一種竹紅菌乙素納米粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種竹紅菌乙素納米粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 光動(dòng)力治療（Photodynamic therapy，F(xiàn)1DT)是一種具有較好應(yīng)用前景的治療方法。 其指由敏化光源輻照光敏劑引起光敏化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，從而破壞病變組織的一種治療 方法。光敏劑自身可以選擇性聚集在病變組織，治療時(shí)可以將輻照光源局限于病變部位，實(shí) 現(xiàn)雙重選擇。PDT的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)病變組織有選擇性殺傷，毒性低，可重復(fù)應(yīng)用，也可與手術(shù)等治 療聯(lián)合應(yīng)用。將PDT應(yīng)用于腫瘤的治療也是現(xiàn)在的熱點(diǎn)。
[0003] 光敏劑是光動(dòng)力治療的重要組成部分。竹紅菌乙素是我國(guó)首先提煉的第二代光敏 劑，是一種天然提取物質(zhì)，在相應(yīng)波長(zhǎng)的光激發(fā)下，吸收能量從基態(tài)升迀到極不穩(wěn)定的激發(fā) 態(tài)，激發(fā)態(tài)的光敏劑與相鄰物質(zhì)發(fā)生電子或氫原子轉(zhuǎn)移形成的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生自由基 或自由基離子；或者三價(jià)態(tài)光敏劑將能量傳遞給分子態(tài)氧，產(chǎn)生單態(tài)氧。此類細(xì)胞毒性物質(zhì) 可以作為治療的基礎(chǔ)。但竹紅菌乙素在光療窗口吸收低，在水中溶解度很低，當(dāng)其被注入人 體內(nèi)后，容易在血液中自發(fā)聚集，引發(fā)毛細(xì)管栓塞，限制了其在臨床上的應(yīng)用。
[0004] 為改善竹紅菌乙素的溶解性，主要有兩種方式，一是化學(xué)修飾，二是物理包裹；其 中，目前化學(xué)修飾還不能夠使竹紅菌乙素在光動(dòng)力活性不降低、毒性不增強(qiáng)的情況下，增加 其在血液中的有效運(yùn)輸。物理包裹是另一種能有效改善竹紅菌乙素溶解性的方式。
[0005] 納米技術(shù)是在20世紀(jì)80年代末、90年代初興起的邊緣學(xué)科，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于材 料制作、生物及醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。在藥劑學(xué)方面，納米載藥系統(tǒng)的出現(xiàn)，為靶向抗腫瘤藥物 的研制提供了新的途徑。應(yīng)用納米載體包裹藥物，可以增加難溶性藥物的溶解度，加強(qiáng)水溶 性藥物的穩(wěn)定性，提高藥物的生物利用度。
[0006] 光敏劑被包封入納米載體系統(tǒng)后，其在體內(nèi)的生物學(xué)分布將發(fā)生改變，與納米載 體的生物學(xué)分布密切相關(guān)。納米粒進(jìn)入血液循環(huán)后，大部分與血液中的蛋白調(diào)理素相結(jié)合， 被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES)所識(shí)別，最先被肝、脾等器官攝取，其在血液中濃度下降；僅有少部 分光敏劑經(jīng)血循環(huán)到達(dá)靶向的腫瘤組織。腫瘤組織血管生長(zhǎng)較快，其通透性也較正常血管 高，同時(shí)腫瘤組織缺乏有效的淋巴引流，因此納米粒在腫瘤組織中具有較好的滲透性和滯 留性效應(yīng)（EPR效應(yīng)），從而達(dá)到對(duì)腫瘤組織的被動(dòng)靶向。納米粒在血液中藥代動(dòng)力學(xué)主 要受載體本身的性質(zhì)如粒徑、電荷、表面的化學(xué)修飾及納米的結(jié)構(gòu)與組成等方面的調(diào)控；此 外，載體的結(jié)構(gòu)與組成、形狀等都對(duì)其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生一定的影響。為了避免血漿 調(diào)理作用及其他內(nèi)臟系統(tǒng)的攝取，一個(gè)理想的納米載體應(yīng)該保持粒徑在IOOnm左右，電位 在IOmV以內(nèi)，并且在表面進(jìn)行一定的化學(xué)修飾，進(jìn)一步篩選腫瘤特異性或高表達(dá)的受體、 抗原，將相應(yīng)的配體或單克隆抗體與納米載體相耦連，依靠靶向分子特異地識(shí)別腫瘤組織， 提高對(duì)腫瘤組織的選擇性，減少在周圍正常組織中的聚集，將實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的主動(dòng)靶向傳遞 作用，使納米光敏劑盡多的在腫瘤組織中蓄積。
[0007] 目前常用的靶向分子主要是特異性或高表達(dá)的單克隆抗體以及受體配基。但是 多數(shù)抗體僅結(jié)合在細(xì)胞膜上，無(wú)法實(shí)現(xiàn)藥物的細(xì)胞內(nèi)傳遞，同時(shí)容易引起體內(nèi)的免疫反應(yīng)， 使得體內(nèi)應(yīng)用受到很大的限制。受體配基修飾的納米載體，由于配基與受體之間的特異性 強(qiáng)、高親和力相互作用，且不易引起免疫反應(yīng)，引起人們廣泛關(guān)注，如葉酸，提高了對(duì)腫瘤組 織的識(shí)別能力，增加藥物在靶器官的濃度，同時(shí)減少對(duì)周圍組織的副作用。高親和性的葉酸 受體可轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸耦連的大分子物質(zhì)，在正常細(xì)胞通過此途徑一般不能攝取葉酸，而在腫瘤 細(xì)胞中葉酸受體大量表達(dá)，葉酸作為靶向分子，對(duì)葉酸受體有高親和性，對(duì)腫瘤組織有特異 性靶向性，且本身為小分子物質(zhì)，水溶性好，能在各種溶液中穩(wěn)定存在，無(wú)免疫原性（較抗 體），是一個(gè)理想的靶向分子。
[0008] 納米載體可以改變疏水性光敏劑的水溶性，更好的符合靜脈給藥的方式，提高生 物利用度。此外，葉酸靶向納米載體可以通過被動(dòng)及主動(dòng)靶向作用提高腫瘤組織的富集能 力，增加腫瘤組織的光敏劑含量。而納米載體的緩釋作用也會(huì)保持組織的藥物量。此種納 米粒與光動(dòng)力治療聯(lián)合可以更好的體現(xiàn)腫瘤選擇性治療，提高治療效果。
[0009] 中國(guó)專利"水溶性竹紅菌素二氧化鈦納米粒的制備方法"，開發(fā)出了一種基于二氧 化鈦的竹紅菌素納米顆粒，提高了穩(wěn)定性和單線態(tài)氧產(chǎn)率，但專利中使用的二氧化鈦在靜 脈注射到人體后難以被人體完全代謝清除，存在一定的安全隱患。
[0010] 中國(guó)專利"一種水溶性竹紅菌素 PLGA納米粒及其制備方法"，是以聚乳酸-羥基乙 酸共聚物作為載體材料，采用乳化凍干法制備成水溶性竹紅菌素 PLGA納米粒。但該專利制 備的納米粒在體內(nèi)以被動(dòng)靶向?yàn)橹鳎y以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的主動(dòng)靶向傳遞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種竹紅菌乙素納米粒及其制備 方法。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0013] -種竹紅菌乙素納米粒的制備方法，步驟如下：
[0014] (1)將載體聚合物用有機(jī)溶劑溶解，制成濃度為10-20mg/ml的溶液A ;
[0015] (2)將竹紅菌乙素用有機(jī)溶劑溶解，制成濃度為l_2mg/ml的溶液B ;
[0016] (3)將溶液A和溶液B按體積比為（1-14) : 1混合均勾，制成濃度均一的藥物聚合 物有機(jī)溶液；
[0017] (4)在攪拌條件下將步驟（3)制備的藥物聚合物有機(jī)溶液滴加到水中，藥物聚合 物有機(jī)溶液與水的體積比為1: (10-30)，靜置12-24h，制得膠束溶液；
[0018] (5)將膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，將透析袋置于水中進(jìn)行透析，將有機(jī)溶液透析出 來(lái)，即得竹紅菌乙素納米粒。
[0019] 步驟（1)中，所述載體聚合物為聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA)或聚乙二醇-聚乳酸 (PEG-PLA)和葉酸-聚乙二醇-聚乳酸（folate-PEG-PLA)的混合聚合物；混合聚合物中， 葉酸-聚乙二醇-聚乳酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8-12%，優(yōu)選為10%。將不同葉酸含量的納米粒 與細(xì)胞孵育后，用熒光顯微鏡觀察，可見小于8%時(shí)，含量是增加的，而大于12%時(shí)，葉酸濃 度增加并不能增加細(xì)胞內(nèi)熒光的強(qiáng)度，葉酸受體飽和而不能相應(yīng)集合更多的納米粒，因此， 綜合載體聚合物的靶向效果和實(shí)際生產(chǎn)成本，將混合聚合物中葉酸-聚乙二醇-聚乳酸的 質(zhì)量百分?jǐn)?shù)限定為8-12%。
[0020] 聚乙二醇-聚乳酸的分子量為15000-20000,聚合物中乙二醇：乳酸單體的摩爾比 例為（4-5) :1。聚合物的分子量，以及聚合物中疏水部分與親水部分的比例關(guān)系，會(huì)直接影 響到聚合物的膠束形態(tài)，本發(fā)明通過對(duì)聚合物分子量以及聚合物中乙二醇和乳酸單體比例 的優(yōu)化，制備的藥物聚合物的膠束形態(tài)規(guī)則，分散狀態(tài)佳。
[0021] 步驟（1)和步驟（2)中，所述有機(jī)溶劑為丙酮或四氫呋喃。本發(fā)明通過對(duì)多種不 同的有機(jī)溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用丙酮及四氫呋喃兩種有機(jī)溶劑制備的納米膠束形 態(tài)均一，分散性也好，粒徑在IOOnm左右，較其他兩種有機(jī)溶劑獲得的膠束粒徑大，因此本 發(fā)明選用丙酮或四氫呋喃這兩種有機(jī)溶劑制備納米膠束溶液。
[0022] 步驟（4)中，攪拌采用磁力攪拌，攪拌速度為300-1200rpm/min ;優(yōu)選為660rpm/ min。攪拌可改變?nèi)芤褐懈鞒煞譂舛鹊姆植?，有利于各種成分的分散，攪拌速率比較低溶液 中成分不均勻，納米粒成形不好，攪拌速率增加，溶液中的成分相對(duì)均勻，保持其他條件不 變的情況下，粒徑會(huì)變小且粒徑比較均勻，但轉(zhuǎn)速太大，反而會(huì)破壞納米粒的形成。
[0023] 步驟（4)中，藥物聚合物有機(jī)溶液的滴加速度為20-30滴/分鐘。藥物聚合物有 機(jī)溶液的滴加速度對(duì)膠束的形成也會(huì)產(chǎn)生影響，滴加速度過快，則形成的膠束的粒徑大，粒 度分布寬，穩(wěn)定性差；滴加速度過慢，雖然形成的膠束的粒度分布均勻，穩(wěn)定性好，但滴加時(shí) 間太長(zhǎng)，使生產(chǎn)周期加長(zhǎng)。因此，掌握好藥物聚合物有機(jī)溶液的滴加速度對(duì)保證制備膠束的 工藝穩(wěn)定性和產(chǎn)品性能有重要影響。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟（4)中，藥物聚合物有機(jī)溶液滴加完成后繼續(xù)攪拌2_3h，防治膠束 粘連。
[0025] 步驟（4)中，在4°C條件下靜置12-24h。
[0026] 步驟（5)中，透析袋的截留分子量為3500KDa。
[0027] 采用上述方法制備的竹紅菌乙素納米粒形態(tài)規(guī)則，分散佳，納米粒直徑為 50-200nm，成均勻球形。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] (1)聚乙二醇-聚乳酸為兩親性聚合物，其組成的納米粒既可以有效地溶于水溶 液，其內(nèi)部疏水區(qū)域可以為脂溶性藥物提供空間，從而提高光敏劑的水溶性，改變其在體內(nèi) 的分布，從而提高藥物的療效。聚乳酸在體內(nèi)分解為單體乳酸，可以在肝內(nèi)轉(zhuǎn)化為葡萄糖， 從而提供能量。而聚乙二醇是美國(guó)食品藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)可用于人體的高分子化合 物。葉酸是一種人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，參與人體多種重要的代謝反應(yīng)。因此，上述材料制備 的納米粒對(duì)人體毒副作用較小。此外，一般的聚乙二醇-聚乳酸聚合物較多見，但本次使用 的聚乙二醇-聚乳酸聚合物有端氨基（其結(jié)構(gòu)為H2N-PEG-b-PLA)，可以連接葉酸基團(tuán)，就增 加了納米粒的作用效果。
[0030] (2)本發(fā)明制備的納米粒經(jīng)透射電鏡觀察，形態(tài)呈球形，規(guī)則，分散性佳，均勻不粘 連。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射儀粒徑測(cè)定，不同膠束粒徑在120-130nm左右，粒徑分布圖呈正態(tài)分布， 進(jìn)一步證明膠束形態(tài)規(guī)則均一，分散均勻，優(yōu)化的制備方案是成功的。藥物包封率較高。藥 物膠束溶液在常溫下放置一周，無(wú)藥物釋放出，進(jìn)一步證實(shí)藥物包封入納米顆粒的核心，且 較穩(wěn)定。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為空白納米膠束的透射電鏡圖；
[0032] 圖2為空白納米膠束的粒徑分布；
[0033] 圖3為竹紅菌乙素納米膠束透射電鏡圖；
[0034] 圖4為竹紅菌乙素納米膠束的粒徑分布。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解 釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0036] 實(shí)施例1 :竹紅菌乙素納米粒制備條件的優(yōu)化
[0037] 1.制備方法的考察
[0038] 分別采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法、透析法和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)透析法進(jìn)行納米粒的制備，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法 將藥物及納米材料的溶液滴加到水中，以一定的轉(zhuǎn)速攪拌獲得膠束溶液。而