本發(fā)明涉及一種ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜的制備，尤其涉及一種采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備ica-sf/plcl納米纖維膜的方法；本發(fā)明同時(shí)還涉及該方法制備的ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜作為gbr膜的應(yīng)用，屬于復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域和醫(yī)藥材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

牙種植術(shù)目前已成為牙列缺損或缺失的首選修復(fù)方法；然而，由炎癥（如肉芽組織）引起的骨缺損嚴(yán)重影響手術(shù)成功率。越來(lái)越多研究表明，引導(dǎo)骨再生（gbr）技術(shù)可有效恢復(fù)牙槽骨的高度和豐滿度，其原理是：通過阻礙成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞長(zhǎng)入骨缺損區(qū)而發(fā)揮屏障功能，并使成骨細(xì)胞附著、增殖增加，促進(jìn)骨再生。

目前市場(chǎng)應(yīng)用于gbr的材料，包括生物不可降解的聚四氟乙烯，該材料需二次手術(shù)取出，增加感染和膜暴露幾率。因此，越來(lái)越多學(xué)者致力于生物可降解膜。bio-gide?是一種臨床常用的生物可降解膜，研究表明，其具有良好的生物相容性，低抗原性，足夠的機(jī)械性能和適益的降解性。為更好的誘導(dǎo)骨再生，復(fù)合性gbr膜（膜材料與骨誘導(dǎo)物質(zhì)如生長(zhǎng)因子相結(jié)合）已成為目前研究的熱點(diǎn)。

淫羊藿苷（icariin，ica，c33h40o15，分子量：676.67）是從中藥總黃酮中提取的主要活性成分，其具有多種重要的生理活性，如促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化以治療骨代謝疾病，及免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)，ica可治療絕經(jīng)后婦女的骨量喪失，通過增加opn、bmp表達(dá)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞，最終恢復(fù)骨強(qiáng)度。同時(shí)，ica明顯抑制破骨細(xì)胞形成。因此認(rèn)為，ica可以作為骨組織工程的成骨誘導(dǎo)劑。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，ica可以在體內(nèi)外顯著促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞（hpdlscs）的增殖和成骨分化。

聚l-丙交酯(plla)，具有良好的生物相容性和可降解性，使其更適宜在藥物控制釋放及組織工程等方面中應(yīng)用。

絲素（sf）是一種天然結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的生物學(xué)特性，如良好的細(xì)胞粘附性，可控降解率，機(jī)械強(qiáng)度，滲透性和抗酶降解性。它已經(jīng)廣泛研究組織工程和控制藥物輸送系統(tǒng)。

同軸靜電紡絲是制備納米或亞微米纖維支架的簡(jiǎn)單、有效方法，其在組織工程和藥物傳遞體系得到廣泛應(yīng)用。其具有高的表面積/體積比，可以促進(jìn)細(xì)胞附著，實(shí)現(xiàn)藥物卸載，并且達(dá)到持續(xù)和受控的藥物局部釋放。之前研究已證實(shí)，一些生物分子可成功包裹于納米纖維中，保持生物活性，纖維直徑可通過控制同軸靜電紡絲過程參數(shù)來(lái)控制。

因此，本發(fā)明采用同軸靜電紡絲技術(shù)擬制備一種ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜，并對(duì)膜的理化性能、降解、釋藥及體內(nèi)和外體對(duì)骨再生的作用進(jìn)行研究，以期成為能持續(xù)釋放ica，促進(jìn)骨再生功能的gbr膜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜的方法；

本發(fā)明的另一目的是提供上述方法制備的ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜作為誘導(dǎo)骨再生膜（gbr）的應(yīng)用。

一、ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜的制備

本發(fā)明ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜的制備，包括以下工藝步驟：

（1）再生絲素蛋白的制備：將蠶繭浸于na2co3溶液中煮沸脫膠，并用蒸餾水洗滌除去絲膠，干燥后在75~85℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶劑體系中，然后于蒸餾水中室溫下透析3~5d，過濾，冷凍干燥，獲得再生絲素蛋白。

所述na2co3溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2~0.5%；煮沸脫膠2次，每次0.5~1h；

所述cacl2/ch3ch2oh/h2o三元溶劑體系中，cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩爾比為1/2/8。

（2）殼層紡絲液的制備：將上述所得再生絲素蛋白與plcl以1:2.3~1:2.5的質(zhì)量比溶于六氟異丙醇中，且使再生絲素蛋白與plcl的總質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5~8%，常溫磁力攪拌5~6h，獲得殼層紡絲液。plcl的mw在1,000,000以上。

（3）芯層紡絲液的配制：將ica配制成濃度10^-5μmol/l的水溶液作為芯層紡絲液；

（4）同軸靜電紡絲制備ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜：將配制好的芯層紡絲液、殼層紡絲液分別裝入注射器中，連接同軸電紡雙噴頭，并與高壓靜電發(fā)生裝置相連接；控制同軸電紡噴頭與接收板間電壓為12~15kv，距離為12~15cm，芯層紡絲液、殼層紡絲溶液推進(jìn)速度分別為0.1ml/h和1.0ml/h，在溫度25±2℃，相對(duì)濕度50±6%的環(huán)境下進(jìn)行電紡，獲得電紡絲膜；再使電紡絲膜與戊二醛水溶液于密閉環(huán)境下交聯(lián)反應(yīng)45~50h，真空干燥，得ica-sf/plcl納米纖維膜樣品。

戊二醛溶液的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為25%。電紡絲膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm時(shí)，戊二醛的用量為10ml。

二、ica-sf/plcl納米纖維膜表征

1、掃描電鏡(sem)

將干燥保存?zhèn)溆玫臉颖?3×3mm)，真空噴金處理60s，應(yīng)用jsm-4800型掃描電鏡(jeol,tokyo,japan)于10kv電壓條件下觀察。應(yīng)用imagej圖像處理軟件(nationalinstitutesofhealth,md,usa)隨機(jī)選取纖維（n≧100），計(jì)算其平均直徑，并繪制纖維直徑分布圖。

ica-sf/plcl納米維膜sem圖像及纖維直徑分布圖如圖2顯示，見纖維表面形貌光滑連續(xù)，纖維直徑均一形成三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，無(wú)串珠樣結(jié)構(gòu)形成；纖維平均直徑為451.57±80.33nm，分布范圍為200~700nm，與天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，且納米級(jí)直徑纖維具有高的比表面積，可為細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)提供理想的微環(huán)境，同時(shí)納米級(jí)纖維可攜載更多藥物。

2、透射電鏡(tem)

在紡絲過程中，用碳膜噴涂的銅網(wǎng)在電場(chǎng)中小心接取一定量的纖維絲，真空干燥至有機(jī)溶劑充分揮發(fā)（約需7d）后，在100kv電壓條件下，應(yīng)用feitecnaif3型透射電鏡（fei,usa）觀察纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

從ica-sf/plcl納米維膜的透射電鏡圖（圖3）可以看到，沿纖維長(zhǎng)軸走向其內(nèi)部形成明顯的芯殼結(jié)構(gòu)。該芯殼結(jié)構(gòu)形成的機(jī)理為：在同軸電紡過程中，殼層與芯層紡絲液在噴口處匯合，由于匯合時(shí)間短，加上聚合物擴(kuò)散系數(shù)低，因此，芯殼層溶液固化前不會(huì)混合。同時(shí)，在高壓靜電場(chǎng)力作用下，芯殼層溶液的復(fù)合液滴表面聚集大量電荷，在電場(chǎng)力的作用下拉伸形成具有芯殼結(jié)構(gòu)的納米纖維。其中，含原子數(shù)相對(duì)較多的ica在tem檢測(cè)過程中由于吸收電子相對(duì)較多，因此在tem圖像上顯示為相對(duì)較暗的纖維芯層，相對(duì)應(yīng)的，sf/plcl顯示為纖維殼層，這暗示著中藥單體ica被成功包裹于纖維內(nèi)部，形成了有效的藥物儲(chǔ)庫(kù)型緩釋系統(tǒng)。

3、x射線衍射(xrd)測(cè)試

制備的ica-sf/plcl納米纖維膜（15×15mm）采用d/max-2400型x射線多晶衍射儀（rigaku,tokyo,japan）對(duì)膜進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。測(cè)試條件設(shè)置為：掃描速度為6°/min，功率為40kv/150ma，掃描范圍10~60°。

x射線衍射通過檢測(cè)材料衍射峰出現(xiàn)的位置，分析材料內(nèi)部分子或原子結(jié)構(gòu)以確定材料的結(jié)構(gòu)特征。以往的研究關(guān)于絲素蛋白和plcl構(gòu)象表明，silkⅰ在x射線衍射測(cè)試中主要衍射峰接近12.2°、19.7°、24.7°和28.2°，plcl靜電紡絲膜在23.6°附近出現(xiàn)明顯的衍射峰。silkⅰ結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，構(gòu)象規(guī)整性差；而silkii由于主要由結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較好的β折疊構(gòu)成，其構(gòu)象規(guī)整性相對(duì)較好，穩(wěn)定性好。ica-sf/plcl納米纖維膜的x射線衍射分析結(jié)果如圖4所示，圖像在17.2°左右出現(xiàn)新的衍射峰，而未檢測(cè)到其他明顯的衍射峰存在，說(shuō)明芯層藥物ica的加入，對(duì)材料分子結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯影響。電紡后的膜經(jīng)2.5%的戊二醛交聯(lián)，絲素蛋白晶體結(jié)構(gòu)的α螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的β折疊，結(jié)晶度增強(qiáng)，材料性能穩(wěn)定性增加。

4、接觸角檢測(cè)

納米纖維膜（20×30mm）平整固定于親水角測(cè)試儀，吸取30μl去離子水小心低至膜表面，5s后，拍照并測(cè)量水滴切線與膜表面間的夾角，作為樣本接觸角。需在膜表面5個(gè)不同測(cè)試點(diǎn)分別測(cè)量，計(jì)算其平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

材料的潤(rùn)濕性與細(xì)胞的粘附、增殖和遷移等行為密切相關(guān)。研究證實(shí)，純plcl纖維膜的接觸角為139.57°，其疏水性較強(qiáng)，表面不利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)。而本研究的ica-sf/plcl載藥纖維膜的接觸角檢測(cè)結(jié)果（圖5）為125.72±4.93°，其親水性較純plcl纖維膜增加，因此，芯層藥物的加入可以增加膜的親水性，從而有利于細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)。

5、拉伸強(qiáng)度測(cè)試

樣本（10×50mm）兩端寬10mm部分小心夾持于anscmt8102型電子萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（hounsfield,uk）的夾具上，中間30mm作為測(cè)試區(qū)。檢測(cè)前，需用精密游標(biāo)卡尺測(cè)量樣本平均厚度。以10n測(cè)試力、1mm/min測(cè)試速度進(jìn)行樣本的拉伸強(qiáng)度測(cè)試，并繪制相應(yīng)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

gbr膜需足夠的機(jī)械強(qiáng)度以抵抗周圍軟組織壓力，以維持有效的骨組織生長(zhǎng)空間，避免缺損區(qū)塌陷，利于骨細(xì)胞的增殖分化。sf結(jié)構(gòu)類似天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，為天然的細(xì)胞支架材料，但其力學(xué)性能較差；而plcl機(jī)械性能較好，將plcl與sf共混，可改善sf力學(xué)性能差的缺點(diǎn)。ica-sf/plcl納米纖維膜力學(xué)性能檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，其拉伸強(qiáng)度為（5.54±0.46）mpa，力學(xué)性能良好，能滿足臨床gbr膜的強(qiáng)度要求。

6、體外釋藥行為檢測(cè)

將一定量的ica-sf/plcl納米纖維膜經(jīng)紫外線正反面消毒各1h后，浸泡于30ml無(wú)菌pbs溶液，置于37℃、100rpm的恒溫水浴振蕩器震蕩，分別于測(cè)試的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30d的同一時(shí)間點(diǎn)，取5ml釋放液，同時(shí)加入同體積的新鮮pbs溶液。從載藥膜釋放獲得的ica的量，通過應(yīng)用uv2600型紫外分光光度計(jì)（shimadzu,japan）在λmax=270nm處檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的釋放液的吸光度值計(jì)算得到，繪制藥物的累積釋放曲線。

藥物緩釋系統(tǒng)以穩(wěn)定速率將藥物釋放于靶位點(diǎn)，可提供局部有效藥物濃度，并避免全身藥物副作用。ica-sf/plcl載藥纖維膜體外釋藥結(jié)果如圖7所示，從該藥物累積釋放曲線可以看出，整個(gè)藥物釋放過程呈現(xiàn)兩個(gè)階段：初期的藥物快速釋放階段（最初的5d，藥物累積釋放率達(dá)47.54±0.06%）和之后的藥物穩(wěn)定緩慢釋放階段(最終藥物累計(jì)釋放率為82.09±1.86%)。發(fā)生這兩個(gè)階段的其原因?yàn)椋涸谒幬飶牟牧厢尫诺某跗?，靠近載藥纖維表面的少量藥物首先快速釋放于周圍介質(zhì)，之后由于材料在介質(zhì)中的逐漸降解，纖維表面形成一些微孔，使得芯層藥物進(jìn)一步以擴(kuò)散的方式穩(wěn)定、緩慢的釋放出來(lái)，從而可延長(zhǎng)藥物從材料中釋放的時(shí)間，降低釋放速率，從而實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋，達(dá)到發(fā)揮藥物最大功效的目的。

7、體外降解性能

樣本紫外線消毒，20ml無(wú)菌pbs（ph=7.4）為本研究的降解介質(zhì)，置于37℃、100rpm的恒溫振蕩器連續(xù)震蕩，分別于測(cè)試的0、1、2、4、6周的同一時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取樣，蒸餾水沖洗干凈，干燥，用掃描電鏡及電子萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)分別對(duì)ica-sf/plcl納米纖維膜表面形貌及力學(xué)性能變化進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

理想的可植入材料的降解應(yīng)與再生組織的生成同步發(fā)生。ica-sf/plcl載藥纖維膜體外降解結(jié)果如圖8所示。掃描電鏡圖片觀察發(fā)現(xiàn)，降解開始前，膜纖維表面連續(xù)光滑，之后由于降解介質(zhì)的沖刷作用及芯層藥物的不斷釋放，纖維表面開始變得粗糙，出現(xiàn)明顯的蠶蝕狀空洞，但纖維膜整體結(jié)構(gòu)尚存。同時(shí)，從每個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖9）可以看出，隨著降解現(xiàn)象的存在，ica-sf/plcl載藥纖維膜中的部分纖維斷裂，膜整體力學(xué)性能降低。說(shuō)明該載藥纖維膜具有生物可降解性。

三、體外實(shí)驗(yàn)

1、bmmscs的分離、培養(yǎng)與鑒定

從蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買3~4周齡雄性生理狀況良好的sd大鼠，采用過量麻藥（水合氯醛）處死，立即浸泡于盛有體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的容器中10min，置于無(wú)菌操作臺(tái)的手術(shù)板。嚴(yán)格無(wú)菌條件下獲得股骨，用含10%雙抗的無(wú)菌pbs沖洗3~5遍，剪去骨骺端，5ml注射器吸取含1%雙抗(gibco)、10%fbs的l-dmem(hyclone,usa)反復(fù)沖洗骨髓腔至骨質(zhì)發(fā)白，加入一定量完全培養(yǎng)液，將沖出的骨髓吹打混勻成單細(xì)胞懸液，于5%co2、37°c恒溫孵箱培養(yǎng)。24h后半量換液，之后每2~3天換液。細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%時(shí)傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞進(jìn)行以下相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究。應(yīng)用流式細(xì)胞儀（bdfacscanto，usa）檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記，進(jìn)行細(xì)胞鑒定：取p3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的bmmscs，用0.25%胰酶充分消化細(xì)胞，1000rpm離心5min，用含1%bsa的pbs清洗細(xì)胞3~5次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，依次加入單克隆抗體cd34、cd44、cd45和cd90。同時(shí)每管設(shè)立陰性對(duì)照。避光冰上孵育45min，用含1%bsa的pbs再次清洗細(xì)胞3~5次，清除未結(jié)合抗體，接著，用500μl含1%bsa的pbs將細(xì)胞重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如附圖1所示，分離培養(yǎng)的p3代bmmscscd44，cd90陽(yáng)性表達(dá)率較高，陽(yáng)性率分別為94.9%和98.3%，而cd34，cd45陽(yáng)性率很低，分別為0.1%和0.7%，綜合以上數(shù)據(jù)，這些細(xì)胞是來(lái)自骨髓的bmmscs。

2、膜體外成骨性能檢測(cè)

將制備的ica-sf/plcl納米纖維膜按100g/l的比例浸泡于含10%胎牛血清的l-dmem培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%co2條件下連續(xù)浸提72h，離心過濾后獲得浸提液。備用。

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的p3代bmmscs以1.0×10⁴cells/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10ml完全培養(yǎng)液，37℃、5%co2孵箱中孵育；24h后，實(shí)驗(yàn)組加入浸提液培養(yǎng)，對(duì)照組用普通完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每三天換液。用2%茜素紅染液（genmedscientificsinc.,usa）進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)14d后，4%多聚甲醛固定，37℃條件下，茜素紅染色30min檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)。

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的p3代bmmscs胰酶消化后，按1×10⁴個(gè)/ml接種于3塊96孔板上，37℃、5%co2孵箱中孵育24h后，棄去舊培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分為2組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組加入浸提液，對(duì)照組加入普通完全培養(yǎng)液，每3天換液一次。分別于第3、7、14d取一塊96孔板，棄培養(yǎng)液，pbs清洗3遍，每孔加入500μl1%的tritonx-100(ambion,bylifetechnologies)，37℃培養(yǎng)箱裂解1h，收集細(xì)胞裂解液，按堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京，中國(guó)）說(shuō)明依次加入各試劑，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（elx800,bio-tek,winooski,vt,usa）于520nm處測(cè)定各孔alp值，以均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（應(yīng)用spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過單因素方差分析（anova）評(píng)價(jià)各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。）。

3、纖維膜體外誘導(dǎo)骨向分化檢測(cè)

茜素紅染色及alp活性檢測(cè)通常用來(lái)成骨分化標(biāo)志物的檢測(cè)。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的p3代bmmscs經(jīng)ica-sf/plcl載藥纖維膜的浸提液培養(yǎng)14天后，茜素紅染色后可觀察到，細(xì)胞周圍出現(xiàn)明顯礦化結(jié)節(jié)，有橘紅色區(qū)域呈現(xiàn)（圖10a）。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的p3代bmmscs經(jīng)ica-sf/plcl載藥纖維膜的浸提液分別培養(yǎng)3，7，14d后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)alp表達(dá)活性。發(fā)現(xiàn)第3，7，14d，實(shí)驗(yàn)組相比較于對(duì)照組，alp活性明顯升高(p＜0.05)。且在浸提液作用下，3-7d時(shí)alp活性增長(zhǎng)幅度最大（圖10b）。

4、細(xì)胞在膜表面形態(tài)學(xué)觀察

ica-sf/plcl納米纖維膜（10×10mm）紫外線正反面消毒后，用含10%雙抗的pbs沖洗3遍，置于無(wú)菌24孔板底部，備用。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bmmscs經(jīng)0.25%胰酶消化后，反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×10⁴細(xì)胞/孔的密度接種于膜表面，并用消毒鋼圈固定，滴加一定量的完全培養(yǎng)液，于37℃、5%co2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，48h全量更換培養(yǎng)液。

細(xì)胞接種培養(yǎng)5d后，棄出舊培養(yǎng)基，pbs洗滌3遍，用2.5％的戊二醛固定1h，接著再用pbs沖洗3遍，用已配制好的系列梯度濃度乙醇（30％，50％，70％，90％，95％和100％）進(jìn)行細(xì)胞脫水，細(xì)胞脫水結(jié)束后進(jìn)行冷凍干燥6h，噴金處理60s，用掃描電鏡(s-3400n;jeol,tokyo,japan)觀察細(xì)胞在膜表面的黏附情況。

掃描電鏡（圖11）圖像顯示，bmmscs接種于ica–sf/plcl載藥纖維膜表面5d后，細(xì)胞在膜表面粘附、生長(zhǎng)良好，細(xì)胞突起沿纖維走向廣泛伸展，并相互融合。tian報(bào)道，細(xì)胞在材料表面的粘附隨纖維直徑的減小而增加（纖維在50nm至10mm范圍內(nèi)）。這種變化可歸因于纖維的更大的表面，為細(xì)胞粘附提供更多的接觸位點(diǎn)。

5、膜細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用體外四甲基偶氮唑鹽（thiazolylbluetetrazoliumbromide，mtt）法進(jìn)行ica-sf/plcl載藥纖維膜的細(xì)胞毒性檢測(cè)。具體的實(shí)驗(yàn)分組包括：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組（無(wú)ica-sf/plcl載藥纖維膜）、空白組（無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液），每組均設(shè)有6個(gè)復(fù)孔。分別于接種培養(yǎng)后的1、3、5、7d各取一塊24孔培養(yǎng)板，用移液槍每孔加入mtt液(sigma,usa)（質(zhì)量濃度為5g/l）40μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，每孔再滴加dmso400μl，搖床震蕩30min，使結(jié)晶完全溶解。移液槍按每孔100μl轉(zhuǎn)移至96孔板，用elx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(elx800,bio-tek,winooski,vt,usa)在490nm處檢測(cè)吸光度值。

理想的載藥膜應(yīng)最大化藥物治療作用，同時(shí)毒副作用最小。mtt結(jié)果（圖12）表明，bmmscs接種于ica–sf/plcl載藥纖維膜表面培養(yǎng)1、3、5、7d后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的od值都隨時(shí)間推移呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明在有膜和無(wú)膜條件下，細(xì)胞數(shù)量都隨時(shí)間變化在增多。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的od值均大于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。證實(shí)該載藥纖維膜不具有細(xì)胞毒性，適宜細(xì)胞的生長(zhǎng)。

四、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1、動(dòng)物模型的制作和材料植入

27只健康成年雄性sd大鼠（3–4周齡,80–100g）隨機(jī)分為三組：i）測(cè)試組（ica-sf/plcl納米纖維膜覆蓋骨缺陷區(qū)域，n=3）;ii）陰性對(duì)照組（sf/plcl膜覆蓋骨缺陷區(qū)域，n=3）;iii）和空白對(duì)照組（骨缺陷區(qū)域無(wú)膜覆蓋，n=3）。無(wú)菌手術(shù)過程如下：10％水合氯醛（0.35ml/100g體重）腹腔注射麻醉，待麻醉顯效后，備皮，局部消毒，顱頂正中作一縱行約2mm切口，分層切開，充分暴露顱骨，在大量生理鹽水沖洗冷卻下，用打磨機(jī)慢速以顱骨正中矢狀線為中線，作一直徑為8mm的圓形全層骨缺損，勿損傷硬腦膜。分別植入上述三種材料，使其超出骨缺損范圍約2mm，軟組織復(fù)位并逐層嚴(yán)密縫合。生理鹽水清洗手術(shù)區(qū)域，并局部涂布抗生素軟膏。術(shù)后所有動(dòng)物在溫暖環(huán)境中蘇醒后，轉(zhuǎn)移至動(dòng)物房進(jìn)行術(shù)后護(hù)理。

2、μ-ct評(píng)估骨生成

分別于術(shù)后4、8、12周每組分別安樂處死3只動(dòng)物，獲得顱骨，小心剔除附著的軟組織，4％多聚甲醛固定24h。應(yīng)用quantumfx型μ-ct（perkinelmer，hopkinton，ma，usa）進(jìn)行掃描，其工作條件為：調(diào)整電壓為90kv、電流為200μa、視野72mm和掃描分辨率為4.5μm。使用μ-ct圖像分析軟件（skyscan，kontich，belgium）對(duì)圖像三維重建后進(jìn)行新骨體積和骨礦物質(zhì)密度的測(cè)量。

為評(píng)價(jià)ica-sf/plcl納米纖維膜體內(nèi)促進(jìn)成骨作用，本實(shí)驗(yàn)制備了大鼠顱骨直徑為8mm的完全骨缺損。缺損區(qū)植入材料4、8、12周后，通過μ-ct評(píng)價(jià)新骨生成。實(shí)驗(yàn)期間，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物植入部位均無(wú)炎癥或壞死。μ-ct三維重建圖像（圖13）顯示，與對(duì)照相比，ica-sf/plcl納米纖維膜組在術(shù)后4、8、12周顯示更多的新骨生成。

進(jìn)一步應(yīng)用μ-ct圖像分析軟件進(jìn)行新骨體積和密度的定量分析（圖14a，b）。結(jié)果顯示，術(shù)后4周，ica-sf/plcl納米纖維膜組骨缺損區(qū)新骨形成統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：新骨體積和密度分別為1.08±0.48mm³和1.04±0.46％。ica-sf/plcl納米纖維膜組與sf/plcl組新骨生成量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），無(wú)膜覆蓋組幾乎觀察不到新骨形成。術(shù)后8周，所有組均有新骨形成，與sf/plcl組及無(wú)膜覆蓋組比較，ica-sf/plcl納米纖維膜組骨缺損愈合顯著較快，新骨體積和密度分別為6.09±1.27mm³、6.43±0.17％。sf/plcl組與無(wú)膜覆蓋組新骨生成體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。術(shù)后12周，雖然所有組均顯示有新骨生成，但在ica-sf/plcl納米纖維膜組，新生骨已擴(kuò)展覆蓋大部分缺陷區(qū)域，新骨體積和密度分別為約15.95±3.58mm³和14.02±0.93％，顯示最快和最多骨形成。而sf/plcl組和無(wú)膜覆蓋組的新骨形成僅局限于缺損中心或在缺損邊緣。因此，我們證實(shí)了從ica-sf/plcl納米纖維膜釋放的ica的具有體內(nèi)成骨分化活性。

3、組織學(xué)檢測(cè)

固定后的樣本經(jīng)脫鈣復(fù)合液（甲酸12ml、鹽酸8ml、甲醛5ml、蒸餾水75ml）脫鈣、梯度酒精脫水后，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精和伊紅(nanjingjianchengbiotechnologyinstitute)染色，光鏡（olympus，ix70，japan）下觀察。使用imagej軟件（nationalinstitutesofhealth，md，usa）定量分析新骨形成，并計(jì)算新骨面積與總?cè)睋p面積比。

術(shù)后4、8、12周樣本進(jìn)行組織學(xué)分析進(jìn)一步表征新骨形成，并計(jì)算新骨面積與總?cè)睋p面積的比率（圖13）。術(shù)后4周，ica-sf/plcl納米纖維膜組和sf/plcl組均可觀察到有新骨生成，但無(wú)膜覆蓋組其骨缺損區(qū)被大量纖維結(jié)締組織填充，幾乎無(wú)新骨生成。術(shù)后8周，ica-sf/plcl納米纖維膜組顯示比sf/plcl組或無(wú)膜覆蓋組更多的新骨形成。其中無(wú)膜覆蓋組可觀察到大量纖維結(jié)締組織。術(shù)后12周，ica-sf/plcl納米纖維膜組新骨面積顯著高于其他組。sf/plcl組是與纖維脂肪組織混合的新骨填充骨缺陷，無(wú)膜覆蓋組只有一些纖維結(jié)締組織。

綜上所述，我們利用同軸靜電紡絲成功制備了ica-sf/plcl納米纖維膜，骨促進(jìn)生長(zhǎng)因子ica可包裹于纖維中而無(wú)結(jié)構(gòu)完整性或功能的變化。體外成骨誘導(dǎo)分化和體內(nèi)應(yīng)用于骨缺損實(shí)驗(yàn)表明，該載藥膜可持續(xù)、有效地釋放ica而顯著促進(jìn)骨生成，且無(wú)細(xì)胞毒性。因此，應(yīng)用同軸電紡技術(shù)制備的ica-sf/plcl納米纖維膜是一種有前景的gbr膜。

附圖說(shuō)明

圖1為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。

圖2為ica-sf/plcl載藥纖維膜sem圖（a：×5000，b：×10000）和纖維直徑分布圖(c)。

圖3為ica-sf/plcl載藥纖維tem圖（×50000）。

圖4為ica-sf/plcl載藥纖維膜xrd圖。

圖5為ica–sf/plcl載藥纖維膜的親水角。

圖6為ica–sf/plcl納米纖維膜應(yīng)力-應(yīng)變曲線。

圖7為ica–sf/plcl納米纖維膜體外藥物釋放曲線。

圖8為ica–sf/plcl載藥纖維膜表面形態(tài)（a~e）注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

圖9為ica–sf/plcl載藥纖維膜拉伸強(qiáng)度(a~e)變化。注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

圖10為bmmscs培養(yǎng)于ica-sf/plcl納米纖維膜浸提液后的茜素紅染色結(jié)果（a）及alp分（b）。

圖11為觀察bmscs與ica-sf/plcl載藥纖維膜復(fù)合后的細(xì)胞形態(tài)的sem（左：×1500；右：×3500）

圖12為bmscs在ica-sf/plcl載藥纖維膜上培養(yǎng)不同時(shí)間增殖情況。注：ica代表ica–sf/plcl載藥纖維膜組。

圖13為顱骨缺損的μ-ct圖像。

圖14為定量分析骨缺損區(qū)的新骨體積（a）j及密度百分比（b）。*與對(duì)照相比，骨形成明顯增多（注：*p<0.05，**p<0.01。sf表示sf/plcl膜組；ica表示ica-sf/plcl納米纖維膜組）。

圖15為顱骨缺損的新骨形成的組織學(xué)分析。（a）顱骨缺損的he染色圖像。比例尺=0.2mm。（b）定量分析顱骨缺損中新骨面積百分比。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明采用同軸靜電紡絲技術(shù)制備ica-sf/plcl納米纖維膜的方法作進(jìn)一步的說(shuō)明。

（1）再生絲素蛋白的制備：將蠶繭（浙江桐廬，中國(guó)）浸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的na2co3溶液中煮沸脫膠2次，每次1h；并用蒸餾水洗滌3此除去絲膠，50℃干燥12h后，再在80℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶劑體系中（cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩爾比為1/2/8），然后于蒸餾水中室溫下透析4d，過濾，冷凍干燥，獲得再生絲素蛋白sf。

（2）殼層紡絲液的制備：將上述所得sf與plcl以1:2.3~1:2.5的質(zhì)量比溶于六氟異丙醇中，且使sf與plcl（mw=1,000,000;naramedicaluniversity,japan）的總質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為8%，常溫磁力攪拌6h，獲得殼層紡絲液；

（3）芯層紡絲液的配制：將ica配制成濃度10^-5μmol/l的水溶液作為芯層紡絲液；

（4）同軸靜電紡絲制備ica-sf/plcl復(fù)合納米纖維膜：將配制好的芯層紡絲液、殼層紡絲液分別裝入10ml注射器中，連接同軸電紡雙噴頭，并與高壓靜電發(fā)生裝置（dw-p503-1acdf；北京，中國(guó)）相連接；控制同軸電紡噴頭與接收板間電壓為15kv，距離為15cm，芯層紡絲液、殼層紡絲溶液推進(jìn)速度分別為0.1ml/h和1.0ml/h，在溫度25℃左右，相對(duì)濕度50±6%的環(huán)境下進(jìn)行電紡，獲得電紡絲膜；再使電紡絲膜用25%的戊二醛（國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）（電紡絲膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm時(shí)，戊二醛的用量10ml）作為交聯(lián)劑置于密閉玻璃干燥皿內(nèi)交聯(lián)48h，真空干燥，即得ica-sf/plcl納米纖維膜樣品。