(r)-2-羥基-n-((2s,3s)-2-((r,e)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基) 氧雜環(huán)-3-基)二十四烷 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的一種(R)?2?羥基?N?((2S,3S)?2?((R,E)?1?羥基十五烷?4?烯?1?基)氧雜環(huán)?3?基)二十四烷酸胺，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)能夠有效地調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化和防止冠心病，并且該化合物的制備方法簡單，藥物價格低廉，對ACAT有選擇性抑制作用。
【專利說明】
(R) -2-羥基-N- ((2S, 3S) -2- ((R, E) -1 -羥基十五烷-4-烯-1 -基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及預(yù)防動脈粥樣硬化領(lǐng)域，尤其涉及一種(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病位列當(dāng)前威脅人類健康的三大疾病，即心血管疾病、腫瘤和傳染性疾 病之首，而動脈粥樣硬化又是心血管疾病的最重要的病理學(xué)基礎(chǔ)之一，是引起心肌梗塞、腦 梗塞以及冠心病等心腦血管疾病死亡的主要原因，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展都有關(guān)系。防治 動脈粥樣硬化是防治心血管疾病的根本性措施。研制抗動脈硬化疫苗，將有助于抑制動脈 硬化的發(fā)生與發(fā)展，有助于降低心肌梗塞、腦梗塞的發(fā)病率，減少冠心病的死亡率，減少這 些疾病對人類的危害。但是現(xiàn)有預(yù)防預(yù)防動脈動脈粥樣硬化的藥物價格較貴，對于我國來 說百姓來經(jīng)濟負擔(dān)較重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺及其制備方法，能夠有效預(yù)防動脈動脈粥樣硬化，且 成本低。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
[0005] -種(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺，具有式(I)所示結(jié)構(gòu) ：
[0006]
[0007] 本發(fā)明還提供一種具有式（I)結(jié)構(gòu)的(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1^5S 十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺的制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將牛菜置于圓底燒杯中，加入甲醇，收集醇提取液，過濾，濃縮成膏狀物；
[0009] 2)將步驟1)得到的膏狀物加水，得到混懸液；
[0010] 3)分別將石油醚、氯仿加入到步驟2)所述的混懸液中，分別得到石油醚提取液和 氯仿提取液，將所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液進行濃縮成稠膏，再加入糊精， 減壓干燥，即得。
[0011]優(yōu)選地，步驟1)中牛菜中加入第一甲醇，浸泡18~30h后，加熱回流4~6h，收集醇 提取液A;再向剩余的藥渣中加入第二甲醇，加熱回流4~6h，收集醇提取液B;所述第一甲醇 和所述第二甲醇的質(zhì)量濃度、用量相同。
[0012] 優(yōu)選地，所述牛菜的質(zhì)量與所述第一甲醇的體積比為(8~12kg): (35~45L)。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)中石油醚、氯仿的提取次數(shù)均獨立地選自2~4次，所述混懸液、所 述石油醚、所述氯仿與所述第一甲醇的體積比為(5.5~6.5): (5.5~6.5): (5.5~6.5): (35 ~45) 〇
[0014] 優(yōu)選地，所述牛菜與所述糊精的質(zhì)量比為(30~40) :(0.2~0.3)。
[0015] 優(yōu)選地，所述加壓干燥溫度為50~70°C。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種化合物，其包含具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的可藥用鹽。
[0017] 由上述技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明提供的一種(R)-2_羥基-N-((2S，3S)-2_((R， E)-l_羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺能夠有效地調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈 粥樣硬化和防止冠心病，并且該化合物的制備方法簡單，藥物價格低廉，對ACAT有選擇性抑 制作用。
【附圖說明】
[0018] 圖1為實施例1制備得到的產(chǎn)物的ESI-MS圖譜；
[0019 ]圖2為實施例1制備得到的產(chǎn)物的1H-NMR圖譜；
[0020] 圖3為實施例1制備得到的產(chǎn)物的13C-NMR圖譜；
[0021] 圖4為實施例1制備得到的產(chǎn)物的HSQC圖譜；
[0022] 圖5為實施例1制備得到的產(chǎn)物的HMBC圖譜。
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明公開了一種(R)-2-羥基-N-((2S， 3S)-2-( (κ,ε)-!-羥基十五烷-4--4-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改 進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所述類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯 而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及引用已經(jīng)通過較佳實施例進行了 描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行 改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0024] -種(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺，具有式(I)所示結(jié)構(gòu) ：
[0025]
[0026] 本發(fā)明提供的上述結(jié)構(gòu)的化合物，能夠有效地調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化和防 止冠心病，對ACAT有選擇性抑制作用。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，包括以下步驟：
[0028] 1)將牛菜置于圓底燒杯中，加入甲醇，收集醇提取液，過濾，濃縮成膏狀物；
[0029] 2)將步驟1)得到的膏狀物加水，得到混懸液；
[0030] 3)分別將石油醚、氯仿加入到步驟2)所述的混懸液中，分別得到石油醚提取液和 氯仿提取液，將所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液進行濃縮成稠膏，再加入糊精， 減壓干燥，即得。
[0031] 在本發(fā)明中，向牛菜中加入甲醇，收集醇提取液，過濾濃縮成膏狀物。在本發(fā)明的 實施例中，為了重復(fù)提取牛菜中的醇提取液，牛菜中加入第一甲醇，浸泡18~30h后，加熱回 流4~6h，收集醇提取液A;再向剩余的藥渣中加入第二甲醇，加熱回流4~6h，收集醇提取液 B0
[0032] 需要說明的是，第一甲醇和第二甲醇的質(zhì)量濃度、用量相同。
[0033] 在本發(fā)明中，膏狀物中加入水，得到混懸液;在本發(fā)明的實施例中，混懸液的體積 一定，加水量受混懸液體積的限制。
[0034] 在本發(fā)明中，將石油醚、氯仿加入到混懸液中，分別得到石油醚提取液和氯仿提取 液，將提取液濃縮成稠膏，再加入糊精，減壓干燥，即得具有式（I)結(jié)構(gòu)的（1〇-2-羥基4_ ((2S，3S)-2_( (R，E)-1_羥基十五燒-4-稀-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四燒酸胺。在本發(fā)明的 實施例中，石油醚、氯仿的提取次數(shù)均獨立地選自2~4次，混懸液、石油醚、氯仿與第一甲醇 的體積比為（5.5~6.5) :(5.5~6.5) :(5.5~6.5): (35~45)。
[0035]牛菜的質(zhì)量與第一甲醇的體積比為(8~12kg): (35~45L)。
[0036] 牛菜與糊精的質(zhì)量比為(30~40) :(0.2~0.3)。
[0037] 加壓干燥溫度為50~70Γ。
[0038]本發(fā)明還提供了一種化合物，其包含具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的可藥用鹽。
[0039] 本發(fā)明提供的（R)-2-羥基4-((25,35)-2-((1?3)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧 雜環(huán)-3-基)二十四燒酸胺的制備方法，制備得到的(R) -2-羥基-N- ((2S，3S)-2-((R，E)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺的收率高，純度高，且該結(jié)構(gòu)的化合物 能夠有效地調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防動脈粥樣硬化和防止冠心病，對ACAT有選擇性抑制作用，并且該 化合物的制備方法簡單，藥物價格低廉，制備成本低。
[0040] 為了進一步說明本發(fā)明，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種（1〇-2-羥基4_ ((2S, 3S)_2_( (R，E)_1_羥基十五燒_4_稀-1-基)氧雜環(huán)_3_基)二十四燒酸胺及其制備方法 進行詳細描述。
[0041] 以下實施例中所用的原料均為市售。
[0042] 實施例1
[0043] 取IOkg牛菜，置圓底燒瓶中，加40000mL甲醇，浸泡24h，加熱回流提取5小時，收集 醇提液;在剩余的藥渣中再加入40000mL甲醇，加熱回流提取5小時，取出醇提液，合并兩次 醇提液，濾過，回收甲醇并繼續(xù)濃縮成膏狀;加入適量水，使得混懸液的體積為6000mL;再分 別加入石油醚、氯仿對混懸液進行提取，石油醚、氯仿的萃取次數(shù)均3次，每次石油醚和氯仿 的用量均為6000mL，將萃取得到的提取物濃縮成稠膏，加入0.069g糊精，60 °C減壓干燥，得 到產(chǎn)物。
[0044] 實施例2
[0045] 取8kg牛菜，置圓底燒瓶中，加35000mL甲醇，浸泡18h，加熱回流提取4小時，收集醇 提液;在剩余的藥渣中再加入35000mL甲醇，加熱回流提取5小時，取出醇提液，合并兩次醇 提液，濾過，回收甲醇并繼續(xù)濃縮成膏狀;加入適量水，使得混懸液的體積為5500mL;再分別 加入石油醚、氯仿對混懸液進行提取，石油醚、氯仿的萃取次數(shù)均2次，每次石油醚和氯仿的 用量均為5500mL，將萃取得到的提取物濃縮成稠膏，加入0.06g糊精，50°C減壓干燥，得到產(chǎn) 物。
[0046] 實施例3
[0047] 取12kg牛菜，置圓底燒瓶中，加45000mL甲醇，浸泡30h，加熱回流提取6小時，收集 醇提液;在剩余的藥渣中再加入45000mL甲醇，加熱回流提取6小時，取出醇提液，合并兩次 醇提液，濾過，回收甲醇并繼續(xù)濃縮成膏狀;加入適量水，使得混懸液的體積為6500mL;再分 別加入石油醚、氯仿對混懸液進行提取，石油醚、氯仿的萃取次數(shù)均4次，每次石油醚和氯仿 的用量均為6500mL，將萃取得到的提取物濃縮成稠膏，加入0.06g糊精，70°C減壓干燥，得到 產(chǎn)物。
[0048] 實施例4
[0049] 取IOkg牛菜，置圓底燒瓶中，加40000mL甲醇，浸泡30h，加熱回流提取6小時，收集 醇提液;在剩余的藥渣中再加入40000mL甲醇，加熱回流提取6小時，取出醇提液，合并兩次 醇提液，濾過，回收甲醇并繼續(xù)濃縮成膏狀;加入適量水，使得混懸液的體積為6000mL;再分 別加入石油醚、氯仿對混懸液進行提取，石油醚萃取3次，氯仿的萃取2次，每次石油醚的用 量為6000mL，氯仿的用量為5500mL，將萃取得到的提取物濃縮成稠膏，加入0.09g糊精，60 °C 減壓干燥，得到產(chǎn)物。
[0050] 實施例5
[00511取IOkg牛菜，置圓底燒瓶中，加40000mL甲醇，浸泡24h，加熱回流提取6小時，收集 醇提液;在剩余的藥渣中再加入40000mL甲醇，加熱回流提取6小時，取出醇提液，合并兩次 醇提液，濾過，回收甲醇并繼續(xù)濃縮成膏狀;加入適量水，使得混懸液的體積為6000mL;再分 別加入石油醚、氯仿對混懸液進行提取，石油醚萃取2次，氯仿的萃取4次，每次石油醚的用 量為6500mL，氯仿的用量為6000mL，將萃取得到的提取物濃縮成稠膏，加入0.08g糊精，60 °C 減壓干燥，得到產(chǎn)物。
[0052] 1、化合物結(jié)構(gòu)的確定
[0053]對實施例1得到的產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果如下：
[0054] 采用ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC對實施例1得到的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié) 果為：參見圖1可以看出，該化合物中存在664.6[M+H] +、686.6[M+H] +、664.6[M+Na] +、662.5 [M-H] -、698.6[M+C1]-的準(zhǔn)分子離子峰。再結(jié)合圖3、4/H NMR和13C NMR圖譜可以看出，在1H NMR(C5D5NjOOMHz)圖譜中，δ :8.50( lH，d，J = 7.2Hz，N-H)，5.44(2H，m，H-7,8),4.77( lH，m， H-2) ,4.64(lH,dd ,J = 7.8,4.2Hz,H-2/ ) ,4.51 (1H, t ,J = 8.4Hz ,Ha-I), 4.31 (lH,m,H-4), 4.13(lH,m,H-3),3.91(lH,t J = 8.4Hz,Hb-l),2.22(lH,m,Ha-3/ ) ,2.04(2H,m,H-9) ,2.01 (2H,m,H-10) ^.OOdH.m.Hb-S7 ), 1.75(2H,m,H-4/ ), 1.72(2H,m,H-6), 1.67(lH,m,Ha-5), 1.56(lH，m，Hb-5)，1.29(m，長鏈CH2)，0.84(6!1，^ = 7.2,013\2)。13(：-匪1?(〇5〇511501抱） 5:175.4(0-10,130.9(0-7),130.2(0-8),85.9(0-3),74.5(0-4),72.4(0-2 7),71.5(C-1), 51.7(0-2),35.5(0-30,33.7(0-6),32.8(0-9),32.8(0-10),26.3(0-5),25.7(0-4 7),14.2 (CH3)131H匪R譜中δ?. 21~I. 32的強的質(zhì)子信號、δο. 84處的2個端甲基質(zhì)子信號以及13C 匪R譜中δ22.8~32.0的碳信號提示含兩個長鏈脂肪烷基；信號68.50(1!1，(1，1 = 7.2他，^ Η)、δ175·4((Χ)ΝΗ2)、δ51 J(CH-NH)和δ4·77(1Η，πι)以及四個連氧碳信號δ85·9、74· 5、72· 4、 71.5顯示有酰胺鍵和四個連氧碳的存在。以上數(shù)據(jù)表明，該化合物為梢氨醇類的神經(jīng)酰胺， 相對分子質(zhì)量為663，分子式為C42H81O4N，不飽和度為3。
[0055] 參見圖4、圖5可知，在HSQC譜上，質(zhì)子信號64.64(1!1，(1(1，1 = 7.8,4.2抱，!1-2/)與碳 信號372.4((:-2')相關(guān)，其在HMBC譜上與羰基碳信號6175.4((:-1')和635.5((:-3')有遠程相 關(guān)，表明?；糠譃棣?OH脂肪酰鏈。綜合分析HSQC、HMBC譜，發(fā)現(xiàn)除了碳鏈的長度有差別外， 兩者長鏈酸部分的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)基本相同，但長鏈堿部分差別較大。SC-I由61.9變?yōu)棣?71 · 5，向低場位移了9 · 6ppm; δ〇3由72 · 8變?yōu)棣?5 · 9，向低場位移了 13 · Ippm。結(jié)合分子式的3 個不飽和度，確定該化合物長鏈堿的1，3位脫去一分子水環(huán)合成環(huán)氧丙烷的結(jié)構(gòu)?？紤]到生 源途徑和神經(jīng)酰胺類化合物的立體位阻，確定其中手性碳的絕對構(gòu)型為23,33,41?，2 /1?。在 HMBC譜中，觀測到質(zhì)子信號64.13(1!1，111，!1-3)與碳信號626.3((：-5)相關(guān)，4.31(1!1，111，!1-4)與 碳信號 33.7(06)相關(guān)，結(jié)合 HSQC 圖譜，確定1.72(2H，m，H-6)、1.67(lH，m，Ha-5WP1.56(lH, 111,肋-5)的歸屬。1.72(2!1，111，!1-6)、1.67(1!1，111，版-5)和1.56(1!1，111，冊-5)均與雙鍵烯碳有遠 程相關(guān)，故雙鍵的位置應(yīng)該在長鏈堿的7~8位上。根據(jù)雙鍵質(zhì)子的峰型為多重峰和鄰雙鍵 的碳信號S值為33.7(C-6)，32.8(C-9)，可以確定雙鍵的構(gòu)型為E型。
[0056] 長鏈堿和長鏈酸長度的確定:化合物2mg溶于8ml甲醇中，加入Ig鹽酸，85°C水浴回 流8h。在水浴上將甲醇揮干，加入5ml水，滴加5 %氫氧化鈉溶液至水溶液呈堿性，用石油醚 (3ml)萃取3次，合并萃取液，減壓除去石油醚，用ESI-MS檢測，顯示水解后碎片的分子離子 加氫峰 m/z298.1(M++l)。
[0057] 水解過程如下：
[0058]
[0059] 綜合以上分析和化學(xué)反應(yīng)結(jié)果，可知，實施例1制備得到的化合物為(1〇-2-羥基_ N_( (2S，3S)-2_( (R，E)-1_羥基十五燒-4-稀-1-基)氧雜環(huán)-3-基）二十四燒酸胺，結(jié)構(gòu)為
[0060] 按照上述測試過程對實施例2~5的產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果與實施例1相同。
[0061] 2、對實施例1得到的式（I)的化合物進行提取率(提取率=產(chǎn)物的質(zhì)量/牛菜的質(zhì) 量X 100%)的測定，提取率為0.48。
[0062] 3、對ACAT的影響
[0063] 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)是細胞內(nèi)唯一合成膽固醇酯的酶，在細胞和生物體膽固 醇代謝平衡中起非常重要的作用，ACAT合成的膽固醇酯主要以脂滴形式儲存于胞漿中。 [0064] RAW264.7細胞以細胞數(shù)2\105/孔鋪于24孔板，于37°(：、5%〇) 2條件下過夜培養(yǎng)后， 換為無血清DMEM培養(yǎng)基（IOOyL/孔）。將細胞分為空白對照組(不加 Ox-LDL和待測樣品）、模 型組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL和IOOyg · mL-1 的Ac-LDL)，加藥組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL 和IOOyg · ml/1的Ac-LDL以及5μg/ml實施例1制備得到的化合物），細胞貼壁后，加入終濃度 為80yg · mL-1的ox-LDLlOOyg · mL-1的Ac-LDL到模型組和加藥組，作用24h后，裂解細胞，收 集蛋白。BCA試劑盒進行蛋白定量。ACAT檢測試劑盒測定ACAT含量。ACAT含量=實測ACAT濃 度/總蛋白含量;ACAT抑制率=(模型組含量-加藥組含量)/(模型組含量-空白組含量）X 100%，結(jié)果為:細胞活性為92.78%，ACAT抑制率為95.32%。
[0065] 由上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明具有式（I)結(jié)構(gòu)的（R)-2_羥基-N-((2S，3S)-2_((R， E)-l_羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺，能夠?qū)CAT選擇性抑制作用， 能夠預(yù)防動脈粥樣硬化。
[0066] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種(R)-2-羥基4-((23,33)-2-((1?3)-1-羥基十五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基） 二十四烷酸胺，其特征在于，具有式(I)所示結(jié)構(gòu)：2. 如權(quán)利要求1所述的具有式(I)結(jié)構(gòu)的(R)-2-羥基-N-((2S，3S)-2-((R，E)-1^5S+ 五烷-4-烯-1-基)氧雜環(huán)-3-基)二十四烷酸胺的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將牛菜置于圓底燒杯中，加入甲醇，收集醇提取液，過濾，濃縮成膏狀物； 2) 將步驟1)得到的膏狀物加水，得到混懸液； 3) 分別將石油醚、氯仿加入到步驟2)所述的混懸液中，分別得到石油醚提取液和氯仿 提取液，將所述石油醚提取液和所述氯仿提取液提取液進行濃縮成稠膏，再加入糊精，減壓 干燥，即得。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟1)中牛菜中加入第一甲醇，浸泡18 ~30h后，加熱回流4~6h，收集醇提取液A;再向剩余的藥渣中加入第二甲醇，加熱回流4~ 6h，收集醇提取液B;所述第一甲醇和所述第二甲醇的質(zhì)量濃度、用量相同。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述牛菜的質(zhì)量與所述第一甲醇的體積 比為（8~12kg): (35~45L)。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中石油醚、氯仿的提取次數(shù)均獨 立地選自2~4次，所述混懸液、所述石油醚、所述氯仿與所述第一甲醇的體積比為（5.5~ 6.5):(5.5~6.5):(5.5~6.5):(35~45)。6. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述牛菜與所述糊精的質(zhì)量比為（30~ 40):(0.2~0.3)。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述加壓干燥溫度為50~70°C。8. 化合物，其包含具有式(I)所示結(jié)構(gòu)的可藥用鹽。
【文檔編號】A61P9/10GK105859658SQ201610318802
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】王春波, 姜啟曉, 王龍源, 陳雪紅
【申請人】青島大學(xué)