由所述至少一種邁克爾水合物形成的邁克爾受體的條件下，利用適當的可溶性含巰基化合物處理所述組分；并且其中所述含巰基化合物根據其形成可溶性硫醇-邁克爾加成物的能力進行選擇，所述可溶性硫醇-邁克爾加成物可以從所述組分中除去并且在需要時可以被定量以便確定所述組分中邁克爾受體水合物含量和邁克爾受體含量。在本發(fā)明的此方法或其它方法中，所述方法可包括制備含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基羥考酮(hydroxyoxycodone)或其鹽的量小于100ppm、或小于10ppm、或小于5ppm。在本發(fā)明的此方法或其它方法中，所述方法可包括制備含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基納曲酮(hydroxynaltrexone)或其鹽的量小于100ppm、或小于10ppm、或小于5ppm。本發(fā)明還提供一系列產物，所述產物可根據本文所述方法進行制備、或者可以是基本上相似于或等同于可通過本發(fā)明方法制備的產物的那些產物。任何本文所述的產物或可由本文所述方法產生的產物都包括在本發(fā)明的范圍內。具體實施例方式本發(fā)明涉及從含有可被生命有機體內化的成分的藥物或其它組分中或者從含有可能與意欲被生命有機體內化的成分相接觸的組分中除去邁克爾受體和其前體的方法，其中在足以除去邁克爾受體和硫醇-邁克爾加成物的條件下利用含巰基化合物處理所述組分。當下文提及方法時，應當理解可適用于本文所述的任何方法。本文所用的定義"邁克爾受體"意指a，J3-不飽和親電體，例如但不限于a，(3-不飽和羰基衍生物或a，(3-不飽和腈。應當理解在定義邁克爾受體的情景中"親電體"意指能接受電子對；"a,P-不飽和親電體"意指一類化合物，其中包括但不限于a，p-不飽和羰基衍生物、a，p-不飽和腈、a,P-不飽和砜、或被強吸電子基團例如但不限于硝基取代的其它乙烯基衍生物；"a，p-不飽和羰基衍生物"意指一類化合物，其中包括但不限于a，j3-不飽和酮、醌或其衍生物、a，j3-不飽和醛、a,P-不飽和羧酸衍生物，例如但不限于酯、酰胺、取代酰胺或馬來酰亞胺或其衍生物。除了如在術語"硫醇官能化，，的語境中表示硫醇部分或硫醇基團以外，"硫醇"或"含巰基化合物"意指含巰基的化合物。本領域一般技術人員知道"硫醇"是含硫化合物，一般指含硫有機化合物。"硫醇-邁克爾加成物，，意指含巰基化合物與邁克爾受體的加成反應形成的硫醚或硫醚混合物。"巰基-硫醇-邁克爾加成物"意指當邁克爾受體與過量二硫醇或多硫醇(含有至少兩個巰基的化合物)反應時形成的巰基-硫醚或巰基-硫醚混合物。在本發(fā)明的情景中，"邁克爾受體前體"意指在與其可能存在的環(huán)境一致的條件下可轉化為邁克爾受體的任何物質(包括硫醇-邁克爾加成物或邁克爾受體水合物)。例如，在藥劑或其它治療劑的情景中，無論在施用給對象之前或之后，在藥物組分或治療組分的合成、形成、儲存和/或使用期間，邁克爾受體前體是在藥物組分或治療組分可以存在的條件下可轉化為邁克爾受體的物質。邁克爾受體水合物是邁克爾受體前體的一個實例。"邁克爾受體水合物"意指將水與a,P-不飽和親電體例如但不限于|3-羥基酮的加成產物。"加工組分"或"加工產物"意指已經過本發(fā)明方法處理的組分。"HPLC"意指高效液相色鐠。"PPM"或"ppm"意指每百萬重量份中的份數。"允許速率，，意指與制備有定價竟爭力的加工產品所需制造周期一致的速率。"適當的硫醇"或"適用于除去邁克爾受體和/或前體的硫醇"意指能有效除去邁克爾受體和硫醇-邁克爾加成物以便能制備有定價竟爭力的加工產物的含巰基化合物。本文描述了選擇適當含巰基化合物的考慮因素和方法。本文所用的"除去"或"去除"意指減少至少一種邁克爾受體和/或相應的硫醇-邁克爾加成物的量和/或含巰基化合物的量，或所述量的減少。在一組實施方案中，此類物質被除去至原來的五分之一、十分之一、二十分之一、四十分之一、六十分之一、百分之一、五百分之一或更少。在另一組實施方案中，除去包括從組分中以足以檢測到此類物質的存在、濃度和/或量的量除去此類物質。當涉及操作時，本文所用的"分離"包括將一種或多種組分分成兩個或更多個部分，其中某些成分在一個部分中富集而另一些成分在另外的部分中富集，包括從至少一個部分中基本上完全清除某些成分的情形。例如，當各成分在兩相(例如，兩種不混溶的液體，或固體沉淀和液相)中分配時，一種或多種成分的含量在一相中富集而在另一相中被清除。應當理解，被富集在一相中的組分仍可以存在于其它相中，雖然水平更低。本領域一般技術人員應當理解，"可被生命有機體內化的組分"包括但不限于食物、藥品等。本領域一般技術人員應當理解，"可與適用于被生命有機體內化的物質相接觸的組分"包括但不限于藥物遞送裝置、食物包裝、以及其它通過此類物質的制備、儲存或使用而常規(guī)地或可能常規(guī)地與被生命有機體內化的組分相接觸的組分和/或物質。"可與核酸反應的邁克爾受體(或親電體)"包括能不利地與核酸相互作用的物質種類，例如可參與與核酸親核體的潛在地有基因毒性的反應的物質種類。邁克爾受體與有機硫醇反應形成硫醇-邁克爾加成物是大量文獻證明的反應(Chem.Commun.2005,669-671以及其中引用的文獻)。已顯示該反應在水和有機溶劑中進行。酸性催化劑和堿性催化劑都已被用于促進硫醇-邁克爾加成物的形成和將副反應最小化。文獻證明硫醇-邁克爾加成物的形成具有可逆性(Bioorg.Med.Chem.1999，7,2849-2855;Chem.Commun.2005，886-888)，提示利用硫醇試劑除去組分中邁克爾受體以制備其中所述邁克爾受體水平降至二十分之一或更低的產物是令人懷疑的。然而，本發(fā)明(包括所附實施例和權利要求)的教導顯示如何在一些實施方案中將邁克爾受體水平降低20倍以制備邁克爾受體水平低于10ppm或本文所述其它水平的加工產物；此外，本發(fā)明(包括所附實施例和權利要求)的教導還顯示如何在10ppm或更低水平或在本文所述其它水平的定量極限下定量邁克爾受體水平。公開的文獻(Bioorg.Med.Chem.19997，2849-2855;Chem.Commun.2005,886-888)表明在水溶液中，隨著pH升高，由于硫醇鹽陰離子的形成增加，硫醇與邁克爾受體的加成反應速度增加。因此，在本發(fā)明觀測到的形成硫醇-邁克爾加成物(TM)的假一級速率常數KR應當隨總硫醇濃度([T產[TH]+[T)、邁克爾受體濃度[M、以及氫離子濃度[H+而變化，符合以下方程式其中ks-是硫醇鹽陰離子(T-)與邁克爾受體(M)反應的速率常數，Ksh是硫醇(TH)的酸解離常數。根據微觀可逆性定律，硫醇-邁克爾加成物中硫醇鹽陰離子的消除速率取決于以負碳離子存在的疏醇_邁克爾加成物的份數。因此，可通過下述三步反應路徑描述總反應的進行。反應路徑的第一步和第三步包括在熱力學有利方向上呈現為擴散控制的質子轉移反應，而第二步中加成物的形成和分解速率表現為總反應路徑的速率決定步驟。當然，邁克爾受體與硫醇鹽陰離子的加成反應的速率和平衡位置將自然反映所述硫醇鹽陰離子和所述邁克爾受體的特性。這些理由說明了硫醇、邁克爾受體和硫醇-邁克爾化合物的平衡速率隨pH增加而增加的觀察結果。然而，平衡時加成物形成的程度隨pH增加而降低的觀察結果(Bioorg.Med.Chem.1999,7,2849-2855)還沒能定量地加以解釋。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage14</formula>從總反應的方程式以及總反應和巰基電離的平衡表達式KR=岡/[TH][M]KSH=[T"〗[H]/阿得出岡糊=KR[T〗t/(l+KSH/[Hl).作為本發(fā)明的貢獻，該表達式首次允許定量預測硫醇-邁克爾加成物[TM]和邁克爾受體[M的平衡濃度比對氫離子濃度的依賴性。此表達式與本文所述KR的表達式一起教導了氫離子濃度降低是怎樣降低硫醇-邁克爾加成物形成程度和提高加成物形成速率的，并且使得有可能設計用于從羥考酮和其它組分中除去邁克爾受體的本發(fā)明方法。羥考酮是一種半合成阿片，通過下述方案將天然產物二甲基嗎啡經氧化轉化成14-羥可待因酮而制得。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage15</formula>—二甲基嗎啡14-羥可待因酮羥考酮羥考酮前體14-羥可待因酮是一種經常污染羥考酮制劑的邁克爾受體。本發(fā)明除去邁克爾受體的方法可用于除去羥考酮中的14-羥可待因酮。所述方法包括利用硫醇處理羥考酮以便將14-羥可待因酮轉化成硫醇-邁克爾加成物。在本發(fā)明的一個實施方案中，在適當pH的水中進行此反應。選擇pH以便同時得到適于制備有定價竟爭力羥考酮加工產品的適度濃縮的均質羥考酮溶液和合理的反應速率。在本發(fā)明的某些實施方案中，為了在水中形成硫醇-邁克爾加成物，選擇水溶性的硫醇以便形成能將邁克爾受體含量降低至小于10卯m的硫醇-邁克爾加成物。根據本發(fā)明，在其它的實施方案中，邁克爾受體的含量被降低至小于2000、1000、500、200、100、50、25、10、5、2、1、0.5或0.25ppm。本發(fā)明還可將邁克爾受體水平降低20倍以上，例如至少40倍、至少60倍、至少80倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、或至少2000倍。在本發(fā)明的純化羥考酮的一個應用中，在室溫和pH6時利用20mM巰基乙酸鈉和2MmEDTA(用于抑制由痕量金屬離子催化的硫醇氧化反應)處理7.5。/。羥考酮溶液2.8小時。有關羥考酮溶解度按照下述關系式隨氫離子濃度[H+1增加而增加的知識,溶解羥考酮的總濃度-[Oxys+[OxyH+]=[Oxys(l+[H+]/K)，其中[OxyL是羥考酮游離堿的溶解度，并且K是羥考酮共軛酸(OxyH+)的酸解離常數。基于上述公開的KR、硫醇濃度和氫離子濃度之間的關系以及對反應速率隨溫度而增加的理解，結合本文公開的內容，本領域技術人員能夠有效地確定其它期望的反應條件。例如，可通過降低pH而在實際上更高的羥考酮濃度下進行均質反應以增加可得到的溶解羥考酮的量。為了補償較低pH下較低的反應速率，本領域技術人員在本文所迷因素的指導下，如果需要的話，可適當地增加硫醇的濃度、和/或溫度、和/或反應時間。利用已知的分析方法，例如利用與監(jiān)測流出流性質(例如吸光度、熒光、光散射、電導、折射率或質鐠)的系統(tǒng)連接的高效液相色譜或氣相色鐠，本領域技術人員可在酸淬反應混合物中定量硫醇-邁克爾加成物的增加，并且由此將邁克爾受體轉化為硫醇-邁克爾加成物的時間依賴性表征為硫醇結構、硫醇濃度、反應介質和溫度的函數。例如，如果邁克爾受體在大于10倍摩爾量的疏醇存在下反應并且保持以硫醇鹽陰離子存在的硫醇份數恒定(在水中，通過添加酸或堿維持恒定的pH;在有機溶劑中，通過在反應期間添加有機酸或有機堿或其混合物維持恒定的pH)，本領域技術人員可確定形成硫醇-邁克爾加成物的假一級速率常數。因為所述的假一級速率常數與本文所述的硫醇鹽陰離子濃度成正比同時又是硫醇結構和溫度的函數，通過對少數反應的假一級速率常數的測量，能夠有效地選擇適當的疏醇、適當的硫醇濃度、適當的pH(對于水中的反應)或堿(對于有機溶劑中的反應)、適當的時間和適當的溫度以便得到可接受的硫醇-邁克爾加成物轉化程度。含有20mM硫醇和0.110%以硫醇鹽陰離子存在的硫醇(通過適當調整pH(對于在水中的反應)或添加適當的堿(對于在有機溶劑中的反應)得到)、以及〈2mM邁克爾受體的反應混合物，在存在或不存在所述組分的情況下，通常是篩選最佳反應條件的合適起點。在本發(fā)明的某些實施方案中，在形成>危醇-邁克爾加成物之后，可以從>5危醇-邁克爾加成物和/或過量>5克醇中除去所述組分。該大量的去除可以是例如改變組分使其適于人類消費或其它臨床用途，或者其他量的去除(例如更小量)可以用于檢測/測定組分中邁克爾受體的存在和/或量。反應中所用的適當硫醇包括但不限于本文(包括所附權利要求)所迷的那些。如下迷段落的討論以及實施例和所附權利要求中的說明，硫醇的適當性取決于所述組分和所述硫醇的應用情形。適當的硫醇是可以有效地從所迷組分中除去并且能形成可以有效地從所述組分中除去的硫醇-邁克爾加成物、以及形成可在除去所述組分中的硫醇-邁克爾加成物所用的條件下很少或不再轉化回邁克爾受體的硫醇-邁克爾加成物、并且在內化之后基本上不再轉化回邁克爾受體(在不能充分地除去所述組分中的所述硫醇-邁克爾加成物的情形下)。在所述硫醇-邁克爾加成物保留在加工組分中的情形下，需要證明在所述加工組分的貨架壽命期間，對于有能力檢查食物或藥物或醫(yī)療設備安全性的個人和機構而言，不必擔心由留在加工組分中的硫醇-邁克爾加成物構成的硫醇-邁克爾加成物的量。可通過測量硫醇-邁克爾加成物濃度的時間依賴性降低來評價硫醇-邁克爾加成物在具體介質(例如被考慮用于從硫醇-邁克爾加成物中分離所述組分的介質、或內化之后硫醇-邁克爾加成物可能接觸的生理流體)中的穩(wěn)定性或儲存期間的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的某些實施方案中，制備邁克爾受體水平小于100ppm、10ppm、5ppm、2ppm、lppm、0.5ppm、O.lppm或O.Olppm以及疏醇-邁克爾加成物水平小于500ppm、100ppm、10ppm、5ppm、2ppm、lppm、0.5ppm、O.lppm或O.Olppm的加工產物。本發(fā)明的實施方案包括以下方法其中選擇可溶性的含巰基化合物以便形成可有效地從組分中除去的可溶性硫醇-邁克爾加成物、以及便于定量組分中低水平的邁克爾受體雜質，其中由于所述組分的干擾，所述邁克爾受體雜質難于用其他方法直接測量。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，通過利用適當的含巰基化合物處理組分、從所述組分和/或含巰基化合物中除去硫醇-邁克爾加成物以便能夠定量所述硫醇-邁克爾加成物、并將硫醇-邁克爾加成物的量與所述組分中的邁克爾受體相相關聯，可以測定組分中邁克爾受體含量。本領域技術人員可利用已知的分析方法，例如利用與監(jiān)測流出流性質(例如流出流的吸光度、熒光、光散射、電導、折射率或質鐠)系統(tǒng)連接的高效液相色鐠或氣象色鐠來定量硫醇-邁克爾加成物。因此，本發(fā)明的某些實施方案以小于100ppm、10ppm、5ppm、lppm、O.lppm和O.Olppm的定量極限來定量所述加工組分和未加工組分中的邁克爾受體的水平。在本發(fā)明的實施方案中，其中在形成硫醇加成物之后，將所述硫醇-邁克爾結合物和/或過量硫醇從所述組分中除去，選擇硫醇以便使所述硫醇-邁克爾加成物具有不同于所述組分的特性。這些特性包括但不限于在適當pH值下在有機溶劑或水/有機溶劑混合物、或水中的不同溶解度、和/或對離子交換樹脂和/或其它固體介質(包括例如含固定化二硫化物的化合物、含固定化馬來酰亞胺的化合物)的不同親合力、和/或對固定化抗體或其片段、或固定化酶或其片段的不同親合力。下面的描述將很好地闡明如何根據本發(fā)明的教導選擇適當的含巰基化合物。在用于除去羥考酮中14-羥可待因酮的方法的一個實施方案中，當石危醇-邁克爾加成物在約pH6下形成之后，將反應混合物的pH升高以便從水溶液中沉淀和/或萃取羥考酮游離堿并且使大多數所述硫醇-邁克爾加成物和過量巰基乙酸鈉保留在水溶液中。已經提及的羥考酮在水中溶解度的pH依賴性的表達式表明堿性pH有利于羥考酮游離堿的有效沉淀和/或萃取。本發(fā)明教導中公開的關系式[TM/[M卜Kr[1V(1+Ksh/[H+)表明當使用巰基乙酸鈉(pKSH10.3)時，將pH升高到9將導致少量的硫醇-邁克爾加成物(在pH6下形成，其時羥考酮是可溶的)轉化回14-羥可待因酮。利用pKSH10.3的硫醇，將pH從6升高到9，[TM/[M]平衡比將僅僅降低5%。因此，在pH6非殺有利于在特定硫醇濃度下形成硫醇-加成物的條件下，pH從6升高到9，邁克爾受體的含量將僅僅增加5%。然而，利用pK9的硫醇將導致[TM/[M]平衡比在pH從6升高到9時降低兩倍。當然，降低用于沉淀或萃取羥考酮的pH將降低逆反應程度，但由于pH降低將增加羥考酮在水中的溶解度，回收羥考酮產物也將變得更加困難。在本發(fā)明的實施例中舉例說明了利用更低pH沉淀和/或萃取羥考酮的方法和/或利用更低pK的石危醇的方法。令人感興趣的是，盡管5-巰基-2-硝基-苯曱酸(pK4.8)不易兼容于從來自含有由5-巰基-2-硝基-苯甲酸形成的硫醇-邁克爾加成物的堿溶液中沉淀和/或萃取羥考酮的方法，但是此含巰基化合物可用于利用其它手段從硫醇-邁克爾加成物和未反應硫醇中除去邁克爾受體的方法(尤其是涉及組分中邁克爾受體雜質定量的方法)。因此，在本發(fā)明的某些實施方案中，利用含巰基化合物處理之后，通過但不限于下述操作之一或其任意組合從硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中基本上除去所述組分通過調節(jié)溶液pH引起的從水溶液中的選擇性沉淀；當適當時通過調節(jié)水溶液的pH(利于萃取)、硫醇含量(抑制硫醇-邁克爾受體分解)以及鹽含量(利于相分離)從水溶液選擇性地萃取到與水不互溶的溶劑中；通過添加一種或多種與水互溶的有機溶劑選擇性地從水溶液中沉淀；在適當pH和硫醇含量下選擇性地從與水不互溶的有機溶劑中萃取到水溶液中；通過添加水溶液選擇性地從與水互溶的有機溶劑中沉淀；通過添加第二種有機溶劑或有機溶劑混合物選擇性地從有機溶劑或有機溶劑混合物中沉淀；高效液相色鐠；或選擇性吸附到包含但不限于下述固體介質之一或其任意組合的固體介質上或與之反應離子交換樹脂、利用馬來酰亞胺部分官能化的固體介質、利用活性二硫化物官能化的固體介質、利用螯合金屬離子官能化的固體介質、或含有固定化蛋白質的固體介質。在本發(fā)明的其它實施方案中，才艮據所述組分和邁克爾受體的性質，利用含巰基化合物形成可有效地從所述組分中除去的硫醇-邁克爾加成物，所述含巰基化合物例如為但不限于巰基乙酸、2-巰基乙磺酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸、巰基琥珀酸、巰基甘油、2-氨基乙硫醇、二硫醇(例如但不限于乙二硫醇、二硫蘇糖醇)、還原的硫辛酸(當希望形成巰基-硫醇-邁克爾加成物時)、或固定在固體栽體上的含巰基化合物。含有固定化硫醇的固體載體通常用于螯合重金屬離子并可商業(yè)購得。還可通過含有固定化N-羥基琥珀酰亞胺酯或對硝基苯酯或其它胺活性酯與氨基硫醇(例如但不限于谷胱甘肽、2-氨基乙硫醇、或半胱氨酸)反應，或通過利用有機卣化物或馬來酰亞胺官能化的固體介質與二硫醇(例如但不限于乙二硫醇或還原態(tài)的硫鋅酸)反應得到硫醇官能化的固體介質。應當著重指出的是，最適用于某方法的硫醇的選擇可能需要該方法詳細的成本分析，所述成本分析應當考慮到某些可溶性含巰基化合物可能允許更短的制造周期、可能成本更低、以及可能易于測定邁克爾受體水平，而且某些硫醇官能化的固體介質可能提供更方便地除去硫醇-邁克爾加成物。本發(fā)明的某些實施方案包括從由水中溶解度隨pH增加而降低的有機堿例如羥考酮組成的組分中除去邁克爾受體。這樣的實施方案可包括利用適當的可溶性含巰基化合物(例如但不限于巰基乙酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、2-巰基乙基磺酸鈉、5-巰基-2-硝基-苯甲酸、或N-丹磺酰半胱氨酸)處理所述組分，以及(在適當pH的水溶液中)形成可溶性硫醇-邁克爾加成物。通過將pH升高到適當值可以從可溶性硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀所述的有機堿。此外，可能還需要單元操作以便從沉淀的組分中除去共沉淀的硫醇-邁克爾加成物。本發(fā)明的其它實施方案包括從水中溶解度隨pH降低而降低的組分(例如有機酸)中除去邁克爾受體。這樣的實施方案可以包括利用適當的可溶性含巰基化合物(例如但不限于半胱氨酸鹽酸鹽、2-巰基乙基磺酸鈉、或2-氨基乙硫醇)處理所述組分，以及(在適當pH的水溶液中)形成可溶性疏醇-邁克爾加成物。通過將pH降低到適當值可以從可溶性疏醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀所述有機組分。此外，可能還需要單元操作以便從沉淀的組分中除去共沉淀的硫醇-邁克爾加成物。本發(fā)明的其它實施方案可包括除去雜質邁克爾受體，其中因為所述組分在水中的溶解度低，所以希望在非水溶劑中進行反應。這樣的情況可以包括利用適當的硫醇處理所述組分以便從所述組分中除去所述硫醇和/或硫醇-邁克爾加成物。硫醇(例如但不限于2-氨基乙硫醇)可以是適用于本發(fā)明這些實施方案的硫醇，由于2-氨基乙疏醇可形成可萃取到酸水溶液中的硫醇-邁克爾加成物，因此可從水不溶性的所述組分中除去所述硫醇-邁克爾加成物。此外，可能還需要單元操作以便從沉淀組分中除去共沉淀的硫醇-邁克爾加成物。本發(fā)明的又其它實施方案包括檢測和除去邁克爾受體水合物。在邁克爾受體前體顯著地轉化成邁克爾受體的情況下，可能期望從組分中除去所述邁克爾受體前體。本發(fā)明的某些實施方案包括通過利用酸性催化劑處理使邁克爾受體水合物轉化成邁克爾受體，以及隨后利用本發(fā)明教導將所述邁克爾受體轉化成硫醇-邁克爾加成物以便除去和/或定量所述邁克爾受體。所附實施例舉例說明了將本發(fā)明方法用于降低羥考酮以及相關組分中邁克爾受體水平和/或用于定量在羥考酮以及相關組分中的邁克爾受體水平的應用。所附實施例與本發(fā)明的其它教導一起(包括所附權利要求)使本領域技術人員能夠將本發(fā)明實施方案應用于未被實施例具體舉例說明的情況。本發(fā)明的這些另外實施方案包括但不限于以下情況邁克爾受體和所述組分選自但不限于一個或多個下述實例i.邁克爾受體是丙烯晴；以及所述組分通過利用丙烯晴的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分苯乙烯-丙烯晴、以及丙烯晴-丁二烯-苯乙烯、以及丙烯晴-甲基丙烯酸甲酯聚合物。ii.邁克爾受體是丙烯酰胺；以及所述組分通過利用丙烯酰胺的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分聚丙烯酰胺及其共聚物。iii.邁克爾受體是丙烯酸甲酯；以及所述組分通過利用丙烯酸曱酯的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分維生素B1、聚(丙烯酸曱酯)及其共聚物。iv.邁克爾受體是丙烯酸乙酯；以及所述組分通過利用丙烯酸乙酯的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分聚(丙烯酸乙酯)及其共聚物。v.邁克爾受體是曱基丙烯酸甲酯；以及所述組分通過利用甲基丙烯酸曱酯的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分聚(甲基丙烯酸甲酯)及其共聚物。vi.邁克爾受體是丙烯酸-2-乙基己酯；以及所述組分通過利用丙烯酸-2-乙基己酯的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分聚(丙烯酸-2-乙基己酯)及其共聚物。vii.邁克爾受體是巴豆醛；以及所述組分通過利用巴豆醛的方法制備并且選自但不限于一種或多種下述組分2-乙基己醇、丁醛和喹哪啶。viii.邁克爾受體是甲基乙烯基酮；以及所述組分通過利用曱基乙烯基酮的方法制備并且可選自但不限于維生素A。ix.邁克爾受體是丙烯醛；以及所述組分是香煙、雪茄或煙斗煙。除非另外指出，下述實施例中的所有操作在室溫下進行。實施例1A從羥考酮組分中除去14-羥可待因酮該實施例描述了利用20mM巰基乙酸鈉在pH6處理含有大于300ppm但是小于1000ppm的14-羥可待因酮的羥^"酮游離堿組分，以便(與其它操作一起)實現14-羥可待因酮和硫醇-邁克爾加成物的去除，以及制備含有小于10ppm的14-羥可待因酮的加工產物。將含有大于300ppm14-羥可待因酮的羥考酮樣品溶解在pH6.0的水中以制備7.5%溶液(75mg/mL)，其中利用4MHC1實現羥i酮的中和以及在pH6下的溶解。加入足量的固體EDTA和固體巰基乙酸鈉4吏得這些成分在反應混合物中的濃度分別為2mMEDTA和20mM巰基乙酸鈉。室溫下將pH維持在pH6.0下2.8小時，然后將反應混合物升高到pH9以便從含有巰基乙酸鹽-邁克爾加成物和過量巰基乙酸鹽的溶液中沉淀幾考酮。沉淀的幾考酮用pH9的0.05M碳酸氬鈉緩沖液洗滌，然后溶解在乙酸乙酯中。用pH9的0.05M碳酸氫鈉緩沖液萃取羥考酮的乙酸乙酯溶液，減壓下除去乙酸乙酯得到含有小于10ppml4-羥可待因酮的羥考酮。實施例1B利用20mM巰基乙酸鈉從羥考酮組分中除去14-羥可待因酮該實施例描述了利用20mM巰基乙酸鈉處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分，以便(與其它操作一起)將組分中的14-羥可待因酮含量降低800倍以上，以及制備14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸的總量小于5卯m的加工產物。將含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮(5.0g,15.9mmo1)溶解在50mL0.33NHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.1~6.2。待添加碳酸鈉期間沉淀的所有羥考酮溶解后，加入巰基乙酸鈉作為含巰基化合物(0.114g，lmmol)。攪拌所得的溶液l小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(1.5g，14.2mmo1)。約6分鐘后(溶液的pH增加到約7.6),將羥考酮懸浮液萃取到乙酸乙酯(250mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和50mL的20mM巰基乙酸鈉水溶液20分鐘。分離巰基乙酸鈉洗液后，用50mL水洗滌羥考酮的乙酸乙酯溶液，與50mL0.33NHC1—起攪拌30分鐘以將羥考酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約22mL)將pH升高到9.1~9.3以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用25mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到4.7g(94%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(硫醇-邁克爾加成物)的總量小于5卯m(見實施例2~3)。實施例2實施例1B的羥考酮產物中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸總量的測定將實施例1B的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在0.2NHCl(10mL)中。攪拌下加入乙二胺四乙酸(EDTA)(0.005g，0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.1~6.2以溶解所有沉淀的羥考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g，0.22mmo1)。在分開的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1.5小時后，用1M碳酸鈉(約1.6mL)將溶液的pH升高到8.2~8.4，用二氯曱烷(2xl5mL)將懸液萃取到30mL分液漏斗中。分離水層并用1NHCl(1.7mL)酸化至pH2.6~3.6。在30~40。C下，將水溶液(15~16mL)的預定體積的等份(2mL)在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/7JC(200pL)中。通過HPLC分析溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮的量(卯m，即每克羥考酮中添加的l畚羥可待因酮微克數)的圖計算的14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸的總量是4.3卯m。<image>compleximageseeoriginaldocumentpage23</image>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)重量與被分析羥考酮重量的比值(ppm)。實施例3實施例1B中羥考酮產物的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸的含量測定將實施例1B的羥考酮產物(0.51g，1.6mmo1)溶解在二氯甲烷(3mL)中并用水(3mL)萃取溶液。含水萃取物的等份(lmL)用1NHCl(IOjaL)酸化并在30~40'C下，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸干，將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(200pL)中，并通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。樣品中2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸的含量等于或小于O.lppm。實施例4實施例1B中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定從實施例2中測定的14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸的總量中減去實施例3中測定的羥考酮產物中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸含量來確定14-羥可待因酮的含量。因此，實施例1中羥考酮產物中的14-羥可待因酮含量是《4,3ppm。實施例5利用20mM的2-巰基乙磺酸鈉除去羥考酮組分中的14-羥可待因酮該實施例描述了利用20mM的2-巰基乙磺酸鈉處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分，以便(與其它操作一起)實現將所述組分中14-羥可待因酮的含量降低300倍以上，以及制備其中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的總量小于15卯m的加工產物。將含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮(5.0g,15.9mmo1)溶解在50mL0.33NHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.1~6.2。待添加碳酸鈉期間沉淀的所有羥考酮溶解后，加入2-巰基乙磺酸鈉(0.165g，lmmol)，所得溶液攪拌l小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(1.5g，14.2mmo1)。約6分鐘后(溶液的pH增加到約7.6),將羥考酮懸液萃取到乙酸乙酯(250mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和50mL的20mM2-巰基乙磺酸鈉水溶液20分鐘。除去2-巰基乙磺酸鈉洗液后，羥考酮的乙酸乙酯溶液用50mL水洗滌，并與50mL0.33NHC1—起攪拌10分鐘以將羥考酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約22mL)將pH升高到9.2~9.4以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用25mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到4.7g(94%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的總量小于15ppm(見實施例6~7)。實施例6實施例5中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定將實施例5的羥考酮產物(0.5g,1.6mmo1)溶解在0.2NHCl(lOmL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g,0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.1~6.2以溶解所有的沉淀羥考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g，0.22mmo1)。在分開的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1.5小時后，用1M碳酸鈉(約1.6mL)將溶液的pH升高到8.2~8.4并用二氯甲烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏斗中。分離水層并用1NHCl(1.7mL)酸化至pH2.63.6。在3040。C下，將水溶液(15~16mL)的預定體積的等份(2mL)在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(200nL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每毫克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮微克數)的圖測定的14-羥可待因酮的量是8.7ppm。對照試驗表明在利用巰基乙酸鈉的分析測定期間，包含在該實施例分析物(2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸)中的硫醇-邁克爾加成物和包含在本發(fā)明其它實施例分析物中的硫醇-邁克爾加成物向相應的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸硫醇-邁克爾加成物的轉化是可以忽略的(<15%)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)重量與被分析羥考酮重量的比值(ppm)。實施例7實施例5中羥考酮產物的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的含量測定將實施例5的羥考酮產物(0.5g,1.6mmo1)溶解在二氯甲烷(3mL)中并用水(3mL)萃取溶液l次。含水萃取物的等份(lmL)用INHC1(10nL)酸化，并在30-4or:下，在旋轉霧發(fā)儀上減壓蒸干。將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(200jiL)中并通過HPLC分析樣品，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。由此測定實施例5中制備的羥考酮產物中2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的含量是1.3ppm。實施例8利用40mM的L-半胱氨酸除去羥考酮組分中的14-羥可待因酮該實施例描述了利用40mM的L-半胱氨酸鹽酸鹽處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分以便(與其它操作一起)實現將組分中14-羥可待因酮含量降低500倍以上，并制備了其中14-羥可待因酮和2-(及)-氨基-3-(羥考酮-8-硫烷基)-丙酸的總量小于lOppm的產物。將含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮(5.0g，15.9mmo1)和作為含巰基化合物的L-半胱氨酸鹽酸鹽7JC合物(0.352g，2mmo1)溶解在50mL0.33NHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.0~6.1以溶解所有的沉淀羥考酮。所得溶液攪拌l小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(1.6g，15.1mmo1)。約7分鐘后(溶液的pH增加到約7.6),將羥考酮懸液萃取到乙酸乙酯(250mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和50mL的40mML-半胱氨酸水溶液(pH8.0)45分鐘。除去L-半胱氨酸洗液后，用50mL水洗滌羥考酮的乙酸乙酯溶液并與50mL0.33NHC1—起攪拌10分鐘以將羥考酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約22mL)將pH升高到9.1~9.3以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用25mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到4.65g(93%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮和2-(及)-氨基-3-(幾考酮-8-硫烷基)-丙酸(硫醇-邁克爾加成物)的總量小于5ppm(見實施例9~10)。實施例9實施例8中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定將實施例8的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在0.2NHCl(10mL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g，0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.0~6.3以溶解所有的沉淀羥考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g，0.22mmo1)。在分開的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1小時后，用1M碳酸鈉(約1.4~1.5mL)將溶液的pH升高到8.1~8.6并用二氯曱烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏斗中。分離水層并用INHC1(1.5~1.7mL)酸化至pH3.23.8。在3040。C下，將水溶液(14mL)的預定體積的等份(2mL)在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(400nL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的量為3.0ppm。<image>compleximageseeoriginaldocumentpage28</image>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-碗烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考稱(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)重量與被分析羥考酮重量的比值(ppm)。實施例10實施例8中羥考酮產物的2-(及)-氨基-3-(羥考酮-8-硫烷基)-丙酸含量測定將實施例8的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在二氯甲烷(3mL)中并用水(3mL)萃取溶液1次。將含水萃取物的等份(lmL)用INHC1(lOfiL)酸化并在3040^C下，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸千。將剩余物溶解在0.07%三氟乙酌水(200jiL)中并通過HPLC分析樣品，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。由此測定的實施例8中制備的羥考酮產物中2-(及)-氨基-3-(羥考酮-8-硫烷基)-丙酸的含量是1,6ppm。實施例11利用疏醇官能化的硅膠從羥考稱組分中去除14-羥可待因酮該實施例描述了利用可商業(yè)購得的硫醇官能化的硅膠(其中3-巰基丙醇部分已共價鍵地結合到硅膠上)處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分以便(與其它操作一起)實現將組分中的14-羥可待因酮含量降低500倍以上，并制備其中14-羥可待因酮含量小于5ppm的產物。實施例8中羥考酮的14-HC舍量測定y豕30.31x+91.917截系巨/斜率a3,0ppm36添加的14-HC/Q)cy(ppm>將含有3525ppml4-羥可待因酮的羥考酮(2.0g,6.3mmo1)溶解在80mL0.08NHC1+。攪拌下添加2N氫氧化鈉將所得溶液的pH升高到7.0~7.05。待添加氫氧化鈉期間沉淀的所有羥考酮溶解后，加入硫醇官能化的珪膠(lg,負載1.44mmol/g)用作含巰基化合物(lg,負載1.44mmol/g)。所得溶液攪拌17.5小時，然后過濾。用1M碳酸鈉(約7mL)將7JC層pH升高到9.2以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用10mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到1.89g(94.5%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮含量小于5卯m(見實施例l2)。實施例12實施例11中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定將實施例11的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在0.2NHCl(10mL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g，0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.0~6.2以溶解所有的沉淀羥考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g，0.22mmo1)。在分別的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1小時后，用1M碳酸鈉(約1.5~1.6mL)將溶液的pH升高到8.0~8.3并用二氯甲烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏斗中。分離水層并用INHC1(1.6~1.7mL)酸化至pH2.5~3.4。在3040'C下，在旋轉蒸發(fā)儀上將水溶液(15mL)的預定體積的等份(2mL)減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(400pL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-幾可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的含量是3.4卯m。<image>compleximageseeoriginaldocumentpage30</image>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量和被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例13利用20mMN-乙?；?L-半胱氨酸除去羥考酮組分中的14-羥可待因酮該實施例描述了利用20mM的N-乙酰基-L-半胱氨酸處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分以便(與其它操作一起)實現將組分中14-羥可待因酮含量降低500倍以上，并制備其中14-羥可待因酮含量小于5ppm的產物。將含有3525ppml4-羥可待因酮的羥考酮(5.0g,15.9mmo1)和N-乙?；?L-半胱氨酸(含巰基化合物X0.163g，lmmol)溶解在50mL0.32NHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.0~6.1以溶解所有的沉淀羥考酮。所得溶液攪拌l小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(1.6g，15.1mmo1)。約6分鐘后(溶液的pH增加到約8.0)，將羥考酮懸液萃取到乙酸乙酯(250mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和50mL的20mMN-乙?；?L-半胱氨酸水溶液(pH8.0)20分鐘。除去N-乙?；?L-半胱氨酸洗液后，用50mL水洗滌羥考酮的乙酸乙酯溶液并與50mL0.34NHC1—起攪拌10分鐘以將羥考酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約22mL)將pH升高到9.19.2以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用25mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到4.7g(94%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮含量小于5ppm(見實施例14)。實施例14實施例13中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定將實施例13的羥考酮產物(0.5g,1.6mmo1)溶解在0.2NHCl(10mL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g，0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.0~6.2以溶解所有的沉淀幾考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g,0.22mmo1)。在分別的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1小時后，用1M碳酸鈉(約1.5mL)將溶液的pH升高到8.2并用二氯甲烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏羊中。分離水層并用INHC1(1.6mL)酸化至pH3.5~3.7。在30~40。C下，在旋轉蒸發(fā)儀上將7JC溶液(15~16mL)的預定體積的等份(2mL)減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(400pL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每毫克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(卯m,即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的含量是4.6ppm。實施例13中幾考酮的14-HC含量測定<table>complextableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>添加的14-HC/Oxy(ppm)縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的(wlu/ni&5/搭屯VOH.寸t比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量與被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例15利用40mM的2-巰基乙磺酸鈉除去羥考酮組分中的14-羥可待因酮該實施例描述了利用40mM的2-巰基乙磺酸鈉處理含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮游離堿組分以便(與其它操作一起)實現將組分中14-羥可待因酮含量降低300倍以上，并制備其中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的總量小于10ppm的加工產物。將含有3525ppm14-羥可待因酮的羥考酮(5.0g，15.9mmo1)溶解在50mL0.33NHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.2。待添加碳酸鈉期間沉淀的所有羥考酮溶解后，加入2-巰基乙磺酸鈉(0.33g，2mmo1)，所得溶液攪拌1小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(1.5g，14.2mmo1)。約6分鐘后(溶液的pH增加到約7.8)，將羥考酮懸液萃取到乙酸乙酯(250mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和50mL的20mM的2-巰基乙磺酸鈉水溶液20分鐘。除去2-巰基乙磺酸鈉洗液后，用50mL水洗滌羥考酮的乙酸乙酯溶液并與50mL0.34NHC1—起攪拌10分鐘以將羥考酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約22mL)將pH升高到9.2~9.3以沉淀羥考酮游離堿。收集沉淀，用25mL水洗滌，并在干燥器中減壓干燥得到4.66g(93.2%收率)羥考酮產物，其中14-羥可待因酮和2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的總量小于10ppm(見實施例16~17)。實施例16實施例15中羥考酮產物的14-羥可待因酮的含量測定將實施例15的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在0.2NHC1(10mL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g，0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.1~6.2以溶解所有沉淀的羥考酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g,0.22mmo1)。在分別的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。1小時后，用1M碳酸鈉(約1.5mL)將溶液的pH升高到8.2~8.4并用二氯甲烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏斗中。分離水層并用INHC1(1.6mL)酸化至pH3.2~3.5。在3040。C下，在旋轉蒸發(fā)儀上將水溶液(14.5~16mL)的預定體積的等份(2mL)減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙^/水(400nL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下圖所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm,即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測定的14-羥可待因酮的量是6.0ppm?？v坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量與被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例17實施例15中羥考酮產物的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的含量測定將實施例15的羥考酮產物(0.5g，1.6mmo1)溶解在二氯甲烷(3mL)中并用水(3mL)萃取溶液l次。萃取物水溶液的等份(lmL)用INHC1(10nL)酸化并在3040。C下，在旋轉蒸發(fā)儀上減壓蒸干。將剩余物溶解在0.07%三氟乙l水(200nL)中并通過HPLC分析樣品，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。由此測定的實施例15中制備的羥考酮產物中2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙磺酸的含量是1.6ppm。實施例15中幾考酮的14-HC含量測定y=30.737x+18514^HC=截距/斜率-6.0ppm48添加的14-HC/Oxy<ppm>12o532實施例18降低納曲酮中的7，8-脫氫納曲酮含量該實施例描述了將納曲酮中7，8-脫氫納曲酮含量降低300倍以上，以及通過利用巰基乙酸鈉在水中處理納曲酮制備其中7,8-脫氫納曲酮含量小于5ppm的納曲酮產物。將含有690ppm7,8-脫氫納曲酮的納曲酮(2.0g，5.9mmo1)溶解在20mL(UNHC1中。攪拌下添加1M碳酸鈉將所得溶液的pH升高到6.15。待添加碳酸鈉期間沉淀的所有納曲酮溶解后，加入巰基乙酸鈉(0.046g,0.4mmo1)。所得溶液攪拌l小時，然后在強烈攪拌下向溶液中加入固體碳酸鈉(0.6g，5.7mmo1)。約8分鐘后(溶液的pH增加到約8.1~8.2)，將納曲酮懸液萃取到乙酸乙酯(100mL)中，強烈攪拌乙酸乙酯萃取物和20mL的20mM巰基乙酸鈉水溶液20分鐘。除去巰基乙酸鈉洗液后，用20mL水洗滌納曲酮的乙酸乙酯溶液并與20mL0.34NHC1—起攪拌10分鐘以將納曲酮萃取到酸水溶液中。分離水層并用1M碳酸鈉(約7.5mL)將pH升高到8.8~8.9以沉淀納曲酮。收集沉淀，用4mL水洗滌，并在干燥器中減壓千燥得到1.95g(97.5。/。收率)納曲酮產物，其中7，8-脫氬納曲酮含量小于5ppm(見實施例19)。實施例19實施例18中納曲酮產物的7，8-脫氫納曲酮的含量測定將實施例18的納曲酮產物(0.5g，1.47mmo1)溶解在0.2NHC1(10mL)中。攪拌下加入EDTA(0.005g,0.017mmo1)并利用1M碳酸鈉將溶液的pH升高到6.0以溶解所有沉淀的納曲酮。向均勻反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.025g,0.22mmo1)。1小時后，用1M碳酸鈉(約1.5mL)將溶液的pH升高到8.9并用二氯甲烷(2x15mL)將懸液萃取到30mL分液漏;中。分離水層并用1NHC1(1.6mL)酸化。在3040。C下，在旋轉蒸發(fā)儀上將水溶液(15~16mL)的預定體積的等份(2mL)減壓蒸干并將剩余物溶解在0.07%三氟乙酸/水U00fiL)中。通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。所述7,8-脫氬納曲酮的含量是約lppm。實施例20利用還原量的樣品測定羥考酮產物中14-羥可待因酮的含量下述步驟代表實施例14中所述步驟的改進，其經設計用于可用于分析的羥考酮產物的量是有限的情形。將實施例13的羥考酮產物(100mg，(U17mmo1)置于8mL反應瓶中，并溶解在0.2NHC1(2mL)中，所述反應瓶配有聚四氟乙烯內襯的螺紋帽和小型磁攪拌子。攪拌下加入EDTA(0.001g，0.0034mmo1)并利用1M碳酸鈉水溶液將溶液的pH升高到6.0~6.2以溶解所有沉淀的羥考酮。用pH計完成pH測定，所述pH計具有足夠窄的復合電極(約5mm)以便允許其直接插入樣品瓶+。向均勻的反應混合物中添加巰基乙酸鈉(0.005g，0.044mmol);在分別的尖峰試驗中，在添加巰基乙酸鈉之前引入已知量的14-羥可待因酮。l小時后，用1M碳酸鈉水溶液(約0.07mL)將溶液的pH升高到8.2并通過將二氯曱烷(2x3mL)添加到瓶中、蓋住并強力搖動來萃取懸液。利用巴斯德吸管除去瓶中有機層。用1NHCl(0.3mL)酸化水層并通過旋轉蒸發(fā)將溶液減壓干燥(浴溫30~40'C)。剩余物溶解在0.07%三氟乙酸/水(400pL)中并通過HPLC分析所述溶液的等份，其中用280nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下所示，根據每毫克被分析羥考酮中的2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測的定樣品中14-羥可待因酮的量是4.3ppm。通過該方法測定的14-羥可待因酮的量(4.3ppm)在實施例14中所述相同樣品的測定值<table>complextableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-(羥考酮-8-硫烷基)-乙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量和被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例21利用5-巰基-2-硝基-苯甲酸測定實施例13的羥考酮產物中14-羥可待因酮的含量將實施例13的羥考酮產物(0.300g,0.952mmo1)懸浮在8mL反應瓶(配備帶聚四氟乙烯內襯的螺紋帽和小型磁攪拌子)的0.2NHC1水溶液(3mL)中。加入濃HC1(30pL)徹底溶解固體，添加100mg/mLNa2HP04水溶液(O.llmL)和INHC1水溶液(0.05mL)將pH升高到4.5。用pH計完成pH測定，所述pH計具有足夠窄的復合電極(約5mm)以便允許其直接插入樣品瓶中。該溶液的等份(lmL)用pH4.5的0.05MNaOAc/HOAc緩沖液(O.lmL)稀釋并在一邊靜置；保留剩余物用于分別的尖峰試驗，其中在下一步驟之前加入已知量的14-羥可待因酮。在單獨的反應瓶中，5，5，-二硫代雙(2-硝基-苯甲酸)(lOmg，0.025mmol)完全溶解在pH7的0.05M磷酸鈉緩沖水溶液(5mL)中。加入EDTA(5mg)和二硫蘇糖醇(2.0mg，0.013mmo1)并用100mg/mLNa2HP04水溶液(0.45mL)將所得橙色溶液的pH升高到6.8。攪拌30分鐘后，用25%的醋酸水溶液(0.105mL)將pH降低到4.7并將該溶液的等份(lmL)添加到含有之前制備的羥考酮溶液的瓶中。攪拌卯分鐘后，用濃HCl(15pL)將合并溶液的pH降低至2，通過將二氯甲烷(4x2mL)添加到瓶中、蓋住并強力搖動來萃取所得懸液。利用巴斯德吸管完全除去瓶中的有機層。通過HPLC分析水層，其中在其吸光度325nm下定量流出液中的分析物。如下所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-硝基-5-(羥考酮-8-硫烷基)-苯甲酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的量是4.7ppm。通過該方法測定的14-羥可待因酮的量(4.7ppm)在實施例14中所述相同樣品的測定值(4.6ppm)的10%內。<image>compleximageseeoriginaldocumentpage37</image>縱坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物2-硝基-5-(幾考鯛-8-疏烷基)-笨甲酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-輕可待因酮(14-HC)的重量和被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例22利用5-巰基-2-硝基-苯甲酸測定鞋考酮鹽酸鹽組分中14-幾可待因酮的含量在8mL反應瓶(配有聚四氟乙烯內襯的螺紋帽和小型磁攪拌子)中將5mgEDTA溶解在0.1MNa2HP04水溶液(4.75mL)和O,IMNaH2P04水溶液(0.25mL)中配制pH7.4緩沖液。加入5，5，-二疏代雙(2-硝基-苯甲酸)(9.8mg，0.025n畫l)之后加入二硫蘇糖醇(2.1mg,0.014mmoU,溶液顏色立刻變成橙色。當固體完全溶解時(5分鐘)，用INHC1水溶液(0.35mL)將溶液pH降低到4.5。用pH計完成pH測定，所述pH計具有足夠窄的復合電極(約5mm)以便允許其直接插入樣品瓶中。將幾考酮鹽酸鹽(482mg,1.37mmo1)置于單獨的8mL反應瓶中，向其中加入3.0raL之前配制的溶液,添加1NHCI水溶液UOpL)將溶液的pH降低至4.5,移出l.OmL等份并攪拌。保留剩余物用于分別的尖峰試驗，其中向混合物中加入已知量的14-羥可待因酮。90分鐘后，用濃HC1(lO[iL)將pH降低到2，通過將二氯甲烷(4xlmL)添加到瓶中、蓋住并強力搖動來萃取所得懸液,利用巴斯德吸管完全除去瓶中有機層。通過HPLC分析水層，其中用325nm下的吸光實施例13中羥考酮的14-HC含量測定y=20,391)c+96.4M-HO截距/斜率'4.7ppm246810添加的14-HC/Oxy《ppm)_-_-^-1-o咖咖做o度定量流出液中的分析物。如下所示，根據每毫克被分析羥考酮中的2-硝基-5-(羥考酮-8-硫烷基)-苯甲酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的量是"ppm?？v坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物5-(羥考酮-8-硫烷基)-2-硝基-苯甲酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析幾考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量和被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例23利用N-丹硫烷基-L-半胱氨酸測定羥考酮鹽酸鹽加工產物中14-羥可待因酮的含量，所述產物通過從在實施例22中分析的組分中除去14-羥可待因酮(利用20mM巰基乙醇酸鹽)制備在裝有磁攪拌子的25mL圓底反應燒瓶中，加入以下物質10mLpH7.0的50mM磷酸鹽緩沖液、EDTA(2mg，0.007mmo1)、二硫蘇糖醇(3.1mg，0.020mmo1)、N,N，畫二丹石克烷基-L國胱氨酸(28mg，0.038mmo1)。用10%的砩酸氬二鈉水溶液(0.5mL)將所得溶液的pH升高到7.0，攪拌溶液1小時。然后向含有羥考酮鹽酸鹽(230mg,0.65mmo1)的8mL反應瓶中加入所述溶液的3.5mL等份。加入10%的磷酸氫二鈉水溶液(0.2mL)將所得羥考酮溶液的pH升高到6.1~6.2。移出等份(1.2mL)并置于8mL反應瓶中。保留剩余物用于分別的尖峰試驗。卯分鐘后，用1NHC1將反應混合物的pH降低到2.4~2.5，并幾考酮鹽酸鹽組分中14-HC含量測定10000i8000-6000柳02000y=89.517x+4082.814-HO截距/斜率=4&ppm00102030405060添加的14-HC/Oxy(ppm>且所得溶液用乙酸乙酯(1.5mL)萃取1次。通過HPLC分析水相，其中用530nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下所示，根據每亳克被分析羥考酮中的2-(及)-(5-二曱基氨基-萘-l-硫烷基氨基)-3-(羥考酮-8-硫烷基)-丙酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測定的樣品中14-羥可待因酮的量是0.6ppm?？v坐標表示的是歸屬于硫醇-邁克爾加成物2-(及)-(5-二曱基氨基-萘-l-硫烷基氨基)-3-(羥考酮-8-硫烷基)-丙酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(發(fā)射單位(EU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量和被分析羥考酮的重量之間的比值(ppm)。實施例24在含有小于lppm14-羥可待因酮的羥考酮組分中測定8-羥基羥考酮的含量該實施例描述了用于測定含有小于l卯m14-羥可待因酮的羥考酮組分中8-羥基羥考酮含量的方法，其中所述邁克爾受體前體8-羥基羥考酮被轉化成14-羥可待因酮，并且所得產物的14-羥可待因酮含量被測定并與初始羥考酮組分中的8-羥基羥考酮含量相關聯。在裝有回流冷凝器的500mL圓底燒瓶中，羥考酮(1.50g,4.76mmo1)和對甲苯磺酸一水合物(1.52g，8.0mmo1)溶解在甲苯012345添加的14"HC/Oxy(ppm)羥考酮鹽酸鹽加工產品中14-HC含量測定<table>complextableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>(300mL)中并加熱回流。2.5小時后，在3540。C下，通過旋轉蒸發(fā)減壓除去甲苯。所得剩余物溶解在水(100mL)中并加入固M酸鈉(1.25g)調節(jié)pH到9。用二氯甲烷(3x30mL)萃取水溶液，在無水硫酸鈉中干燥合并的有機層并過濾，通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑。所得的白色固體進一步減壓干燥得到羥考酮(1.37g，91%)。利用實施例20中所述方法測定的羥考酮產物中14-羥可待因酮含量表明14-羥可待因酮的含量為85卯m。該結果與在用于實現脫水的條件下單獨測定的>98%的8-羥基羥^"酮轉化成14-羥可待因酮一起表明初始羥考酮組分中含有約85ppm的8-羥基羥考酮。實施例25除去羥考酮組分中的8-羥基羥考酮該實施例描述從含有約85ppm8-羥基羥考酮的羥考酮組分中除去8-羥基羥考酮的方法。如實施例24所述，回流下，在甲苯和對甲苯磺酸中將含有約85ppm8-羥基羥考酮的羥考酮組分進行酸催化脫水。所得羥考酮產物樣品(1.35g，4.29mmo1)和EDTA(15mg)溶解在0.2NHC1水溶液(27mL)中，并用1MNa2C03水溶液將pH升高到6.1。攪拌溶液直到少量羥考酮沉淀已經溶解，之后加入巰基乙酸鈉(68.3mg,0.60mmo1)。另外攪拌60分鐘后，用1MNa2C03水溶液(4.4mL)將pH升高到8.1，并且將所得白色沉淀萃取到二氯甲烷(3x40mL)中。在無7jO危酸鈉中干燥合并的有機萃取物并過濾，通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑以得到羥考酮產物，其中8-羥基羥考酮和14-羥可待因酮的總量小于5ppm(見實施例26中的測定)。實施例26實施例25中產物的8-羥基羥考酮和14-羥可待因酮的總量測定在裝有回流冷凝器的250mL圓底燒瓶中加熱回流實施例25的羥考酮產物樣品(0.703g，2.23mmo1)和對甲苯磺酸一水合物(0.727g，3.8mmo1)、以及甲苯(125mL)。2.5小時后，在3540。C下，通過旋轉蒸發(fā)減壓除去甲苯。所得剩余物溶解在水(50mL)中并加入固體碳酸鈉(0.50g)調節(jié)pH到9。用二氯甲烷(3xl5mL)萃取所述水溶液，在無水疏酸鈉中干燥合并的有機層并過濾，通過旋轉蒸發(fā)除去溶劑。所得的白色固體進一步高真空干燥15分鐘，并溶解在0.1NHC1水溶液(25mL)中。在3035。C下，通過旋轉蒸發(fā)減壓除去水，高真空干燥固體以得到羥考酮鹽酸鹽。利用下述步驟制備用于羥考酮鹽酸鹽分析的含有5-巰基-2-硝基-苯甲酸的溶液。在8mL反應瓶(配有聚四氟乙烯內襯的螺紋帽和小型磁攪拌子)中將5mgEDTA溶解在0.1MNa2HP04水溶液(4.75mL)和0.1MNaH2P04水溶液(0.25mL)中配制成pH7.4的緩沖液。加入5,5，-二硫代雙(2-硝基-苯甲酸)(10mg,0.025mmol)之后加入二硫蘇糖醇(1.9mg，0.012mmol),溶液顏色立刻變成橙色。當固體完全溶解時(5分鐘)，用INHC1水溶液(0.285mL)將溶液pH降低到4.6~4.5。用pH計完成pH測定，所述pH計具有足夠窄的復合電極(約5mm)以便允許其直接插入樣品瓶中。將羥考酮鹽酸鹽樣品(579mg，1.65mmol)置于8mL反應瓶中，向其中加入3.5mL之前配制的5-巰基-2-硝基-苯甲酸溶液。通過加入100mg/mLNaH2P04水溶液(0.47mL)使pH升高到4.5，移出l.OmL所述溶液的等份并用pH4.5的0.01MNaOAc/HOAc緩沖液(lOpL)稀釋并攪拌。保留剩余物(2.5mL)用于分別的尖峰試驗，其中向混合物中加入已知量的14-羥可待因酮。卯分鐘后，用濃HC1(lOuL)將合并溶液的pH降低到2，通過將乙酸乙酯(3xlmL)添加到瓶中、蓋住并強力搖動來萃取懸液。然后利用巴斯德吸管完全除去瓶中有機層。通過HPLC分析水層，其中用325nm下的吸光度定量流出液中的分析物。如下所示，根據每毫克被分析羥考酮中的5-(羥考酮-8-硫烷基)-2-硝基-苯甲酸峰下的面積對添加的14-羥可待因酮量(ppm，即每克羥考酮中添加的14-羥可待因酮的微克數)的圖測定的14-羥可待因酮含量以及由此實施例24中8-羥基羥考酮和14-羥可待因酮的總量是2,3ppm?？v坐標表示的是相對于硫醇-邁克爾加成物5-(羥考酮-8-硫烷基)-2-硝基-苯甲酸(14-HCA)的峰得到的面積與被分析羥考酮(Oxy)的重量之間的比值(面積單位(AU)/mg)。橫坐標表示的是尖峰14-羥可待因酮(14-HC)的重量和被分析幾考酮的重量之間的比值(ppm)。雖然本文描述并舉例說明了本發(fā)明的幾個實施方案，但是本領域一般技術人員將容易地預想多種用于實施功能和/或得到本文所述的結果和/或一個或多個益處的其它方法和/或結構，并且每個這樣的變體和/或改進都認為落入了本發(fā)明的范圍。更一般而言，本領域技術人員將容易地認為本文所述的所有參數、尺寸、物質和構型是示例性的并且精確的參數、尺寸、物質和構型將取決于本發(fā)明教導的具體應用。本領域技術人員僅僅利用常規(guī)試驗將認識到或能確認本文所述的本發(fā)明具體實施方案的許多等同物。因此，應當理解前述實施方案僅僅是作為實例給出的，并且在所附權利要求及其等同物的范圍內，除了根據說明書描述和權利要求，可另外實施本發(fā)明。如果不相互矛盾，本發(fā)明的兩種或多種方法、方法步驟或其它特征的任意組合都被包括在本發(fā)明的范圍內。除非清楚地相反指出，本文說明書和權利要求書中所用的沒有用數量詞限定的名詞應當理解為意指"至少一個"。本文說明書和權利要求書中所用的短語"和/或，，應當理解為由此結合在一起的元素的"或者或都"，即在一些情況下聯合存在并且在另外情況下分離地存在的元素。用"和/或，，列舉的多個元素應當以相同方式進行解釋，即"一個或多個"因此而結合的元素。除了通過"和/或，，子句具體確定的元素以外，其它元素也可任選地存在，或與具體確定的元素相關或不相關。因此，作為非限定性實例時，參照"A和/或B"，當與開放式結尾的語言例如"包括"一起使用時，可在一個實施方案中僅僅指A(任選地包括除了B以外的元素)；在另一個實施方案中僅僅指B(任選地包括除了A以外的元素)；在又一另外實施方案中指A和B(任選地包括其它的元素)等。本文說明書和權利要求書中所用的短語"或，，應當理解為具有上述定義"和/或"相同的意思。例如，當分離列舉的條款時，"或"或"和/或"應當解釋為包括，即包括至少一個但是還包括一個以上的多數或多個列舉的元素，以及任選地另外的未列舉的條款。除非術語清楚地相反指出，例如"僅僅一個"或"確切一個"或當在權利要求書中使用時"由…組成"，"或，，將指包括確切地一個多數或多個列舉的元素。一般而言，本文所用的術語"或"應當僅僅被解釋為當為排他性術語加上前言時，表示排他性的替代(即"一種或另一種而不是都")例如"或"、"之一"、"僅僅一個"、或"確切地一個"。當在權利要求書中使用時，"基本上由…組成"應當具有專利法領域中所用的一般意義。本文說明書和權利要求書中所用的關于一個或多個元素的短語"至少一個"應當理解為意指選自元素列表中的任意一個或多個元素的至少一個元素，但是不必包括元素列表中具體列舉的每個和每種元素的至少一個并且不排除元素列表中元素的任意組合。該定義還承認除了元素列表中具體確定的元素以外可任選地存在的元素，術語"至少一個，，指與具體確定的元素相關或不相關。因此，作為非限定性實例時，"至少一個A和B"(或等價地"至少一個A或B"、或等價地"至少一個A和/或B")可在一個實施方案中指一個以上，任選地包括一個以上的A，而B不存在(并且任選地包括除了B以外的元素)；在另一個實施方案中指一個以上，任選地包括一個以上的B，而A不存在(并且任選地包括除了A以外的元素)；在又一另外實施方案中指一個以上，任選地包括一個以上的A，以及一個以上，任選地包括一個以上的B(并且任選地包括其它元素)；等等。除非清楚地相反指出，還應當理解，在包括一種以上步驟或作用的本文權利要求的任何方法中，所述方法的步驟或作用的順序不必限制于所敘述方法的步驟或作用的順序。在權利要求中以及上述說明書中，所有過渡短語例如"包括"、"含有"、"帶有"、"具有"、"包含"、"涉及"、"持有"、"包含，，等應當理解為是開放式結尾的，即意指包括但不限于。僅僅過渡短語"由…組成"和"基本上由...組成"應當分別是閉式或半閉式過渡短語，如美國專利局專利審查程序手冊2111.03部分所述。權利要求1.一種從組分中除去至少一種邁克爾受體的方法，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在足以除去至少一種邁克爾受體和/或硫醇-邁克爾加成物的至少部分的條件下利用含巰基化合物處理所述組分，所述硫醇-邁克爾加成物可通過含巰基化合物與至少一種邁克爾受體的加成反應形成。2.—種從組分中除去至少一種邁克爾受體的方法，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在足以與至少一種邁克爾受體反應的條件下利用合適的可溶性含巰基化合物處理所述組分，并且從所述組分中除去所得硫醇-邁克爾加成物和未反應的含巰基化合物，其中所述含巰基化合物根據其形成可從所述組分中除去的可溶性硫醇-邁克爾加成物的能力進行選擇，所述硫醇-邁克爾加成物可從所述組分中除去，并且在需要時可以被定量以便確定所述組分中邁克爾受體的含量。3.權利要求l的方法，其中利用被固定到固體載體上的適當硫醇處理所述組分。4.權利要求l的方法，其中所述組分選自下述組分之一或其任意組合羥考酮、氬可酮、羥嗎啡酮、氫嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽、相關生物堿或其可接受的鹽。5.權利要求l的方法，包括生成產物，其中任何單一邁克爾受體或其鹽的量都不超過25ppm。6.權利要求l的方法，包括生成產物，其中任何單一邁克爾受體或其鹽的量都不超過10ppm。7.權利要求l的方法，包括生成產物，其中任何單一邁克爾受體或其鹽的量都不超過5ppm。8.權利要求l的方法，包括生成產物，其中任何單一硫醇-邁克爾加成物或其鹽的量都不超過25ppm。9.權利要求l的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的14-羥可待因酮或其鹽的量小于25ppm。10.權利要求1的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的14-羥可待因酮或其鹽的量小于10ppm。11.權利要求1的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的14-羥可待因酮或其鹽的量小于5ppm。12.權利要求1的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的14-羥可待因酮或其鹽的量小于lppm。13.權利要求1的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的7，8-脫氫納曲酮或其鹽的量小于25ppm。14.權利要求1的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的7,8-脫氫納曲酮或其鹽的量小于10ppm。15.權利要求1的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有7,8-脫氫納曲酮或其鹽的量小于5ppm。16.權利要求1的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的7，8-脫氫納曲酮或其鹽的量小于lppm。17.權利要求2的方法，包括定量至少一種邁克爾受體，其中測量硫醇-邁克爾加成物的量并與所述組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限是10ppm或更小。18.權利要求2的方法，包括定量邁克爾受體，其中硫醇-邁克爾加成物的量被測量并與組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限在0.001至10ppm的范圍內。19.權利要求2的方法，包括定量組分中邁克爾受體的含量，所述組分為下述組分之一或其任意組合羥考酮、氫可酮、羥嗎啡酮、氬嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽、或者相關生物堿或其可接受的鹽，其中硫醇-邁克爾加成物的量被測量并與組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限是10ppm或更小。20.權利要求2的方法，包括定量組分中邁克爾受體的含量，所述組分為下述組分之一或其任意組合羥考酮、氫可酮、羥嗎啡酮、氫嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽、或者相關生物堿或其可接受的鹽，其中硫醇-邁克爾加成物的量被測量并與組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質的量的定量極限是lppm或更小。21.權利要求2的方法，包括定量組分中邁克爾受體的含量，所述組分為下述組分之一或其任意組合羥考酮、氫可酮、羥嗎啡酮、氫嗎啡酮、納洛酮、納曲酮或其可接受的鹽、相關生物堿或其可接受的鹽，其中硫醇-邁克爾加成物的量被測量并與組分的邁克爾受體含量相關聯，并且其中任何一種邁克爾受體雜質水平的定量極限在0.001至10ppm的范圍內。22.權利要求2的方法，包括定量羥考酮或其可接受鹽的14-羥可待因酮含量，其中測量14-羥可待因酮的硫醇-邁克爾加成物的量并與組分的14-羥可待因酮含量相關聯，并且其中14-羥可待因酮雜質水平的定量極限是10ppm或更小。23.權利要求2的方法，包括定量羥考酮或其可接受鹽的14-羥可待因酮含量，其中測量14-羥可待因酮的硫醇-邁克爾加成物的量并與組分的14-羥可待因酮含量相關聯，并且其中14-羥可待因酮雜質水平的定量極限小于lppm。24.權利要求2的方法，包括定量鞋考酮或其可接受鹽的14-羥可待因酮含量，其中測量14-羥可待因酮的硫醇-邁克爾加成物的量并且與組分的14-羥可待因酮含量相關聯，并且其中14-羥可待因酮雜質水平的定量極限在0.001至10ppm的范圍內。25.權利要求2的方法，其中所述組分是有機堿，其水中溶解度隨pH增加而降低；并且其中在適當pH值的水溶液中利用適當的含巰基化合物處理所述組分以便(與雜質邁克爾受體)形成可溶性硫醇-邁克爾加成物；并且其中隨后通過提高pH到適當值使所述組分在可溶性硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀，由此從所述石危醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中分離所述有機堿。26.權利要求2的方法，其中所述組分是有機酸，其水中溶解度隨pH降低而降低；并且其中在適當pH值的水溶液中利用適當的含巰基化合物處理所述組分以便(與雜質邁克爾受體)形成可溶性硫醇-邁克爾加成物；并且其中隨后通過降低pH到適當值使所述組分在可溶性硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物的溶液中沉淀，由此從所述硫醇-邁克爾加成物和過量含巰基化合物中分離所述有機酸。27.權利要求2的方法，其中通過利用水和/或其它溶劑的選擇性沉淀和/或萃取、和/或通過選擇性吸附到介質上將所述組分從硫醇-邁克爾加成物和過量含琉基化合物中分離，所述介質例如為但不限于離子交換樹脂和/或其它固體載體，所述固體栽體含有固定化配體金屬離子和/或固定化馬來酰亞胺和/或固定化活性二硫化物和/或固定化抗體和/或固定化酶。28.—種從組分中除去至少一種邁克爾受體和/或至少一種邁克爾受體水合物的方法，所述組分為下述組分之一或其任意組合可被生命有機體內化的組分、可與生命有機體相接觸的組分、或可與適于被生命有機體內化的物質相接觸的組分，所述方法包括在通過將至少一種邁克爾受體水合物轉化成邁克爾受體而足以除去所述至少一種邁克爾受體水合物的條件下，利用酸性催化劑處理所述組分；然后在足以從所述組分中除去未反應的含巰基化合物、所述至少一種最初存在于所述組分中的邁克爾受體、和由所述至少一種邁克爾水合物形成的邁克爾受體的條件下，利用適當的可溶性含巰基化合物處理所述組分；其中所述含巰基化合物根據其形成可溶性硫醇-邁克爾加成物的能力進行選擇，所述可溶性硫醇-邁克爾加成物可以從所述組分中除去并且在需要時可以被定量以便確定所述組分中邁克爾受體水合物的含量和邁克爾受體的含量。29.權利要求28的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基羥考酮或其鹽的量小于100ppm。30.權利要求28的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基羥考酮或其鹽的量小于10ppm。31.權利要求28的方法，包括生成含有羥考酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基羥考酮或其鹽的量小于5ppm。32.權利要求28的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基納曲酮或其鹽的量小于100ppm。33.權利要求28的方法，包括生成含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基納曲酮或其鹽的量小于10ppm。34.權利要求28的方法，包括制備含有納曲酮或其可接受鹽的產物，所述產物含有的8-羥基納曲酮或其鹽的量小于5ppm。全文摘要本發(fā)明涉及從某些組分中除去邁克爾受體的方法，其中在足以除去邁克爾受體和所得硫醇-邁克爾加成物的條件下利用含巰基化合物處理所述組分。本發(fā)明的某些實施方案能夠定量和/或除去邁克爾受體和/或邁克爾受體前體。文檔編號C07D489/02GK101346384SQ200680049462公開日2009年1月14日申請日期2006年11月22日優(yōu)先權日2005年11月22日發(fā)明者弗拉迪斯拉夫·V·捷利亞特尼科夫,朱爾斯·A·謝弗,浩汪申請人:控制化學品公司