磁性靜電紡絲纖維給癌癥細胞加熱的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物技術(shù)領域，具體涉及一種磁性靜電紡絲纖維抗癌及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是導致死亡的主要原因，一個正常的細胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細胞通常是通過一個多階段的過程。在過去的十年中，對腫瘤的分子分析增強了我們對癌癥的認識并且給我們提供了治療癌癥的新途徑。但是，癌癥的復雜性和不同類型癌癥細胞的廣泛變異，使得我們目前找到一個最佳治療癌癥手段或適合治療普遍癌癥的方法都變得很困難。常見的癌癥化療或放療的應用的選擇性和靶向性都很差，給人體造成非常嚴重的副作用。為了提高治療的靶向性，研究人員開始轉(zhuǎn)向納米技術(shù)領域，例如，以膠束、脂質(zhì)體等脂質(zhì)為基礎來實現(xiàn)藥物輸送系統(tǒng)。
[0003]對癌癥治療特別有效的就是含氧化鐵的納米粒子(1NPs)。磁性氧化鐵納米顆粒的確有杰出的治療潛力，它可施加交變磁場也可以加熱周圍環(huán)境(即所謂的“磁熱療”)。當癌細胞暴露于升高的溫度(例如45°C)時會發(fā)生失活并且最終會導致癌癥細胞的的死亡。在喬丹等人開創(chuàng)性的工作下磁性氧化鐵納米顆?？烧T導升溫的能力得到了明確地闡述。從此，通過磁性氧化鐵納米顆粒的磁熱療技術(shù)對癌癥治療的探索得到了很多的關注并且進行了很多的臨床試驗。目前正在進行的磁熱療有，復發(fā)性多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者已接受磁熱療。還要注意的是當氧化鐵芯在體內(nèi)破壞后，產(chǎn)生的游離鐵與大多數(shù)的細胞都具有生物相容性。
[0004]雖然在靜脈注射后，氧化鐵納米顆粒對腫瘤細胞的靶向性只是一定程度上的，在腫瘤局部精準的遞送1NPs仍然是一個重大的挑戰(zhàn)。但事實上，在靜脈注射后大多數(shù)的納米粒子被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)迅速的清除，而網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)可能需要直接注射1NPs才能有腫瘤磁熱療的效果。此外，即使一個剩余的癌細胞也可以導致腫瘤形成的復發(fā)，重復應用微熱療(41-45Γ，盡量減少對周圍健康組織的繼發(fā)效應)與其他治療方法相結(jié)合的應當優(yōu)先考慮。如果可以開發(fā)出允許1NPs反復加熱的材料將會對治療癌癥非常有利。當注射分散體(自由)1NPs，1NPs對腫瘤細胞的吸收/粘附是一個成功治療的關鍵。然而，在交變磁場中的應用，可以預見粘附在細胞上的1NPs會從死亡的腫瘤細胞和吞噬細胞中釋放。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為了克服上述問題，本發(fā)明的目的是將1NPs封裝在納米纖維中最終是將它們放置在腫瘤附近的腫瘤細胞中，通過磁力加熱殺死癌細胞并殺死它們。
[0006]技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
通過靜電紡絲過程來制備磁性納米靜電紡絲纖維，在交變磁場下，可實現(xiàn)給癌癥細胞反復加熱冷卻的循環(huán)，使癌癥細胞致死。
[0007]所述的應用:靜電紡絲過程中的易用性和靈活性等優(yōu)點允許聚合物纖維的制備可以通過任一水溶液或有機溶劑的聚合物溶液，因此靜電紡絲纖維的物理尺寸具有高度的可控性。靜電紡絲纖維網(wǎng)具有較高的比表面積和發(fā)達的孔隙率，這有益于和(癌癥)細胞的結(jié)合。而且，靜電紡絲纖維卻可以封裝大量的1NPs，靜電紡絲纖維的加熱效果相對較好。一旦將包含了 1NPs的纖維網(wǎng)放置在所需的位置，則在腫瘤周圍1NPs的含量將保持穩(wěn)定，從而在局部達到重復加熱的效果。
[0008]—種制備磁性靜電紡絲纖維的方法，包括以下步驟:
1)采用靜電紡絲裝置制備裝載有Fe304納米顆粒的聚苯乙烯纖維網(wǎng)；為使Fe304納米粉末在THF中充分分散，我們在9mLTHF溶液中添加0.6g粉末，然后將分散系統(tǒng)放置在超聲波中振蕩24h小時。然后將聚苯乙烯溶液(DMF: THF = I: 3)添加到1NPs分散系中，隨后將其電紡成纖維。通常情況下，我們使用注射栗將5mL的PS/1NPs混合溶液以2mL/h的速度進行電紡。外加電壓是10kV，紡出的纖維用接地旋轉(zhuǎn)收集器進行收集；
2)纖維的表面修飾；將電紡出的帶磁性的PS浸入濃硫酸(9.8M，1ml)中并攪拌三分鐘，使纖維表面發(fā)生磺化反應。從而使帶負電荷的纖維被移除到酸溶液中，然后用蒸餾水進行沖洗直至溶液pH接近中性?；腔蟮腜S纖維用PAH水溶液(2mg/ml，0.5M NaCl，5ml)浸泡15min后用蒸餾水沖洗三次。最后，PAH包覆的纖維再在膠原蛋白溶液(0.45mg/ml inPBS)中浸泡15min后用蒸餾水沖洗三次；
3)卵巢癌在纖維網(wǎng)上的吸附；中性、帶負電荷和膠原蛋白包覆的帶磁性的纖維暴露于分散在細胞培養(yǎng)基(在離心管)上的卵巢癌細胞中，放置在37°C和5% C02的潮濕空氣中振蕩。兩小時后，將所有的樣品轉(zhuǎn)移到6個培養(yǎng)皿中并在保溫箱中儲存過夜。然后所有的樣品都用DAPI熒光劑(0.5 μ g/ml)在室溫下進行核染色5分鐘，然后用PBS溶液清洗三次；
4)磁性纖維的加熱；為了觀察纖維的加熱能力，我們將281mg的帶磁性的PS纖維(含有20%的1NPs (質(zhì)量比)分散到含有ImL水的離心管中，然后將離心管放到磁場加熱裝置線圈的交變磁場進行加熱，樣品的溫度用和加熱裝置耦合的高靈敏度的電子溫度計進行測量。磁性纖維周圍培養(yǎng)皿中的鐵離子濃度用之前說過的方法進行測量。基于使用對Fe3+響應的鈦試劑化合物作為指示劑染料的分光光度法。
[0009]5)少量的纖維用硅片接收并在氮氣中干燥，然后用金飛濺纖維層。顯微鏡圖像用FEI記錄，在15KV的加速電壓下進行掃描電鏡(Quanta 200FEG)的操作。
[0010]步驟I)中，所述的裝置有高壓電源、注射器、平頭電極針、接地收集器。
【附圖說明】
[0011]圖1是制備工藝及結(jié)果圖，其中A是PS溶液(DMF/THF: 1/3)添加上分散的1NPs后經(jīng)靜電紡絲成纖維；B是靜電紡絲PS纖維的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，纖維平均直徑為5 μπι ;圖C是PS溶液加載不同濃度的1NPs電紡成的纖維，掃描電鏡證實當靜電紡絲纖維含有20%的1NPs并沒顯示出異常的形態(tài)；圖D是含有282mg 1NP的PS纖維在施加交變磁場(600安培，232kHz)的情況下將I毫升23°C的水加熱到83°C只需要180秒的結(jié)果圖，這些結(jié)果表明了纖維的強大的加熱能力；圖E是含1NP的靜電紡絲纖維有連續(xù)加熱和冷卻的這個性能的示意圖。
[0012]圖2是PS-1ONPs纖維暴露于連續(xù)旋轉(zhuǎn)的卵巢癌細胞的代表性圖片，避免細胞沉淀在頂部的纖維網(wǎng)各種表面的代表性圖像；其中A是表示細胞粘附在非官能化PS-1ONPs纖維是相當有限的示意圖是附著硫酸基團的PS-1ONPs纖維并沒有提高與癌細胞的結(jié)合，可以預期細胞膜呈現(xiàn)凈負電荷。C藍色熒光圖像顯示細胞核用DAPI染色覆蓋。
[0013]圖3是粘附卵巢癌細胞的PS-1ONP纖維由分別用溫水浴加熱和磁場加熱的對比圖；其中，A是在37°C下水浴I小時。B是在45°C下水浴I小時；C是在37攝氏度下水浴3小時。D是在45°C下水浴3小時；E是在水浴中，暴露在加熱/冷卻循環(huán)中3小時，F(xiàn)表示，綠色:活細胞，紅:死亡細胞，所有的照片都是傳輸圖像顯示纖維和雙色熒光圖像疊加。
[0014]圖4是粘附卵巢癌細胞的PS-1ONP纖維由磁場加熱結(jié)合的可行性；其中，A是PS-1ONP纖維在350Amp和232kHz交變磁場經(jīng)加熱的溫度-時間曲線(20% 1NPs) ；B是對照樣本，將細胞保持在37°C水浴中，保持I小時；C-H是在不同的時間下PS-1ONP纖維(20%1NPs)吸附卵巢癌細胞后被交變磁場加熱到450C (C:lmin,D:5min，E:10min，F(xiàn):20min，G:30min，H:60min)，綠色:活細胞，紅:死亡細胞；所有的照片都是傳輸圖像顯示纖維和雙色熒光圖像疊加。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0016]以下實施例中所使用的主要藥品為:DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，THF(四氫呋喃)，4，5-二輕基-1，3-二苯磺酸鈉鹽水合物(鈦試劑)，從Aldrich (Steinheim，Germany)購買的 50nm 的 Fe304 納米粉末(< 50nm) (CAS 號:1317-6-9)，從 Sigma-Aldrich(Bornem，Belgium)購買的PAN(聚丙稀腈)，從Alfa Aesar (Karlsruhe，Germany)購買的聚苯乙稀(PS，分子量為 100 000g/mol，批號為 10099118)，以及從 Invitrogen (Merelbeke，Belgium)購買的哺乳動物細胞活性/細胞毒性試劑盒和鼠尾膠原蛋白。
[0017]實施例1
I)電紡裝載有Fe304納米顆粒的聚苯乙烯纖維網(wǎng)
為使Fe304納米粉末在THF中充分分散，我們在9mLTHF溶液中添加0.6g粉末，然后將分散系統(tǒng)放置在超聲波中振蕩24h小時。然后將聚苯乙烯溶液(DMF: THF = I: 3)添加到1NPs分散系中，隨后將其電紡成纖維。使用的裝置有高壓電源、注射器、平頭電極針、接地收集器。通常情況下，我們使用注射栗將5mL的PS/1NPs混合溶液以2mL/h的速度進行電紡。外加電壓是10kV，紡出的纖維用接地旋轉(zhuǎn)收集器進行收集。
[0018]數(shù)據(jù)進一步表明，大多數(shù)的1NPs封裝在纖維內(nèi)并不存在于纖維表面所以不會導致1NPs的泄漏。值得注意的是，當PS纖維加載1NPs的含量過高時，靜電紡絲成的1NP-PS纖維會呈現(xiàn)串珠狀(由于1NP-PS分散體粘度增加)。所以在本文中，使用的是含20%的1NPs纖維。
[0019]2)纖維的表面修飾。
將電紡出的帶磁性的PS浸入濃硫酸(9.8M，10ml