降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法，包括以下步驟：1)、先將兒茶素和原花青素等質(zhì)量混合，得混合料；在12g混合料中加入質(zhì)量濃度為1.4～1.6％的多聚磷酸鈉溶液200ml混合均勻；2)、在4～6g的殼聚糖中加水定容至1000ml，磁力攪拌后，調(diào)節(jié)pH為3.5～4.5，得殼聚糖液；3)、將步驟1)所得溶液全部加入至步驟2)所得的殼聚糖液中，所得的反應(yīng)體系于20～30℃繼續(xù)攪拌40～80min，得復(fù)方納米?；鞈乙?。
【專利說明】
降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶多酚(Tea P〇lyphen〇lS，TP)是茶葉中多酚類及其衍生物的總稱，主要有兒茶 素、黃酮類、花青素和酚酸等物質(zhì)組成，其中兒茶素類占茶多酚總量60%_90%。兒茶素為茶 葉中最主要的天然活性成分，具有多種藥理和保健活性;兒茶素具有很強(qiáng)的生物活性，大量 研究均表明兒茶素具有抗氧化清除自由基、抗心血管疾病、抑菌消炎等多種保健和藥理作 用。原花青素為存在于葡萄籽、黑枸杞、銀杏葉、松樹皮以及玫瑰花等植物中的一種天然超 強(qiáng)抗氧化劑，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)中使用最強(qiáng)的天然清除自由基的物質(zhì)。原花青素是一 種有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然 抗氧化劑。一般為紅棕色粉末，氣微、味澀，溶于水和大多有機(jī)溶劑。一般為葡萄籽提取物或 法國海岸松樹皮提取物。原花青素(葡萄籽提取物，GSPE)是一種新型高效抗氧化劑，是目前 為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，具有非常強(qiáng)的體內(nèi)活性。實(shí)驗(yàn)證明，原花青素的抗自 由基氧化能力是維生素 E的50倍，維生素 C的20倍。在結(jié)構(gòu)上，原花青素是由不同數(shù)量的兒茶 素或表兒茶素聚合而成。最簡單的原花青素是兒茶素、或表兒茶素、或兒茶素與表兒茶素形 成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體以及直至十聚體。
[0003] 黃曲霉毒素(AFT)是黃曲霉、寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存 在于污染的食品中，尤其以霉變的花生、玉米及谷類含量最多。AFT微溶于水，易溶于油脂、 氯仿和甲醇等有機(jī)溶劑。AFT對溫度的敏感性差，280°C才能裂解，因此一般的烹飪條件下不 易被破壞。1993年AFT就被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I類致癌物，是一種毒性 極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)。天然污染的食物中黃曲霉毒素 Bl(AFBl)最多，是目前已知最強(qiáng)的化學(xué)致 癌物之一，因此AFT-般以AFBl為代表，在食品監(jiān)測中作為污染監(jiān)測指標(biāo)。大量研究均表明 AFT是肝癌最強(qiáng)烈的致癌物。
[0004] 目前由于經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展、人們生活節(jié)奏的加快，加之生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的 改變，導(dǎo)致的高尿酸血癥和各種心腦血管慢性病逐漸呈現(xiàn)升高的趨勢，往往相伴有高血壓、 高血脂、高血糖等現(xiàn)代內(nèi)分泌、代謝紊亂性疾病。由于生活和工作壓力過大，往往導(dǎo)致內(nèi)分 泌發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能和各種復(fù)合疾病進(jìn)一步發(fā)生和加劇，大部分人都處于亞健 康狀態(tài)。加之各種快餐飲食和食品安全問題突出，從而使得人們在不知不覺中體內(nèi)積聚了 大量的自由基，同時(shí)可能會慢慢滋生各種疾病，尤其是肝臟損傷風(fēng)險(xiǎn)處于高危狀態(tài)。一旦飲 食中有大量黃曲霉毒素?cái)z入，肝臟的解毒和抗損傷能力不堪一擊，更加易于導(dǎo)致肝癌的發(fā) 生。因此，開發(fā)符合現(xiàn)代人生活方式并能夠抵抗黃曲霉毒素吸收和代謝所致肝損傷的新型 保健品，具有重要意義和市場前景。
[0005]目前在提高兒茶素和原花青素生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面的研究主要集中在兒茶素衍生化 物的制備和應(yīng)用上，近來年也有學(xué)者開展了兒茶素/茶多酚納米粒制劑或注射用納米乳劑 的研究，但此類研究主要是針對如何促進(jìn)天然植物多酚跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行的有益探索。然而關(guān) 于兒茶素和原花青素復(fù)方納米粒制備以及通過降低抗黃曲霉毒素生物利用度來發(fā)揮抗損 傷方面的研究尚未見報(bào)道。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道了不同濃度綠茶及茶葉渣對黃曲霉毒素 Bl導(dǎo)致 大鼠肝癌作用的影響，同時(shí)也有研究報(bào)道了茶多酚在樹駒肝癌形成中的化學(xué)預(yù)防作用，但 是上述研究只是從肝臟損傷角度來研究茶多酚對黃曲霉毒素?fù)p傷的保護(hù)或干預(yù)作用。關(guān)于 原花青素對黃曲霉毒素、肝損傷的保護(hù)功能研究也尚未見有報(bào)道。從新型兒茶素和原花青 素復(fù)方納米溶液和降低黃曲霉毒素生物利用度視角來研究對黃曲霉毒素保護(hù)功能，尚未見 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損傷的復(fù) 方納米粒的制備方法，采用該方法可以制備出能夠顯著降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損 傷的復(fù)方納米粒，使得兒茶素和原花青素協(xié)同降低黃曲霉毒素的損傷毒性。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方 納米粒制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)、先將兒茶素和原花青素等質(zhì)量混合，得混合料;在12g混合料中加入質(zhì)量濃度 為1.4~1.6% (最佳為1.5% )的多聚磷酸鈉溶液200ml混合均勻；
[0009] 2)、在4~6g的殼聚糖中加水定容至1000 ml，磁力攪拌后，調(diào)節(jié)pH為3.5~4.5(較佳 為4.0)，得殼聚糖液；
[0010] 3)、將步驟1)所得溶液（即，兒茶素和原花青素的多聚磷酸鈉溶液)全部加入至步 驟2)所得的殼聚糖液中，所得的反應(yīng)體系于20~30°C(較佳為25°C)繼續(xù)攪拌40~80min(例 如為60min)，得復(fù)方納米粒混懸液。
[0011] 作為本發(fā)明的降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法的改進(jìn)：
[0012] 所述步驟3)中，將步驟1)所得溶液（即，兒茶素和原花青素的多聚磷酸鈉溶液)于 60~80分鐘(較佳為70分鐘）內(nèi)均勻滴加至步驟2)所得的殼聚糖液中。
[0013] 作為本發(fā)明的降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法的進(jìn)一步 改進(jìn):所述步驟2)中，磁力攪拌的轉(zhuǎn)速為800~1200r/min。
[0014] 在本發(fā)明中：
[0015] 選用滿足以下條件的殼聚糖：分子量為11萬，脫乙酰度>80%，含量>99%。選用 滿足以下條件的兒茶素:總多酚含量> 98 %，其中兒茶素 EGCG> 80 %。
[0016] 步驟3)中的攪拌為200~400r/min。
[0017] 步驟1)中，根據(jù)實(shí)際需要，配制lmol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液，通過邊滴加邊測pH 方法來達(dá)到目的pH值。
[0018] 本發(fā)明的用法為：口服，用量約為10mg/kg。
[0019] 本發(fā)明在發(fā)明過程中，采用了如下的檢測方法：
[0020] 方法一、血漿中兒茶素 EGCG的定量分析方法（以EGCG溶出作為檢測指標(biāo)）
[0021]采用向0.3mL空白血漿中加入兒茶素 EGCG標(biāo)準(zhǔn)品的方法，配制濃度范圍為0.1-200mg/L的兒茶素 EGCG標(biāo)準(zhǔn)樣品，再向其中加入30yL 20 % (質(zhì)量百分濃度）的抗壞血酸，再 加入30yL 100yg/mL香蘭素作為內(nèi)標(biāo)，混合后加入3mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，振蕩Imin，6000r/ min高速離心5min，分別得有機(jī)相(位于上層)和水相(位于下層）；將水相(位于下層）用3mL 乙酸乙酯重復(fù)萃取一次(萃取條件同上），合并兩次萃取有機(jī)相，于45°C水浴中氮?dú)饬?弱氮 氣流）吹干，所得殘?jiān)肙. ImL 20 % (體積％ )的乙腈水溶液溶解，超聲振蕩后，18000r/min 高速離心3min，取20yL上清液HPLC進(jìn)樣分析。
[0022]具體為：以日本島津高效液相色譜，兩元高壓栗，紫外檢測器，大連伊利特 Hypersil BDS Cis柱(5ym，250mmX4.6mm)，流動相為乙腈:0.1% (質(zhì)量％ )梓檬酸水溶液= 10:90;柱溫30 °C，波長280nm;流速為1.0 mL · min-1;進(jìn)樣量為20yL。
[0023]備注說明：空白血漿即為沒有加入EGCG的純血漿。
[0024] 根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，以兒茶素 EGCG峰面積與內(nèi)標(biāo)香蘭素峰面積之比（Y)為縱坐標(biāo)， 以兒茶素 EGCG濃度的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r)。 同時(shí)制備含兒茶素 EGCG曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度血漿樣品0.2，10.0，50.0 mg/L作為質(zhì)控樣 品（QC)，分別按照上述樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度樣品重復(fù)5次，以樣品中 EGCG峰面積與直接溶于流動相下所測峰面積之比，計(jì)算高、中、低3種濃度下方法回收率 (即，樣品中EGCG峰面積與直接溶于流動相下所測峰面積之比=EGCG回收率）。比較以上樣 品于日內(nèi)5次和日間5次測定的峰面積的變化，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。
[0025]備注說明："日內(nèi)精密度和日間精密度"主要用于評價(jià)上述方法（即HPLC檢測方法） 的精密度和準(zhǔn)確性，以此來判斷最終檢測結(jié)果的可靠性。
[0026]結(jié)果為：
[0027]按照上述方法所得處理血漿中EGCG在0.1-200mg/L濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 0.004x+0.0002(r>0.999)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度兒茶素 EGCG回收率均大于 85%以上，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%，見表1。
[0028] 表1.血漿中兒茶素 EGCG的回收率和精密度(n = 5)
[0030]根據(jù)上述結(jié)果，我們能得知:本發(fā)明所設(shè)置的上述檢測方法能滿足本發(fā)明的兒茶 素腸道吸收度的檢測的要求。
[0031 ]方法二、評估兒茶素+原花青素復(fù)方納米粒的包封率
[0032]在本發(fā)明中，將一定體積(約2mL)的復(fù)方納米?；鞈乙河贸瑸V離心管（10000MWC0， 密理博中國有限公司）在4000r/min下離心10min，取濾膜（10000MWC0孔徑濾膜，即，為留在 濾膜上的化合物最小分子量為10000的超濾膜)下層的濾液ImU置于離心管中，按照方法一 中相同色譜條件，取離心管中的超速離心(6000r/min離心5min)后得到的過濾液進(jìn)樣分析。 計(jì)算納米粒包封率，包封率（％ ) = {(兒茶素 EGCG初始含量-濾液中兒茶素 EGCG含量)/兒茶 素 EGCG初始含量} X 100%。
[0033]方法三、血漿中黃曲霉毒素 Bl的定量分析方法
[0034]采用向0.3mL空白血漿中加入黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品的方法，配制濃度范圍為0.1 - lOOng/mL的黃曲霉毒素 BI標(biāo)準(zhǔn)樣品，混合后加入3mL正己燒進(jìn)行萃取，振蕩lmin，6000r/min 高速離心5min，分別得有機(jī)相(位于上層)和水相(位于下層）；將水相(位于下層）用3mL二氯 甲烷重復(fù)萃取一次，分別得有機(jī)相(位于下層)和水相(位于上層）；將有機(jī)相(位于下層)與 上述所得正己烷有機(jī)相合并，于45°C水浴中氮?dú)饬?弱氮?dú)饬?吹干，所得殘?jiān)?.3mL流動 相45 % (體積％ )的乙腈水溶液溶解，超聲振蕩后，18000r/min高速離心3min，取20yL上清液 HPLC進(jìn)樣分析。
[0035]具體為：美國Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，原裝色譜工作站，檢測器為原裝 2473熒光檢測器，Thermo BDS &8柱（5μπι，250mm X 4.6mm)，流動相為乙腈：水=45:55;柱溫 30 °C，激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長450nm;流速為1 · OmL · min-1;進(jìn)樣量為20yL 〇
[0036]備注說明：空白血漿即為沒有加入黃曲霉毒素 BI的純血漿。
[0037]根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，以黃曲霉毒素 Bl峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以黃曲霉毒素 Bl濃度的 質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r)。同時(shí)制備含黃曲霉毒 素 Bl曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度血漿樣品0.5，1.0，10.0!^/1作為質(zhì)控樣品（(^)，分別按照上 述樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度樣品重復(fù)5次，以樣品中黃曲霉毒素 Bl峰面積與 直接溶于流動相下所測峰面積之比，計(jì)算高、中、低3種濃度下方法回收率（即，樣品中黃曲 霉毒素 Bl峰面積與直接溶于流動相下所測峰面積之比=黃曲霉毒素 Bl回收率）。比較以上 樣品于日內(nèi)5次和日間5次測定的峰面積的變化，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。
[0038]備注說明："日內(nèi)精密度和日間精密度"主要用于評價(jià)上述方法（即HPLC檢測方法） 的精密度和準(zhǔn)確性，以此來判斷最終檢測結(jié)果的可靠性。
[0039]結(jié)果為：
[0040]按照上述方法所得處理血漿中黃曲霉毒素 Bl在0.1-100ng/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲 線為Y = 2X107X-1646.4(r>0.9999)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高、中、低濃度黃曲霉毒素 Bl回收 率均大于90%以上，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于10%，見表2。
[00411表2.血漿中黃曲霉毒素 Bl的回收率和精密度
[0043]根據(jù)上述結(jié)果，我們能得知:本發(fā)明所設(shè)置的上述檢測方法能滿足本發(fā)明的黃曲 霉毒素 Bl腸道吸收度檢測的要求。
[0044]方法四、評估兒茶素 EGCG和黃曲霉毒素的腸道吸收度以及肝損傷 [0045] 160只SPF級ICR雄性小鼠購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體重25 ± 2g，實(shí)驗(yàn) 分為4組，每組40只小鼠。將每組40只小鼠隨機(jī)分為8個(gè)小鼠籠中，每籠5只，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性 養(yǎng)殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
[0046]實(shí)驗(yàn)組一、兒茶素對照組:兒茶素+原花青素生理鹽水溶液的濃度為10mg/mL(兩者 重量之和的濃度，且兒茶素:原花青素=1:1重量比），按照IOOmg/kg體重口灌(上述IOOmg為 生理鹽水溶液中的兒茶素+原花青素的量）；將40只小鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，于實(shí)驗(yàn)前適 應(yīng)性養(yǎng)殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
[0047]實(shí)驗(yàn)組二、兒茶素+原花青素納米溶液組:將上述本發(fā)明制備的兒茶素+原花青素 的復(fù)方納米粒混懸液(例如濃度為I 〇mg/mL )，按照100mg/kg體重口灌(上述I OOmg為復(fù)方納 米粒混懸液中的兒茶素+原花青素的量）；將40只小鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng) 性養(yǎng)殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。
[0048]實(shí)驗(yàn)組三、黃曲霉毒素口灌組：按照5mg黃曲霉毒素 Bl/kg體重給小鼠口灌配制的 黃曲霉毒素溶液;將40只小鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性養(yǎng)殖一周，口灌前12h 禁食、不禁水。
[0049]實(shí)驗(yàn)組四、黃曲霉素毒素+復(fù)方納米粒口灌組:按照100mg(兒茶素+原花青素 )/kg 體重給小鼠口灌配制的兒茶素+原花青素的復(fù)方納米?；鞈乙海鲜鯥 OOmg為復(fù)方納米?；?懸液中的兒茶素+原花青素的重量，30min后同時(shí)按照5mg黃曲霉毒素 B Ι/kg體重給小鼠口灌 配制的黃曲霉毒素溶液;將40只小鼠隨機(jī)分為8組，每組5只，于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性養(yǎng)殖一周，口 灌前12h禁食、不禁水。
[0050] 將上述實(shí)驗(yàn)組和對照組，分別按照上述劑量口灌，均于口灌后5min、IOmin、15min、 3〇11^11、6〇1^11、12〇1^11、18〇1^11和24〇1^11眼球取血，每組采血5只小鼠，然后將所取血液于肝 素化離心管中，6000r/min離心后，實(shí)驗(yàn)一和實(shí)驗(yàn)二每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取0.3mL血漿于IOmL離 心管中，同時(shí)參照上述方法一處理后進(jìn)HPLC分析。將所測血漿中兒茶素 EGCG峰面積代入上 述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(方法一所得）中，計(jì)算血漿中兒茶素 EGCG濃度，繪制血藥濃度--時(shí)間曲 線，比較兒茶素+原花青素的復(fù)方納米?；鞈乙?本發(fā)明）和兒茶素+原花青素生理鹽水溶液 的血藥濃度，以此來評價(jià)復(fù)方納米粒對溶液中兒茶素在機(jī)體內(nèi)腸道吸收度的影響。
[0051] 實(shí)驗(yàn)三和實(shí)驗(yàn)四每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取0.3mL血漿于IOmL離心管中，同時(shí)參照上述方 法三處理后進(jìn)HPLC分析。將所測血漿中黃曲霉毒素 Bl峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(方法 三所得）中，計(jì)算血漿中黃曲霉毒素 Bl濃度，繪制血清黃曲霉毒素 Bl濃度--時(shí)間曲線，比 較黃曲霉毒素 Bl+復(fù)方納米?；鞈乙?本發(fā)明）和黃曲霉毒素 Bl溶液的血藥濃度，以此來評 價(jià)復(fù)方納米粒對黃曲霉毒素 Bl在機(jī)體內(nèi)生物利用度的影響。同時(shí)采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn) 氨酶檢測試劑盒對實(shí)驗(yàn)三和實(shí)驗(yàn)四中黃曲霉毒素所致肝損傷進(jìn)行評估。
[0052] 即，本發(fā)明利用實(shí)驗(yàn)動物整體小腸吸收模型，通過定量檢測本發(fā)明所得的復(fù)方納 米粒和黃曲霉毒素 Bl在腸道吸收度，制備一種能夠發(fā)揮增強(qiáng)兒茶素腸道吸收度、同時(shí)降低 黃曲霉毒素腸道吸收度的新型制劑，還同時(shí)降低黃曲霉毒素所致肝損傷，從而發(fā)揮黃曲霉 毒素?fù)p傷的保護(hù)作用。
[0053]綜上所述，本發(fā)明采用了 RP-HPLC方法分析檢測了血漿等生物樣品中兒茶素 EGCG 和黃曲霉毒素 Bl的準(zhǔn)確、定量檢測手段，檢測限分別達(dá)到微克級和納克級，完全能夠滿足小 鼠血樣中兒茶素 EGCG和黃曲霉毒素 Bl的檢測。
[0054] 即，本發(fā)明在制備兒茶素和原花青素的復(fù)方納米?；A(chǔ)上，探索該復(fù)方納米粒對 黃曲霉毒素 Bl腸道吸收度方面的協(xié)同保護(hù)作用，從而拓展兒茶素和原花青素新型功效和應(yīng) 用領(lǐng)域，充分發(fā)揮兒茶素和原花青素等天然多酚的生物活性，服務(wù)于臨床。
【附圖說明】
[0055]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施結(jié)果作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0056]圖1是兒茶素 EGCG的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖；
[0057]圖2是空白血漿的色譜圖；
[0058]圖3是服用實(shí)施例1所述的復(fù)方納米粒混懸液后小鼠血漿色譜圖；
[0059]其中峰1為兒茶素 EGCG色譜峰;峰2為內(nèi)標(biāo)；
[0060]圖4是實(shí)施例1所述的復(fù)方納米粒與普通生理溶液組EGCG濃度--時(shí)間曲線對比 圖；
[0061]圖5是黃曲霉毒素 Bl的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖；
[0062]圖6是空白血漿的色譜圖；
[0063]圖7是口灌黃曲霉毒素 Bl后的血漿色譜圖；
[0064]其中峰1為黃曲霉毒素 BI;
[0065]圖8是口灌黃曲霉毒素 Bl和黃曲霉毒素 Bl+實(shí)施例1復(fù)方納米粒后的黃曲霉毒素 Bl 濃度--時(shí)間曲線對比圖；
[0066] 圖9是口灌黃曲霉毒素 Bl和黃曲霉毒素 Bl+實(shí)施例1復(fù)方納米粒后的肝損傷對比 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0068] 實(shí)施例1、一種降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒的制備方法，依 次進(jìn)行以下步驟：
[0069] 1)、準(zhǔn)確稱取等量混合的兒茶素和原花青素共計(jì)12g(即，兒茶素和原花青素的質(zhì) 量比為1:1)，向其中加入200mL質(zhì)量濃度為1.5%的多聚磷酸鈉溶液，混合均勻；
[0070] 2)、在5g的殼聚糖中加水定容至1000 ml，于5000mL圓底燒瓶中，磁力攪拌后(轉(zhuǎn)速 1000r/min)，調(diào)節(jié)pH 4.0,得殼聚糖液；
[0071] 3)、將步驟1)中配制的溶液（即，兒茶素和原花青素的多聚磷酸鈉溶液)均勻的逐 滴緩慢滴加至2)中的圓底燒瓶中，70分鐘完成滴加(即，滴加速度約為50滴/分鐘）；
[0072] 所得的反應(yīng)體系于25°C溫度下繼續(xù)攪拌60min(轉(zhuǎn)速400r/min)，得兒茶素和原花 青素的復(fù)方納米?；鞈乙骸?br>[0073] 實(shí)施例2、一種降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒的制備方法：
[0074] 將步驟1)中兒茶素和原花青素的質(zhì)量比由1:1改成1:3;總重不變，仍為12g;
[0075] 將步驟2)中殼聚糖的用量由5g改成2g;
[0076] 其余等同于實(shí)施例1。
[0077] 實(shí)施例3、一種降低黃曲霉毒素腸道吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒的制備方法：
[0078] 將步驟1)中兒茶素和原花青素的質(zhì)量比由1:1改成3:1;總重不變，仍為12g;
[0079] 將步驟2)中殼聚糖的用量由5g改成1.5g;
[0080] 其余等同于實(shí)施例1。
[0081 ] 實(shí)驗(yàn)I、檢測納米粒包封率：
[0082]將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得的復(fù)方納米粒混懸液按照上述方法進(jìn)行檢測， 結(jié)果如下：
[0083]實(shí)施例1所得的復(fù)方納米粒混懸液的包封率（％)=75.57% ;
[0084]實(shí)施例2所得的復(fù)方納米?；鞈乙旱陌饴剩ǎ?) =53.84% ;
[0085]實(shí)施例3所得的復(fù)方納米粒混懸液的包封率（％ ) =41.94%。
[0086]實(shí)驗(yàn)2、將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得的復(fù)方納米?；鞈乙喊凑丈鲜龇椒ㄟM(jìn)行 檢測。
[0087]具體為:按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的復(fù)方納米粒混懸液；IOOmg為復(fù)方納 米粒混懸液中的兒茶素+原花青素的重量之和。
[0088]上述結(jié)果表明：本發(fā)明中所制備的復(fù)方納米粒在不同采血時(shí)間點(diǎn)血液中EGCG濃度 均顯著高于普通生理鹽水溶液組，說明本發(fā)明復(fù)方納米粒口服溶液的腸道吸收度顯著高于 普通生理鹽水溶液組。
[0089]最終結(jié)果如下表3(為平均值）。
[0090]表3、不同實(shí)施例中復(fù)方納米粒EGCG血藥濃度--時(shí)間數(shù)據(jù)(mg/L)
[0093]實(shí)驗(yàn)3、將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得的復(fù)方納米粒，按照上述方法進(jìn)行檢測。 [0094] 具體為：
[0095]按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例1所得的復(fù)方納米?；鞈乙?黃曲霉 毒素口灌，
[0096]按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例2所得的復(fù)方納米?；鞈乙?黃曲霉 毒素口灌，
[0097]按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例3所得的復(fù)方納米?；鞈乙?黃曲霉 毒素口灌，
[0098]上述IOOmg為復(fù)方納米?；鞈乙褐械膬翰杷?原花青素的重量之和。
[0099]上述結(jié)果表明：本發(fā)明中所制備的復(fù)方納米粒+黃曲霉毒素口灌，在不同采血時(shí)間 點(diǎn)血液中黃曲霉毒素 Bl濃度顯著低于單獨(dú)黃曲霉毒素口灌組，說明本發(fā)明制備的復(fù)方納米 粒口服能夠顯著降低黃曲霉毒素腸道吸收度。
[0100]最終結(jié)果如下表4(平均值）。
[0101 ]表4、不同實(shí)施例中黃曲霉毒素 Bl濃度--時(shí)間數(shù)據(jù)(ng/mL)
[0104] 實(shí)驗(yàn)4、將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得的復(fù)方納米粒，按照上述方法評估本發(fā) 明制備的復(fù)方納米粒對黃曲霉毒素所致肝損傷的保護(hù)作用。
[0105] 具體為：
[0106] 按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例1所得的復(fù)方納米粒混懸液+黃曲霉 毒素口灌，
[0107] 按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例2所得的復(fù)方納米?；鞈乙?黃曲霉 毒素口灌，
[0108] 按照100mg/kg體重給小鼠口灌配制的實(shí)施例3所得的復(fù)方納米?；鞈乙?黃曲霉 毒素口灌，
[0109] 上述IOOmg為復(fù)方納米?；鞈乙褐械膬翰杷?原花青素的重量之和。
[0110] 本發(fā)明中所制備的復(fù)方納米粒+黃曲霉毒素口灌，在240mi η時(shí)間點(diǎn)采集血液分離 血清，利用血清轉(zhuǎn)氨酶試劑盒分別檢測小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，結(jié)果表 明本發(fā)明制備的復(fù)方納米?；鞈乙嚎诜軌蝻@著降低黃曲霉毒素所致的肝損傷。
[0111] 最終結(jié)果見圖9所示。
[0112] 對比例1-1、將實(shí)施例1步驟1)中的質(zhì)量濃度為1.5 %的多聚磷酸鈉溶液改成水，體 積量不變，仍為200mL，其余等同于實(shí)施例1。
[0113] 對比例1 -2、將實(shí)施例1步驟1)中多聚磷酸鈉溶液的質(zhì)量濃度由1.5 %改成3 %，體 積量不變，仍為200mL，其余等同于實(shí)施例1。
[0114]對比例1 -3、將實(shí)施例1步驟2)中的多聚磷酸鈉溶液改成海藻酸鈉溶液，質(zhì)量濃度 不變，仍為1.5%，體積量不變，仍為200mL，其余等同于實(shí)施例1。
[0115] 對比例1 -4、將實(shí)施例1步驟2)中的多聚磷酸鈉溶液改成三聚磷酸鈉溶液，質(zhì)量濃 度不變，仍為1.5%，體積量不變，仍為20mL，其余等同于實(shí)施例1。
[0116] 對比實(shí)驗(yàn)1、檢測復(fù)方納米粒的包封率：
[0117] 將上述對比例所得的復(fù)方納米粒按照上述方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如下：
[0118] 對比例1所得的復(fù)方納米粒的包封率（％) = 16.28% ;
[0119] 對比例2所得的復(fù)方納米粒的包封率（％ ) = 56.37% ;
[0120] 對比例3所得的復(fù)方納米粒的包封率（％ ) =39.66% ;
[0121] 對比例4所得的復(fù)方納米粒的包封率（％ ) =45.75%。
[0122] 對比實(shí)驗(yàn)2、將上述對比例所得的復(fù)方納米粒按照上述方法進(jìn)行黃曲霉毒素 Bl濃 度的檢測，結(jié)果如下(平均值）：
[0123] 表5不同對比例中黃曲霉毒素 B1濃度一一時(shí)間數(shù)據(jù)(ng/mL)
[0125]對比實(shí)驗(yàn)3、按照上述方法評估上述對比例所得的復(fù)方納米粒對黃曲霉毒素所致 肝損傷的保護(hù)作用;結(jié)果如下表6。 「Π 19Α1 圭β
[0128]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明中兒茶素+原花青素復(fù)方納米?？?服溶液的具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法，其特征是包括以下步驟： 1) 、先將兒茶素和原花青素等質(zhì)量混合，得混合料;在12g混合料中加入質(zhì)量濃度為1.4 ~1.6%的多聚磷酸鈉溶液200ml混合均勻； 2) 、在4~6g的殼聚糖中加水定容至1000ml，磁力攪拌后，調(diào)節(jié)pH為3.5~4.5，得殼聚糖 液； 3) 、將步驟1)所得溶液全部加入至步驟2)所得的殼聚糖液中，所得的反應(yīng)體系于20~ 30 °C繼續(xù)攪拌40~80min，得復(fù)方納米?；鞈乙?。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法，其 特征是： 所述步驟3)中，將步驟1)所得溶液于60~80分鐘內(nèi)均勻滴加至步驟2)所得的殼聚糖液 中。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降低黃曲霉毒素吸收度和肝損傷的復(fù)方納米粒制備方法， 其特征是： 所述步驟2)中，磁力攪拌的轉(zhuǎn)速為800~1200r/min。
【文檔編號】A61P39/02GK106074494SQ201610410991
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月13日 公開號201610410991.X, CN 106074494 A, CN 106074494A, CN 201610410991, CN-A-106074494, CN106074494 A, CN106074494A, CN201610410991, CN201610410991.X
【發(fā)明人】肖英平, 楊華, 吉小鳳, 錢鳴蓉, 李銳, 王小驪, 吳俐勤
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院