本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及一種白蛋白納米粒及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病中最主要的腫瘤，大約占40％，主要分為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤兩種。在過(guò)去的幾年中，盡管傳統(tǒng)的治療方式(如手術(shù)、放療和化療)的水平提高很多，但是腦腫瘤患者的生存期并沒(méi)有得到顯著地提高，仍然為不到兩年?；熑匀皇侵委熌X膠質(zhì)瘤的主要方式。而化療由于血腦屏障的存在，使得腫瘤局部的藥物濃度較低，加上化療藥物的毒副作用明顯，因此療效不佳。一般來(lái)說(shuō)，聯(lián)合應(yīng)用兩種或兩種以上藥物，是克服不良的毒性和其他副作用的一個(gè)比較有前途的戰(zhàn)略，并且可以減少化療藥物的劑量和到達(dá)作用的靶點(diǎn)。

盡管在開(kāi)發(fā)治療途徑中做了巨大的努力，但是，腦腫瘤的治療仍然是腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。治療腦腫瘤的障礙主要有以下幾點(diǎn)：1、腦部結(jié)構(gòu)復(fù)雜；2、許多腦腫瘤是異質(zhì)性和侵入性的；3、很難確定腫瘤邊緣和侵入的腫瘤；4、治療藥物在腫瘤的部位不能蓄積；5、化療后期產(chǎn)生耐藥。血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，從而阻礙藥物以及載藥系統(tǒng)等進(jìn)入到腦腫瘤。除此之外，許多化合物進(jìn)入腦部都被血腦屏障上高表達(dá)的包括p-糖蛋白之類的atp結(jié)合盒所限制。因此，有效的靶向腦膠質(zhì)瘤的唯一辦法就是確定一個(gè)載藥系統(tǒng)，既可以跨越血腦屏障而防止被abc蛋白排出，又可以殺死腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

白蛋白是一個(gè)分子量為66kda的血清的主要組成部分的蛋白，由于它的醫(yī)學(xué)意義，充足，低毒，低免疫原性，所以是常用的藥物載體。并且，白蛋白可以通過(guò)epr效應(yīng)較好的蓄積在惡性腫瘤和炎癥部位。考慮到白蛋白的epr效應(yīng)和較好的在腫瘤間隙的累積，因此將白蛋白開(kāi)發(fā)為藥物載體是廣受歡迎的。另外，據(jù)報(bào)道穿膜肽可以導(dǎo)致明顯的瘤內(nèi)攝取和滲透。

在治療腦腫瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)了一些在腦腫瘤中高表達(dá)的受體，包括sparc(富含半胱氨酸的分泌蛋白)，可以與白蛋白特異性的結(jié)合。gao等發(fā)現(xiàn)了白蛋白納米?？梢暂^好地蓄積在腫瘤部位并發(fā)揮藥效(gaoh,wangy,chenc,etal.incorporationoflapatinibintocore–shellnanoparticlesimprovesboththesolubilityandanti-gliomaeffectsofthedrug[j].internationaljournalofpharmaceutics,2014,461(1):478-488.)。當(dāng)白蛋白納米粒在體內(nèi)通過(guò)各種糖蛋白如gp60形成小窩并內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤部位，可被sparc特異性的結(jié)合，從而形成一個(gè)類似儲(chǔ)藥池的作用，使腫瘤細(xì)胞更容易凋亡被殺死。因此，白蛋白納米?？梢暂^好的富集在腫瘤部位，不僅是由于大小尺寸在100nm左右的epr效應(yīng)所致，更重要的是腫瘤上面sparc的高表達(dá)。

目前制備白蛋白納米粒的常用方法有兩種：交聯(lián)法與高壓勻質(zhì)法。前者需要用到毒性較大的交聯(lián)劑(如戊二醛)，殘留試劑嚴(yán)重影響用藥安全。后者采用高壓勻質(zhì)法，通過(guò)專用設(shè)備對(duì)白蛋白溶液進(jìn)行高壓勻質(zhì)令其變性形成納米粒。這兩種方法存在設(shè)備要求復(fù)雜、制備的白蛋白納米粒產(chǎn)品包載能力弱以及安全性差等的缺陷。因此，仍需要一種安全便捷的方法來(lái)生產(chǎn)可以包載多種藥物的具有增強(qiáng)的載藥能力的白蛋白納米粒。

藥物維甲酰酚胺(4-hpr)是維a酸的人工合成衍生物，臨床上維甲酰酚胺已經(jīng)作為乳腺癌(veronesiu,marianil,decensia,etal.fifteen-yearresultsofarandomizedphaseiiitrialoffenretinidetopreventsecondbreastcancer[j].annalsofoncology,2006,17(7):1065-1071.)，膀胱癌(sabichial,lernersp,atkinsonen,etal.phaseiiipreventiontrialoffenretinideinpatientswithresectednon–muscle-invasivebladdercancer[j].clinicalcancerresearch,2008,14(1):224-229.)等癌癥的預(yù)防用藥。研究發(fā)現(xiàn)其主要的副作用為眼睛適應(yīng)黑暗能力減弱，皮膚黏膜干燥，瘙癢，蕁麻疹以及胃腸道不適等輕微癥狀(cazzanigam,varricchioc,montefrancescoc,etal.fenretinide(4-hpr):apreventivechanceforwomenatgeneticandfamilialrisk？[j].biomedresearchinternational,2012)。因此，它是一個(gè)新興的有前景的抗腫瘤藥物，對(duì)于腫瘤的化療具有重要意義。但是維甲酰酚胺的抗腫瘤機(jī)制研究的并不是十分清楚。

紫杉醇(ptx)是一直被廣泛應(yīng)用于實(shí)體瘤包括腦膠質(zhì)瘤的抗腫瘤藥。然而，由于紫杉醇較差的水溶性故必須使用表面活性劑比如蓖麻油。但是蓖 麻油通常會(huì)給病人帶來(lái)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。為了避免蓖麻油的過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)又可以保持藥物的溶解性，取而代之有多種藥物制劑形式，如，脂質(zhì)體，聚合物納米粒，膠束等等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛深入的研究，最終得到本發(fā)明。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種白蛋白納米粒的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由上述方法制備的白蛋白納米粒。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述白蛋白納米粒在藥物制備中的用途。

因此，根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種白蛋白納米粒的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)將白蛋白(優(yōu)選牛血清白蛋白)溶解于ph范圍為6-9，優(yōu)選8.0-8.3，更優(yōu)選8.3的脲溶液(所述脲溶液的濃度范圍優(yōu)選為1-20mol/l，更優(yōu)選5-8mol/l)中混勻后，加入(優(yōu)選在反應(yīng)體系中最終濃度范圍為0.001-1mol/l，更優(yōu)選0.01-0.1mol/l)硼氫化鈉溶液，即得到變性白蛋白的脲溶液。

2)將適量無(wú)水乙醇加入到所述白蛋白變性的脲溶液中，然后加入純化水，即形成白蛋白納米粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)一步包括在上述步驟1)之前用多肽或其他分子修飾白蛋白的步驟。優(yōu)選地，所述多肽與白蛋白通過(guò)交聯(lián)劑交聯(lián)，更優(yōu)選地，通過(guò)雙功能的4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(smcc)進(jìn)行交聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述多肽是穿膜肽或靶向肽，優(yōu)選為分子量為1-2kda的穿膜肽(如低分子量魚精蛋白或tat)或者靶向肽(如t7、rgd或lrp1)，所述其他分子為甘露糖或葉酸等。在一個(gè)實(shí)施例中，所述低分子量魚精蛋白的氨基酸序列可為vsrrrrggrrrrrrc(seqidno:1)。

在一個(gè)實(shí)施例中，在上述步驟2)中，將藥物溶于無(wú)水乙醇或其他有機(jī)溶劑中作為藥物儲(chǔ)備液，取所述藥物儲(chǔ)備液在渦旋的過(guò)程中逐滴加入到步驟1)得到的白蛋白變性的脲溶液中，然后加入純化水后渦旋，由此得到包載藥物的白蛋白納米?；虬d藥物的多肽修飾的白蛋白納米粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥物為抗腫瘤藥物，優(yōu)選地，所述藥物可以包括但不限于，選自維甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一種或多種，更優(yōu)選地，所述藥物可為維甲酰酚胺或紫杉醇，最優(yōu)選為維甲酰酚胺和紫杉醇。

根據(jù)本發(fā)明的低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白(bsa-lmwp)的具體制備方法如下：

稱取5mgsmcc溶解于200μl無(wú)水dmso中，稱取200mg牛血清白蛋白(bsa)溶解于ph7.2的磷酸鹽緩沖液中，待溶解完全后，將smcc溶液逐滴加到bsa溶液中，室溫?cái)嚢?h，產(chǎn)物通過(guò)fplc分子篩進(jìn)行純化，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1ml/min。首先將desalting和fplc進(jìn)行連接，使用0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.2)作為流動(dòng)相平衡柱子約4-5個(gè)柱體積，即40-50ml，然后將反應(yīng)產(chǎn)物注入到進(jìn)樣環(huán)中，將紫外基線調(diào)為零后以1ml/min的速度樣品進(jìn)入到desalting中，約3min后通過(guò)程序設(shè)定儀器收集洗脫出來(lái)的紫外峰，等待紫外基線恢復(fù)到零后，依次進(jìn)行下一針的純化。稱取6mg巰基化的低分子量魚精蛋白(lmwp)溶于1ml0.1m磷酸鹽緩沖溶液中(ph7.2)中，滴入到收集到的洗脫峰中，置于4℃，攪拌過(guò)夜。產(chǎn)物bsa-lmwp通過(guò)fplc肝素柱進(jìn)行分離，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速1ml/min。首先將heparin與fplc進(jìn)行連接，流動(dòng)相為：a相是0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.2)，b相是0.1m磷酸鹽緩沖液/2mnacl(ph7.2)，用100％b相平衡2個(gè)柱體積后，換做a相平衡4-5個(gè)柱體積，然后將樣品注入進(jìn)樣環(huán)中，紫外基線調(diào)為零，以1ml/min的流速流入柱內(nèi)，2min后即樣品全部進(jìn)入heparin中，再次進(jìn)樣2ml，待全部樣品進(jìn)完后，紫外基線為零后，換做100％b流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，通過(guò)設(shè)定儀器程序收集紫外洗脫峰，即獲得bsa-lmwp。

此外，根據(jù)本發(fā)明的空白或載藥白蛋白納米粒的具體制備方法如下：

3.0gtris堿和28.0g脲溶于水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)其ph為8.3，備用。分別稱取100mgbsa以及上述制備的bsa-lmwp溶解于400μl水中后轉(zhuǎn)移至5.6ml的脲溶液中混勻，然后加入1.05ml無(wú)水乙醇混勻，加入0.1ml硼氫化鈉溶液后8000rpm離心3min，依次室溫靜止30min，50℃水浴30min，放置室溫后備用，以制得bsa變性的脲溶液和bsa-lmwp變性的脲溶液。

空白納米粒的制備：

取0.1ml無(wú)水乙醇在渦旋的過(guò)程中逐滴加入到上述bsa變性的脲溶液或bsa-lmwp變性的脲溶液中，然后加入0.5ml純化水后渦旋，形成空白的白蛋白納米粒或者低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒。

載藥白蛋白納米粒的制備：

ptx和4-hpr溶于無(wú)水乙醇中作為藥物儲(chǔ)備液，取0.1ml在渦旋的過(guò)程中逐滴加入到bsa變性的脲溶液或bsa-lmwp變性的脲溶液中，然后加入0.5ml純化水后渦旋，形成載藥的白蛋白納米?；蛘叩头肿恿眶~精蛋白修飾的白蛋白納米粒。

通過(guò)上述方法制得的白蛋白納米粒的粒徑約為150-200nm。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種由上述的方法制備得到的白蛋白納米粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述白蛋白納米粒是多肽或其他小分子修飾的白蛋白納米粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述多肽是穿膜肽或靶向肽，優(yōu)選為分子量為1-2kda的穿膜肽(如低分子量魚精蛋白或tat)或者靶向肽(如t7、rgd或lrp1)，所述其他分子為甘露糖或葉酸等。在一個(gè)實(shí)施例中，所述低分子量魚精蛋白的氨基酸序列可為vsrrrrggrrrrrrc(seqidno:1)。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述白蛋白納米粒是包載藥物的白蛋白納米?；虬d藥物的多肽修飾的白蛋白納米粒。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥物為抗腫瘤藥物，優(yōu)選地，所述藥物可以包括但不限于，選自維甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一種或多種，更優(yōu)選地，所述藥物可為維甲酰酚胺或紫杉醇，最優(yōu)選為維甲酰酚胺和紫杉醇。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述白蛋白納米?？捎糜谥委熌[瘤，所述腫瘤為皮下腫瘤或原位腫瘤，優(yōu)選地為實(shí)體瘤，更優(yōu)選地，為腦膠質(zhì)瘤。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種白蛋白納米粒在藥物制備中的用途。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述藥物為抗腫瘤藥物，優(yōu)選地，所述藥物可以包括但不限于，選自維甲酰酚胺、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼和芬戈莫德等中的一種或多種，更優(yōu)選地，所述藥物可為維甲酰酚胺或紫杉醇，最優(yōu)選為維甲酰酚胺和紫杉醇。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述白蛋白納米粒用于包載藥物。

本發(fā)明中白蛋白納米粒的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：避免了毒性交聯(lián)劑，無(wú)需要大型專用設(shè)備，便捷可控，更為重要的是在完全變性條件下，增強(qiáng)了白蛋白的載藥能力，可實(shí)現(xiàn)兩種或兩種以上藥物的同時(shí)包載。

根據(jù)本發(fā)明的包載抗腫瘤藥物或疏水性藥物的多肽修飾的白蛋白納米粒不僅可以提高難溶性藥物的溶解度，還可以降低其引起的毒副反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的包載維甲酰酚胺和紫杉醇的低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒具有以下優(yōu)點(diǎn)：一方面，通過(guò)一種具有生物相容性，可生物降解，綠色環(huán)保，無(wú)毒的藥物載體，同時(shí)將紫杉醇和維甲酰酚胺遞送到腫瘤細(xì)胞中；另一方面，這兩個(gè)藥物相互作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，聯(lián)合低劑量的化療藥物，即可達(dá)到增效減毒的效果。

附圖說(shuō)明

圖1為根據(jù)本發(fā)明制備實(shí)施例2制備載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)的過(guò)程以及抗腫瘤作用圖。

圖2為根據(jù)本發(fā)明制備實(shí)施例1中的低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白的表征圖。其中，a為白蛋白與交聯(lián)劑smcc反應(yīng)脫鹽柱的流出圖，b為白蛋白與低分子量魚精蛋白反應(yīng)后肝素柱純化的洗脫圖，c為白蛋白與低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白的聚丙烯酰氨凝膠電泳圖。

圖3為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)和載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)的粒徑圖。

圖4為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)和載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)的透射電鏡圖。

圖5為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)和載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)的電位圖。

圖6為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2中的載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)、載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載 藥ptx+4-hpr的l-bsanp)、ptx+4-hpr以及ptx對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞u87的抑制效果。

圖7為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2中的載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)、載藥低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)、ptx+4-hpr以及ptx對(duì)u87細(xì)胞的凋亡圖。

圖8表示本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2中ptx與4-hpr聯(lián)合對(duì)u87細(xì)胞的細(xì)胞凋亡蛋白caspase3表達(dá)的影響。

圖9為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的白蛋白納米粒(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)的細(xì)胞攝取效果圖。

圖10為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的白蛋白納米粒體(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)外模擬跨越血腦屏障的細(xì)胞攝取效果圖。

圖11為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中的白蛋白納米粒(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)腫瘤球攝取效果圖。

圖12為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中的不同藥物(ptx、4-hpr+ptx、載藥ptx+4-hpr的bsanp以及載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)對(duì)荷u87腦膠質(zhì)瘤皮下瘤的動(dòng)物模型的腫瘤抑制情況。

圖13為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中的不同藥物(ptx、4-hpr+ptx、載藥ptx+4-hpr的bsanp以及載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)對(duì)荷u87腦膠質(zhì)瘤皮下瘤的動(dòng)物模型的腫瘤照片。

圖14為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中的不同藥物(ptx、4-hpr+ptx、載藥ptx+4-hpr的bsanp以及載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)對(duì)荷u87腦膠質(zhì)瘤皮下瘤的動(dòng)物模型的體重變化和臟器系數(shù)圖。

圖15為根據(jù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3中的不同藥物(ptx、4-hpr+ptx、載藥ptx+4-hpr的bsanp以及載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)對(duì)荷u87腦膠質(zhì)瘤原位瘤的動(dòng)物模型的腫瘤變化、體重變化以及臟器系數(shù)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步說(shuō)明，以下實(shí)施方式只以舉例的方式描述本發(fā)明。但這些實(shí)施并不意味著對(duì)本發(fā)明加以任何限制。很明顯，本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)內(nèi)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變通和修改。需要了解的是，本發(fā)明意欲涵蓋在所附權(quán)利要求書中包括的變通和修改。

試劑和藥品

低分子量魚精蛋白(vsrrrrggrrrrrrc(seqidno:1))(上海麗昂有限公司)；牛血清白蛋白(amersco)；4-(n-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(美國(guó)proteochem公司)；磷酸氫二鈉、十二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、硼氫化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；脲、tris堿(上海杰瑞生物科技有限公司)；維甲酰酚胺(cas：65646-68-6，南京圣賽化工有限公司)；紫杉醇(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；dmem細(xì)胞培養(yǎng)基(gibco,invitrogen，usa)；澳洲血源胎牛血清、0.25％胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗、bca試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(sigma,美國(guó))；二甲基亞砜、碳酸氫納、鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；小室(8μm，corning,usa)；ecl化學(xué)發(fā)光顯色液(westpicochemiluminescentsustral，thermoscientific,usa)；兔抗sparc(h-90)多克隆抗體(cat：sc-22574，santacruz)；兔抗caspase3多克隆抗體(cellsignalingtechnology)。

制備實(shí)施例1：低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白的合成

1.白蛋白的活化

稱取5mgsmcc溶解于200μl無(wú)水dmso中，稱取200mg牛血清白蛋白(bsa)溶解于ph7.2的磷酸鹽緩沖液中，待溶解完全后，將smcc溶液逐滴加到bsa溶液中，室溫?cái)嚢?h，產(chǎn)物通過(guò)fplc分子篩進(jìn)行純化，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流速為1ml/min。首先將desalting和fplc進(jìn)行連接，使用0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.2)作為流動(dòng)相平衡柱子約4-5個(gè)柱體積，即40-50ml，然后將反應(yīng)產(chǎn)物注入到進(jìn)樣環(huán)中，將紫外基線調(diào)為零后以1ml/min的速度樣品進(jìn)入到desalting中，約3min后通過(guò)程序設(shè)定儀器收集洗脫出來(lái)的紫外峰(參見(jiàn)圖2a)，等待紫外基線恢復(fù)到零后，依次進(jìn)行下一針的純化。

2.白蛋白與低分子量魚精蛋白偶聯(lián)

稱取6mg低分子量魚精蛋白(lmwp，序列為vsrrrrggrrrrrrc(seqidno:1))溶于1ml0.1m磷酸鹽緩沖溶液中(ph7.2)中，滴入到收集到的洗脫峰中，置于4℃，攪拌過(guò)夜。產(chǎn)物bsa-lmwp通過(guò)fplc肝素柱 進(jìn)行分離，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，流速1ml/min。首先將heparin與fplc進(jìn)行連接，流動(dòng)相為：a相：0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.2)，b相：0.1m磷酸鹽緩沖液/2mnacl(ph7.2)，用100％b相平衡2個(gè)柱體積后，換做a相平衡4-5個(gè)柱體積，然后將樣品注入進(jìn)樣環(huán)中，紫外基線調(diào)為零，以1ml/min的流速流入柱內(nèi)，2min后即樣品全部進(jìn)入heparin中，再次進(jìn)樣2ml，待全部樣品進(jìn)完后，紫外基線為零后，換做100％b相進(jìn)行洗脫，通過(guò)設(shè)定儀器程序收集紫外洗脫峰，即獲得bsa-lmwp(參見(jiàn)圖2b)。

3.bsa-lmwp樣品的保存

將收集到的洗脫峰通過(guò)bca試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，具體操作步驟為：首先將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成濃度為0.5mg/ml備用，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品按照梯度為0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml依次加入到96孔板中，補(bǔ)齊到20μl，樣品進(jìn)行同樣的操作，最后每個(gè)孔中加入200μlbca工作液(solutiona:solutionb＝50:1)，37℃靜置20min，在562nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白濃度，取50mg凍干備用。

制備實(shí)施例2：白蛋白納米粒以及低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒的制備

準(zhǔn)備脲溶液：

3.0gtris堿和28.0g脲溶于水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)其ph為8.3，備用。分別稱取100mgbsa以及上述制備的bsa-lmwp溶解于400μl水中后轉(zhuǎn)移至5.6ml的脲溶液中混勻，然后加入1.05ml無(wú)水乙醇混勻，加入硼氫化鈉溶液，其在反應(yīng)體系中最終濃度范圍為0.01-0.1mol/l，之后8000rpm離心3min，依次室溫靜止30min，50℃水浴30min，放置室溫后備用，以制得bsa變性的脲溶液和bsa-lmwp變性的脲溶液。

空白納米粒的制備：

取0.1ml無(wú)水乙醇在渦旋的過(guò)程中逐滴加入到上述bsa變性的脲溶液或bsa-lmwp變性的脲溶液中，然后加入0.5ml純化水后渦旋，形成空白的白蛋白納米?；蛘叩头肿恿眶~精蛋白修飾的白蛋白納米粒。

載藥白蛋白納米粒的制備：

ptx和4-hpr溶于無(wú)水乙醇中作為藥物儲(chǔ)備液，取0.1ml在渦旋的過(guò)程中逐滴加入到bsa變性的脲溶液或bsa-lmwp變性的脲溶液中，然后加入 0.5ml純化水后渦旋，形成載藥的白蛋白納米粒或者低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1：白蛋白納米粒以及低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒的體外表征實(shí)驗(yàn)

(1)粒徑和電位

取純化后的白蛋白納米粒(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)各100μl，用純化水稀釋到終體積為1ml，使用馬爾文粒徑儀進(jìn)行粒徑和電位的測(cè)定，結(jié)果如圖3和圖5所示。

(2)tem

將白蛋白納米粒(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)分別滴加到預(yù)先水化后的銅網(wǎng)上，1min后吸干，滴加醋酸釉負(fù)染1min后自然晾干。用透射電鏡對(duì)白蛋白納米粒進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果如圖4所示。

(3)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

制備的bsanp和l-bsanp分別溶解于10％fbs的磷酸鹽緩沖液中(ph7.4)，放置于37℃中，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)(12h，24h，48h，72h)取部分進(jìn)行粒徑的測(cè)定。

(4)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

考察白蛋白納米粒(bsanp)和低分子量魚精蛋白修飾的白蛋白納米粒(l-bsanp)在腦膠質(zhì)瘤u87上的攝取情況。具體操作如下：首先待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，消化并收集兩種細(xì)胞，吹打均勻后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞種在24孔板中，每孔加入500μl密度為2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)上清，將混有標(biāo)記有fitc的bsanp和l-bsanp的新鮮培養(yǎng)基分別加入到各自孔中孵育1h，然后將培養(yǎng)上清棄去，用pbs洗三遍，加入4％多聚甲醛37℃固定10min，棄去多聚甲醛，用pbs洗三遍后，加入dapi孵育20min，用pbs清洗三遍后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。為了定量考察兩種細(xì)胞對(duì)bsanp和l-bsanp的攝取情況，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟同上，分別給予混有標(biāo)記有fitc的bsanp和l-bsanp的新鮮培養(yǎng)基，孵育1h后，用pbs清洗一遍，胰酶消化并收集細(xì)胞，3000rpm離心5min后，用pbs再洗兩遍，加入500μlpbs置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。

(5)體外模擬血腦屏障

選擇bend.3細(xì)胞構(gòu)建體外血腦屏障。具體操作方法是：將bend.3細(xì)胞消化并收集后接種于transwell小室的上室中，接種后隔天換液，五天后，細(xì)胞致密，將u87細(xì)胞種與小室的下室，每孔20000細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，分別將標(biāo)記有fitc的bsanp和l-bsanp加入到上室中，并且保持上室與下室的液面齊平。孵育4h后，用胰酶消化并收集下室的u87細(xì)胞，pbs清洗三遍后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖10所示。

(6)體外腫瘤球?qū)嶒?yàn)

為了進(jìn)一步考察白蛋白納米粒的穿透能力，更接近于腫瘤的真實(shí)環(huán)境，使用腫瘤球作為體外模擬腫瘤的模型。具體操作步驟如下：首先，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行預(yù)處理，即將0.1％的瓊脂糖加入96孔板中，冷卻后備用。然后消化并收集u87細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，以2×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞種與96孔板中，隔天換液，一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將包載香豆素-6的bsanp和l-bsanp分別于腫瘤球進(jìn)行孵育4h，然后用冷pbs洗三遍后進(jìn)行激光共聚焦的拍攝，結(jié)果如圖11所示。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2

mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴藍(lán)，商品名：噻唑藍(lán))法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別測(cè)定紫杉醇，紫杉醇+維甲酰酚胺，載有紫杉醇和維甲酰酚胺的白蛋白納米粒bsanp以及載有紫杉醇和維甲酰酚胺的穿膜肽修飾的白蛋白納米粒l-bsanp體外抗腫瘤效應(yīng)

mtt法檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

首先在腦膠質(zhì)瘤u87細(xì)胞上驗(yàn)證維甲酰酚胺和紫杉醇可聯(lián)合使用殺死細(xì)胞。具體操作步驟為：消化并收集細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml，將細(xì)胞種于96孔板中，每孔5000個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)放置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后將ptx、ptx+4-hpr、載藥ptx+4-hpr的bsanp和載藥ptx+4-hpr的l-bsanp四組分別給藥，給藥濃度按照紫杉醇的濃度計(jì)算，濃度范圍為0.1025-8μg./ml，其中ptx和4-hpr的用量比為1：1，培養(yǎng)48h后，將20μlmtt溶液加入，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后小心吸去培養(yǎng)上清，每孔加入200μldmso，37℃孵育15min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)板的od值，根據(jù)公式存活率(survivalrate，sr)＝實(shí)驗(yàn)組平均od值/對(duì)照組平均od值×100％，計(jì)算各組的細(xì)胞存活率。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

具體操作方法：消化并收集u87細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞分組為，空白組，dmso處理的陽(yáng)性對(duì)照組，ptx、ptx+4-hpr、載藥ptx+4-hpr的bsanp、載藥ptx+4-hpr的l-bsanp四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別按照紫杉醇的濃度進(jìn)行給藥，給藥濃度是2μg/ml，ptx和4-hpr的用量比為1：1，即：ptx(2μg/ml)、ptx(2μg/ml)+4-hpr(2μg/ml)、載藥bsanp(ptx(2μg/ml)+4-hpr(2μg/ml)、載藥l-bsanp(ptx(2μg/ml)+4-hpr(2μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集培養(yǎng)上清，并消化收集細(xì)胞，pbs洗二遍，棄去上清，加入1×annexinbindingbuffer重懸細(xì)胞后，再加入5μlalexaflour488annexinv，避光孵育20min后，再加入pi工作液孵育5min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，用流式細(xì)胞儀相關(guān)軟件分析結(jié)果。

結(jié)果如下：

(1)通過(guò)mtt法檢測(cè)白蛋白納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。相同的紫杉醇濃度下，紫杉醇與維甲酰酚胺聯(lián)合應(yīng)用組的ic50明顯低于單純紫杉醇組(ic50＝7μg/ml)，白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)組的ic50與紫杉醇和維甲酰酚胺組的相當(dāng)，然而修飾穿膜肽的白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)組ic50明顯低于未修飾的白蛋白納米粒。分析原因：可能是白蛋白納米粒通過(guò)sparc主動(dòng)靶向到u87細(xì)胞表面是需要時(shí)間并消化能量的，沒(méi)有游離藥物直接起作用的快；并且藥物包載到納米粒中釋放也是需要一定時(shí)間，所以與游離藥物相比，細(xì)胞抑制作用不明顯。修飾穿膜肽后，會(huì)促進(jìn)納米粒穿透細(xì)胞膜，可以較多的進(jìn)入到胞內(nèi)發(fā)揮作用，在一定程度上抵消了以上所述劣勢(shì)。

(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)u87細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析如圖7所示。紫杉醇濃度為2μg/ml時(shí)，ptx組凋亡為9.69％，ptx+4-hpr組為14.1％，載藥ptx+4-hpr的bsanp組為24.8％，載藥ptx+4-hpr的l-bsanp組是27.6％。可以看出ptx+4-hpr組是單獨(dú)ptx組的1.5倍，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)也證明維甲酰酚胺可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)也證明穿膜肽修飾的白蛋白納米粒在相同濃度下可以誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞數(shù)是游離藥物組的2倍。

紫杉醇與維甲酰酚胺聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白的作用

caspase家族是一種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡的起始階段和執(zhí)行過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中caspase3是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí) 行者，出于細(xì)胞凋亡的核心，對(duì)整個(gè)細(xì)胞凋亡的過(guò)程起著重要的作用。在正常細(xì)胞中caspase3以沒(méi)有激活的酶原形式存在，只有在凋亡信號(hào)下才使其激活成活性caspase3，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究維甲酰酚胺與紫杉醇共同作用可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過(guò)westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白可以看出：同樣濃度為2μg/ml的維甲酰酚胺幾乎沒(méi)有凋亡，與空白相比cleavedcaspase3水平基本沒(méi)有變化，而紫杉醇組的cleavedcaspase3水平略有提高，證明紫杉醇引起u87細(xì)胞的凋亡，然而在紫杉醇和維甲酰酚胺的共同作用下，procaspase3下調(diào)，相應(yīng)的cleavedcaspase3表達(dá)量上調(diào)(見(jiàn)圖8)，證明維甲酰酚胺與紫杉醇共同作用可以促進(jìn)u87細(xì)胞的凋亡，結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡一致。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3

包載藥物的白蛋白納米粒在腦膠質(zhì)瘤皮下移植瘤和腦原位瘤上的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

(1)u87移植瘤的建立

消化并收集u87細(xì)胞，1000rpm離心3min后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。置于冰水浴中，保持細(xì)胞活力。

將待種瘤的blbc/nude小鼠置于生物安全柜中，異氟烷麻醉后，用75％酒精棉球擦拭待種瘤部位，消毒。然后用移液槍吹勻細(xì)胞，使用1ml無(wú)菌注射器吸去200μl懸液，注入皮下，按壓片刻后放回籠子。隨時(shí)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。待瘤體積為100-200mm³，即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

(2)u87原位瘤的建立

消化并收集穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素的u87細(xì)胞(luc-u87細(xì)胞)，1000rpm離心3min后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml。置于冰水浴中，保持細(xì)胞活力。

待小鼠麻醉后，將其固定在腦立體定位儀裝置上，剪開(kāi)頭皮，找到顱骨冠狀縫與矢狀縫的交匯點(diǎn)，以此點(diǎn)為坐標(biāo)原點(diǎn)確定三維空間的位置，分別向左移動(dòng)2mm，向下移動(dòng)1.8mm，即為接種腦腫瘤的正確位置；用顱鉆鉆開(kāi)頭骨，用微量注射器將細(xì)胞緩慢注入小鼠左腦內(nèi)，完畢后，緩慢抽出進(jìn)樣器；縫合傷口，放回動(dòng)物房，每天觀察裸鼠的飲食、運(yùn)動(dòng)和健康狀況等，約一周以后腹腔注射熒光素酶(30mg/kg)，10min后應(yīng)用小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)。

(3)荷皮下移植瘤裸鼠抗腫瘤效應(yīng)

將u87移植瘤隨機(jī)分為五組，每組四只，具體為pbs組(空白對(duì)照組)、紫杉醇組(ptx)，紫杉醇+維甲酰酚胺組(4-hpr+ptx)、載藥白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的bsanp)組、載藥低分子量魚精蛋白修飾白蛋白納米粒(載藥ptx+4-hpr的l-bsanp)組。給藥劑量按照紫杉醇的劑量計(jì)算，即，ptx(4mg/kg)組的紫杉醇濃度為4mg/kg。4-hpr+ptx組、載藥ptx+4-hpr的bsanp組和載藥ptx+4-hpr的l-bsanp組的紫杉醇濃度均為2mg/kg，與之相對(duì)應(yīng)的4-hpr也為2mg/kg。給藥方式選擇尾靜脈注射給藥。每?jī)商旖o藥一次，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)與寬，電子稱稱量體重，整個(gè)給藥周期為18天，共給藥8次。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，采用co2窒息儀將所有動(dòng)物安樂(lè)死，剖離主要臟器(包括心肝脾肺腎)，稱重后浸泡于4％多聚甲醛中，選取代表性的做he病理切片。剖離腫瘤，pbs洗凈后，稱重并拍照。按照下述公式計(jì)算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝(1－t/c)×100％

其中，t：治療組平均瘤重；c：陰性對(duì)照組平均瘤重。

(4)荷腦原位瘤裸鼠抗腫瘤效應(yīng)

待原位腦腫瘤接種6天后隨機(jī)分為五組，每組4只，分組情況和給藥方法同上。分別在第10天，第17天，第24天通過(guò)腹腔注射熒光素酶，觀測(cè)腦部腫瘤大小，且每?jī)商旆Q量體重。

圖13是在給藥過(guò)程中的腫瘤體積的增長(zhǎng)圖。從圖中可以看出，相對(duì)于紫杉醇+維甲酰酚胺組，載藥且修飾有穿膜肽的白蛋白納米粒組可以看到腫瘤有明顯的減小。同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn)，高劑量的紫杉醇組(4mg/kg)與白蛋白納米粒組抗腫瘤效果相當(dāng)，即表明該白蛋白納米粒在保證治療效果的基礎(chǔ)上可以顯著減少化療藥物紫杉醇的劑量。這也減少了對(duì)動(dòng)物的毒副作用。圖13直觀地顯示了給藥完成后各組的腫瘤照片。從圖中可以看出，注射pbs組(空白對(duì)照組)的小鼠腫瘤明顯較大，而修飾有穿膜肽的白蛋白納米粒組有明顯的減小。同樣在腦原位瘤動(dòng)物模型結(jié)果圖15a發(fā)現(xiàn)pbs組腦瘤生長(zhǎng)迅速較大，且體重減輕嚴(yán)重，游離藥物組同樣動(dòng)物消瘦嚴(yán)重，考慮與游離藥物毒副作用較大有關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)剖離動(dòng)物內(nèi)臟，圖15c顯示pbs組的脾臟系數(shù)與其他實(shí)驗(yàn)組相比偏大，可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)系。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以觀察到，本發(fā)明的載藥穿膜肽修飾的白蛋白納米粒給藥體系的毒性較低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有動(dòng)物體重明顯下降的情況。

綜上，本發(fā)明的修飾有穿膜肽的白蛋白納米?？梢杂行У亟閷?dǎo)納米粒穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，釋放藥物，具有顯著的抗腫瘤效果。對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外的生長(zhǎng)抑制作用都表現(xiàn)出了明顯的作用。同時(shí)，本發(fā)明的載藥白蛋白納米粒對(duì)腦膠質(zhì)瘤的原位瘤也具有顯著的作用。