一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫pcr現(xiàn)場快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內(nèi)引物組成。采用本發(fā)明可以定性定量檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌。本發(fā)明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設(shè)計4條引物，識別靶序列的6個區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定性檢測時不需任何特殊設(shè)備，只需眼觀反應(yīng)管道顏色變化即可判定，因此具有特異性、敏感性高和檢測時間比普通PCR短、適用于養(yǎng)殖場場現(xiàn)場的快速檢測等特點(diǎn)。
【專利說明】-種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試 劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的一種人畜共患急性傳染病，該菌廣泛分 布于自然界，也是動物腸道中的常在菌之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生多種外毒素，對豬、牛、 羊、雞、兔、犬、人等多種動物具有致病性，導(dǎo)致壞死性腸炎、腸毒血癥是該菌感染的典型特 征。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的動物猝死癥，一般發(fā)病快、病程短、死亡率極高，往往來不及治 療，對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類健康造成嚴(yán)重威脅。
[0003] 牛猝死癥是由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型菌導(dǎo)致的，也有C、D型菌致病。國外報道的是以 C、D型菌導(dǎo)致牛的壞死性腸炎或腸原性毒血癥較多。病牛主要表現(xiàn)為病初厭食、精神不振、 不愿走動、體溫升高、鼻鏡干燥、呼吸困難、心跳加快隨后表現(xiàn)不安、腹痛、排稀糊狀帶血的 腥臭糞便，最后口吐白沫，倒地痙攣而死。
[0004] 兔腸毒血癥是由產(chǎn)氣莢膜梭菌是由A型或E型菌引起的腸毒血癥，多發(fā)于斷奶后 至成年的家兔。臨診癥狀為病兔精神沉郁，但體溫不高，食欲不佳或絕食，病初糞便變形變 稀，很快排帶血、膠凍樣或黑色水樣糞便，急劇腹瀉，個別病例雖經(jīng)藥物治療可停止水瀉，但 死亡率高達(dá)100%。
[0005] A型菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的雞散發(fā)性腸黏膜壞死時，最急性者突然發(fā)病迅 速衰弱死亡，看不到明顯癥狀；急性感染雞精神沉郁、羽毛蓬亂、胸骨著地、食欲減弱、排帶 血糞便。多數(shù)。多數(shù)病雞冠瞼青紫，少數(shù)呈蒼白色，致死率高；輕癥病例表現(xiàn)一般中毒癥狀 2?3d后逐漸好轉(zhuǎn)，隨食欲增加而康復(fù)。
[0006]C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起豬猝死癥多見于3日齡仔豬，表現(xiàn)為紅色血便，也稱作仔 豬。病豬體質(zhì)虛弱、排出含組織碎片的紅褐色稀糞，死亡率在12%，10齡后部分仔豬出現(xiàn)白 痢，后逐漸恢復(fù)正常。少數(shù)病豬沒有下血痢便昏倒和死亡。
[0007] 羊猝疽、羊腸毒血癥、羔羊痢疾分別是由產(chǎn)氣莢膜梭菌C、D、B型菌引起的。羊猝疽 以潰瘍性腸炎和腹膜炎為特征，病羊掉群，臥底，表現(xiàn)不安，衰弱、痙攣、眼球突出、腹腔、胸 腔、心包大量積水，在數(shù)小時死亡；羊腸毒血癥病羊在倒斃前，四肢出現(xiàn)強(qiáng)烈的劃動，肌肉震 顫，眼球轉(zhuǎn)動，磨牙，口水較多隨后顯著抽搐，往往死于2-4小時死亡，上下頜咯咯作響，繼 而昏迷，靜靜死去；羔羊痢疾主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈腹瀉，精神差糞便惡臭，頭向后仰，體溫降低， 小腸發(fā)生潰瘍和血液，心包積液，肺充血、淤血；
[0008] 產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性與其分泌的外毒素有關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)12種外毒素，其中起 主要致病作用的為a、0、e、i4種，根據(jù)這4種毒素將該菌分為A、B、C、D、E五中血清型。 產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D、E型均能產(chǎn)生a毒素，a毒素是人和動物氣性壞疽以及牛、馬、雞 壞死性腸炎的主要致病因子。0毒素主要由B、C型菌產(chǎn)生，可引起反芻動物（以羊?yàn)橹鳎?患腸毒血癥，主要癥狀是嘔吐，血性腹瀉，甚至可引起腸梗阻和小腸壞死。e毒素主要由B、 D型菌產(chǎn)生，它主要引起羊腸毒血癥。只有E型菌能產(chǎn)生t毒素，是一種皮膚壞死性和致命 性毒素，是公認(rèn)的引起羔羊、犢牛和家兔患腸毒血癥的主要毒素。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR 現(xiàn)場快速檢測試劑盒，本發(fā)明的試劑盒由一套設(shè)計的引物、10XLAMP反應(yīng)液（10倍環(huán)介導(dǎo) 等溫擴(kuò)增反應(yīng)液）、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑組成。采用本發(fā)明可以定性 檢測豬、牛、羊、雞、人等多種動物的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染。本發(fā)明利用BstDNA酶的鏈置換特 性，設(shè)計4條引物，識別靶序列的6個區(qū)域，在等溫條件下生成大量重復(fù)的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在定 性檢測時不需任何特殊設(shè)備，只需眼觀反應(yīng)管道顏色變化即可判定，因此具有特異性、敏感 性高和檢測時間比普通PCR短、適用于養(yǎng)殖場現(xiàn)場的快速檢測等特點(diǎn)。本發(fā)明的目的具體 體現(xiàn)在以下幾個方面：
[0010] 1.常規(guī)PCR檢測技術(shù)相比本技術(shù)速度慢，從采樣到出結(jié)果最少需要48h，本技術(shù)僅 需30-90分鐘；
[0011] 2.常規(guī)PCR需要需要PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)等大型、昂貴的儀器設(shè)備本 技術(shù)僅需要一個恒溫箱或保溫杯即可；
[0012] 3.常規(guī)PCR的結(jié)果必須在凝膠成像儀下觀察，本技術(shù)的試劑盒反應(yīng)完畢后肉眼即 可判定結(jié)果；
[0013] 4.本試劑盒檢測的敏感性、特異性比常規(guī)PCR更高。
[0014] 其具體技術(shù)方案為：
[0015] 一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，
[0016] 由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯 色劑組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內(nèi)引物組成，其序列為：

【權(quán)利要求】
1. 一種產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于， 由一套引物、10倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液、DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照和顯色劑 組成；所述的一套引物是由一對引物和一對內(nèi)引物組成，其序列為： 引物 1 :AGAGAACATGCATGAGCT 引物 2 :CTCTCCAAGATAGAATGTAGCT 內(nèi)引物 1 :TCTGTATCAGGATCCCAGAAATGATACTTATCCAGATTATGATAAGAACG 內(nèi)引物 2 :ATACCTGACACAGGGGAATCACITTGCCAITCATATCTAGCT 其中，所述的一對引物與一對內(nèi)引物的摩爾數(shù)之比為1 : 6?9;所述的DNA聚合酶為 具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活力為8個活性單位/微升；所述的陽性對照為含有插 入產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因一段特異序列的陽性質(zhì)粒，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)位于 該特異序列中，其濃度為1〇7拷貝/ U L ;所述的陰性對照為滅菌雙蒸水；所述的顯色劑為20 倍 SYBR Green I。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于， 所述的10倍環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)液是由200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、100mm〇l/L 氯化鉀、100mm〇l/L硫酸銨、40?100mmol/L硫酸緩、4?10mol/L甜菜喊、5?18mmol/L的 dNTPs、和質(zhì)量百分濃度0? 1%的Triton X-100組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所 述的dNTPs為含有四種dNTP的等量混合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所 述的陽性質(zhì)粒的制作方法為：采用PCR擴(kuò)增一段產(chǎn)氣莢膜梭菌a毒素基因特異序列，然后 裝入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5 a感受態(tài)細(xì)菌，抽取質(zhì)粒DNA經(jīng)序列確定后，采用紫外分光 光度計測定質(zhì)粒DNA的濃度并用滅菌雙蒸水調(diào)整拷貝數(shù)至107拷貝/ y L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)氣莢膜梭菌等溫PCR現(xiàn)場快速檢測試劑盒，其特征在于，所 述的SYBR Green I為高靈敏度的DNA熒光染料。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328177SQ201410586237
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】敬曉棋, 黃光東, 張瓊, 陳生葉, 李復(fù)煌, 高世宏, 高天宏, 陳立強(qiáng) 申請人:陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司