靜電紡絲纖維的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靜電紡絲纖維的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]盡管現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)研究有很大的進(jìn)展，人類免疫缺陷病毒(HIV)仍然影響著數(shù)以百萬人的健康，人們?cè)趯ふ夷茴A(yù)防感染或在感染后能治愈這類病毒的方法上付出了很大的努力。在過去的25年中感染HIV和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)已成為全球嚴(yán)重的健康問題，社會(huì)和經(jīng)濟(jì)問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布人類感染HIV已成為流行趨勢(shì)。艾滋病通過性傳播為主，也可接觸通過受感染的血液或共用注射器傳播?；蛘呤峭ㄟ^妊娠期母嬰傳播。抵抗HIV病毒已被證明是非常困難的，因?yàn)樗哂泻芨叩倪z傳變異的特點(diǎn)，導(dǎo)致了當(dāng)前有效疫苗的缺乏。由于在對(duì)抗病毒本身上十分困難，所以人們將很多的精力都放在預(yù)防感染上。到目前為止，大部分的預(yù)防重點(diǎn)都放在使用安全套和行為修正上。然而，在艾滋病高發(fā)地區(qū)，由于他們的社會(huì)歧視，人們很少使用安全套并且也很少和女性協(xié)商。因此，我們迫切需要一個(gè)預(yù)防HIV感染的新方法。
[0003]—個(gè)可能有效的方法是將殺微生物劑輸送到陰道內(nèi)來預(yù)防艾滋病，這樣可以不需要合作甚至是對(duì)男性伴侶的了解。殺微生物劑是一個(gè)化學(xué)實(shí)體，可以消滅微生物，包括病毒，從而防止或減少感染的傳播。然而，目前有效的陰道抑制微生物劑有以下幾個(gè)缺點(diǎn):1)凝膠制劑往往易被排尿沖走。2)目前使用的普通殺微生物劑在大多數(shù)的活動(dòng)下會(huì)降低能效。3)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒殺微生物劑可能導(dǎo)致治療藥物對(duì)HIV毒株的抵抗性能降低。4)進(jìn)入抑制劑殺微生物劑對(duì)抵抗其他的性傳播疾病是缺乏活性的。5)殺微生物劑還存在許多不便的實(shí)際問題。盡管最初的期望很高，最近的臨床試驗(yàn)中，非特異性進(jìn)入抑制劑如硫酸纖維素和PR0-2000都沒有發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的臨床效益，原因可能是由藥物引起了胃粘膜損傷或者不一致的殺微生物劑的作用。在各種各樣的殺菌劑中，已考慮將CAP這種聚合物發(fā)展為抗艾滋病的策略。CAP誘導(dǎo)HIV糖蛋白的構(gòu)象變化(gp41和gpl20)，而這種糖蛋白能識(shí)別和結(jié)合人的⑶4受體或CCR5和CXCR4共受體，這是病毒進(jìn)入細(xì)胞必不可缺少的步驟。CAP作用于這些糖蛋白然后形成了使病毒功能失活的六螺旋束形gp41抗體。此外，CAP是一種藥用輔料，經(jīng)常作為藥片和膠囊劑的腸溶包衣劑用來避免藥物在胃的酸性腔釋的作用。有趣的是，CAP的pKa為5.28，這意味著在陰道腔的低pH下CAP可能微溶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種靜電紡絲纖維的用途，用于給陰道輸送由精液引發(fā)感染的抗艾滋病毒藥物，預(yù)防艾滋病的傳播。
[0005]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]靜電紡絲纖維在給陰道輸送由精液引發(fā)感染的抗艾滋病毒藥物中的應(yīng)用。
[0007]所述的應(yīng)用:在靜電紡絲過程中，將抗病毒藥物封裝包含在CAP纖維中，然后輸送到陰道內(nèi)，CAP纖維在陰道液中穩(wěn)定存在，在遇到人類精液后，CAP纖維會(huì)立即溶解釋并釋放出被封裝在纖維中的抗病毒藥物。
[0008]有益效果，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備和表征了 CAP電紡纖在預(yù)防艾滋病毒感染中的潛在使用性。據(jù)觀察，CAP纖維即使在溶解后，對(duì)陰道上皮細(xì)胞和陰道乳酸桿菌也沒有毒性。結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，CAP纖維在SVF中能保持完整而即使在低劑量的精液中他也會(huì)迅速溶解。CAP纖維可以很容易與抗HIV藥物結(jié)合(TMC125和Viread)，增加了 CAP纖維在性交過程中防止HIV-1傳播的可能性。
【附圖說明】
[0009]圖1是試驗(yàn)結(jié)果圖'K)靜電紡絲CAP纖維的掃描電鏡圖像；B)含有抗病毒藥物Viread(0.178mg Viread/mg CAP)的靜電紡絲CAP纖維掃描電鏡圖像；C)陰道上皮細(xì)胞和TZMbl細(xì)胞在CAP溶液中的存活率(MTT法檢測(cè));數(shù)據(jù)為平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)偏差(n = 5) ;D)CAP纖維對(duì)不同乳酸菌菌株生長(zhǎng)的影響(Lpl = L.植物乳桿菌，Lcr = L.卷曲，Lga = L.加氏乳桿菌)；
[0010]圖2是靜電紡絲CAP纖維在A)模擬陰道液(SVF)，B) SVF/人類精液(80/20)，C)SVF/人類精液(70/30)，D) SVF/人類精液(50/50)和E)人類精液中穩(wěn)定性的具有代表性的顯微照片圖；
[0011 ] 圖3是實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；A)分別在SVF和PBS中的靜電紡絲CAP纖維釋放羅丹明6G的圖像(羅丹明6G在SVF和PBS的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算釋放的羅丹明6G的濃度)。B-C)熒光顯微鏡對(duì)加載了羅丹明6G的CAP纖維分散在SVF(B)和PBS(C)的鏡像；
[0012]圖4是試驗(yàn)結(jié)果圖'K)在不同濃度CAP粉末下，TZMbl細(xì)胞對(duì)HIV-1感染的抑制。B)濃度不同的Viread在0.01mg/ml CAP纖維溶液中，TZMbl細(xì)胞對(duì)HIV-1感染的抑制。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0014]實(shí)施例1
[0015]材料:鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP，麗?60000g/moL)，MTT試劑盒，比利時(shí)；TMC125是比利時(shí)魯漢天主教大學(xué)，微生物學(xué)和免疫學(xué)系的Prof.C.Pannecouque教授贈(zèng)與。純富馬酸替諾福韋酯是從商業(yè)化的薄膜衣片中提取(替諾福韋245mg):將六片原料用研缽和研杵研成粉并末在10mL的二氯甲烷中攪拌15分鐘。得到的懸濁液與飽和碳酸氫鈉水溶液一起在分液漏斗動(dòng)搖。分層后將水層用二氯甲烷再提取兩次。合并提取的有機(jī)組分后用飽和碳酸氫鈉水溶液洗兩次和NaCl水溶液洗一次。最后，所有的水層混合，用氫氧化鈉溶液(pH多9)堿化并用二氯甲烷提取最后一次。合并的有機(jī)餾分用無水硫酸鈉干燥，真空除去所有揮發(fā)物，得到4克的無色油狀物。將得到的油狀物用硅膠柱進(jìn)一步純化，此硅膠柱是由用核磁表征過的不含替諾福韋酯的純二氯甲烷加入梯度濃度的甲醇組成。從健康志愿者中得到的人類精液樣本。
[0016]CAP靜電紡絲纖維:CAP纖維網(wǎng)是靜電紡絲用丙酮/DMF混合液(3: I)為溶劑的CAP溶液(25% W: V)得到的。靜電紡絲裝置是由一個(gè)高電壓電源(40千伏)，注射器，平頭針和接地集電極組成。將ImL的CAP溶液在lmL/h的流速下紡絲。紡絲后，纖維網(wǎng)在室溫下干燥。同樣的方式靜電紡絲含TMC-125，Viread和羅丹明6G的CAP纖維，即用不同濃度的藥物和(0.3mg/0.25g CAP)羅丹明6G，添加到CAP溶液進(jìn)行電紡。
[0017]掃描電鏡:少量CAP纖維固定后通氮?dú)飧稍?，然后噴度金。SEM圖像是用FEIQuanta 200FEG掃描電子顯微鏡(FEI Europe供應(yīng)商，埃因霍溫，荷蘭)。在15千伏的加速電壓下操作記錄得到的。
[0018]模擬陰道液的制備:氯化鈉(3.51g)，氫氧化鉀(1.4g)，氫氧化鈣(0.222g)，牛蛋白血清(0.018g)，乳酸(2g)，乙酸(Ig)，甘油(0.16g)，尿素(0.4g)和葡萄糖(5g)溶解在IL的水中。用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至4.2。
[0019]CAP纖維在模擬陰道液和精液中的行為:轉(zhuǎn)移適量體積的人類精液和SVF在離心管中混勻得到二者的混合物。研究(精液/SVF) 100/0，50/50，30/70，20/80，0/100這幾組比值。為監(jiān)測(cè)CAP纖維在這些樣品的行為，將0.1mL的液體添加到Icm2CAP纖維網(wǎng)上固定在顯微鏡載玻片上及時(shí)用熒光顯微鏡(ez-cl尼康，尼康BELUX，比利時(shí))成像觀察。
[0020]細(xì)胞培養(yǎng):永生化人陰道上皮細(xì)胞均從ATCC購買并且在37°C和在含5% CO2的潮濕氛圍中培養(yǎng)。將細(xì)胞保存在無血清的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司，比利時(shí))中。培養(yǎng)基中添加了重組人表皮生長(zhǎng)因子(0.1ng ^mL1),牛垂體提取物(0.05ng.mL 3和高濃度氯化I丐(0.4ng.mL:) (Gibco, Invitrogen公司，比利時(shí))。當(dāng)70-80%融合和1/5分裂時(shí)細(xì)胞繁殖。從NIBSC獲得的TZMbI細(xì)胞，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(Lonza)并添加了 10%胎牛血清(Lonza)，50mg/mL慶大霉素(Lonza)和200Nm/L的谷氨酰胺(Lonza)。細(xì)胞一周更新兩次。
[0021]毒性試驗(yàn):為了測(cè)試或陰道上皮細(xì)胞或TZMbl細(xì)胞的活性，將細(xì)胞接種于24孔孔板(50細(xì)胞/孔)中沉淀過夜。然后將細(xì)胞置于CAP溶液和CAP纖維中5h。細(xì)胞活力的評(píng)估是在24h后根據(jù)制造商的指示用MTT法與未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活力的比較。
[0022]抗菌活性測(cè)定:卷曲乳桿菌(LMG 11440)，加氏乳桿菌(LMG 13134)和植物乳桿菌(LMG 9208)都是從 BCCM/LMG Bacteria Collect1n (根特，比利時(shí))得到的。在 37°C在有氧條件下，細(xì)菌在Man/Rogosa/Sharpe (MRS)瓊脂(Oxoid，Drongen，比利時(shí))可維持生存。最小抑菌濃度(MICs)是根據(jù)藥物微量肉湯稀釋法使用平底96孔板(TPP，trasadingen，瑞士)來測(cè)定的。為此，將1mL過夜培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過離心收集，然后再懸浮(稀釋10倍)在兩倍強(qiáng)度MRS肉湯中。將100 μ I這樣的細(xì)胞懸液和將CAP纖維分散在0.85% (W/V)氯化鈉(測(cè)試的濃度范圍是從0.05 μ gCAP每mL到0.1mg CAP每mL)的溶液100 μ I加入到一個(gè)96孔板的微量滴定板中。將微量滴定板在37°C條件下培育24小時(shí)，然后用一個(gè)Envis1n多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(I自金埃爾默，Vilvoorde,比利時(shí))測(cè)定其吸光度(590nm)。
[0023]羅丹明6G釋放的研究:纖維(0.1% )加載羅丹明6G后靜電紡絲并空氣干燥。將I毫克這樣的加載了羅丹明6G的CAP纖維放入含ImL PBS或SVF的微量離心管中。用熒光光譜法測(cè)定上清液中的羅丹明濃度(激發(fā)光:528nm，發(fā)射