一種高特異性14個位點多個耳聾易感基因的多重pcr-ldr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同時檢測14個耳聾易感基因的PCR-LDR檢測試劑盒，包括包裝盒體(1)，PCR擴增和LDR反應試劑(2)-(5)；包括8對PCR引物、16組探針其中包括2組通用探針和14組檢測探針。該方法靈敏度高，判讀清晰準確；相對傳統(tǒng)測序技術，本試劑盒能完成一次性獲得14個關鍵耳聾基因突變診斷結果的高通量篩查，具有經(jīng)濟、高效和高準確率等優(yōu)勢。
【專利說明】-種高特異性14個位點多個耳聾易感基因的多重PCR-LDR 檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA分子檢測【技術領域】，具體是一種14個耳聾易感基因的多重 PCR-LDR檢測試劑盒。

【背景技術】
[0002] 耳聾是一種嚴重影響人類生活質(zhì)量的常見先天性疾病，它可以由單一基因突變或 不同基因的復合突變引起，也可由環(huán)境因素（如醫(yī)療因素，環(huán)境暴露，創(chuàng)傷，藥物等）或基因 和環(huán)境兩者共同作用而致。我國現(xiàn)有聽力殘疾人群2780萬，居各類殘疾之首（33%)。有 研究發(fā)現(xiàn)GJB2、SLC26A4、線粒體基因是導致中國大部分非綜合征性耳聾的3個最常見的致 病基因。
[0003] GJB2基因是第一個被克隆和鑒定的遺傳性耳聾致病基因，也是導致非綜合性耳聾 最常見的致病基因。在非綜合征性耳聾中，約有20%是GJB2基因突變導致的。GJB2基因 編碼的Cx26蛋白在耳蝸內(nèi)呈高水平表達，與相鄰細胞的縫隙連接蛋白組成一個完整的縫 隙連接通道。這些通道在信息傳遞和物質(zhì)交換中起重要作用，是電解質(zhì)、第二信使和代謝 產(chǎn)物在細胞間轉(zhuǎn)換的重要通道。GJB2基因突變后，使鉀離子回流進入內(nèi)淋巴的循環(huán)受到影 響，導致感音神經(jīng)性耳聾。GJB2基因最常見的突變類型是235delC，其次是299-230delA > T和176-191dell6,其等位基因頻率分別為11. 90%、2. 22%和0. 65%。病理性235delC突 變導致移碼突變，產(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)，使縫隙連接缺損，從而影響離子通道的正常開閉。 299-300delAT突變導致Cx26多肽的CL區(qū)大部分缺失，TM3、EC2和TM4區(qū)完全缺失，可能喪 失對縫隙連接通道PH值的調(diào)控，降低縫隙連接對異型蛋白的辨別能力。176-191dell6指 176位后16個堿基丟失，從59號密碼子開始移碼，使得終止密碼提前至75號，產(chǎn)生無功能 的蛋白質(zhì)。
[0004] 間隙連接蛋白家族中GJB3是編碼間隙連接蛋白31 (Cx31)，其功能主要以連接子 復合體的形式融入膜間隙連接通道，參與細胞通訊。已有的耳聾群體分子流行病學資料表 明，GJB3基因 c. 538C > T點突變導致其編碼的Cx31蛋白的結構與功能發(fā)生變化，可以通 過影響細胞間隙連接的形成，從而導致遺傳性耳聾的發(fā)生。
[0005] SLC26A4 基因?qū)儆陔x子轉(zhuǎn)運體 26A 家族（solute carder family26A。SLC26A)，編 碼離子轉(zhuǎn)運相關蛋白。在機體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。SLC26A4基因突變可 導致常染色體隱性耳聾DFNB4和Pendred綜合征（前庭水管擴大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾 和甲狀腺腫）。SLC26A4基因最常見突變類型是IVS7-2A > G，此外還包括2168A > G，1226G > A，1174A > T，1975G > C，2027T > A 等熱點突變。
[0006] WSFl基因定位于人類染色體的4pl6上，其編碼產(chǎn)物是一種對糖苷內(nèi)切酶敏感的 膜糖蛋白，其功能與擔任細胞內(nèi)、外離子轉(zhuǎn)運功能的微管網(wǎng)狀組織密切相關，直接影響內(nèi)耳 的生理功能。研究證明，WSFl基因的突變被證實是導致低頻感音神經(jīng)性聽力損失的主要原 因之一。主要表現(xiàn)為兩處突變：2158A > G、2596G > A，WFS1基因的突變雜合子可以引起常 染色體顯性遺傳病低頻感音神經(jīng)性聽力損失的突變雜合子可以引起常染色體顯性遺傳病 低頻感音神經(jīng)性聽力損失。
[0007] 線粒體DNA突變是引起聽力損傷的重要原因之一。其中，線粒體12SrRNA基因突 變與綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾相關，位于12SrRNA解碼區(qū)的1555A > G和1494C > T突變是造成氨基糖甙類抗生素耳毒性和非綜合征型耳聾常見的分子機制。這些突變可能 造成12SrRNA二級結構的改變，破壞了線粒體蛋白的合成，降低細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生，是細胞 內(nèi)外離子濃度失衡，耳蝸毛細胞凋亡，由此引起的線粒體功能障礙導致耳聾。
[0008] 目前常用的基因突變檢測技術主要包括：直接測序技術、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、DNA芯片技術（Micro array)、變性高效液相色譜（DHPLC)、單鏈構象多態(tài)性（SSCP) 和變性梯度凝膠電泳（DGGE)等。這些方法分別存在著成本高、準確率低、操作繁瑣和重復 性差等問題。
[0009] 本試劑盒采用一種通用熒光探針的多重PCR-LDR基因多態(tài)性檢測方法。本發(fā)明旨 在設計2套不同堿基序列的通用熒光探針組合即2條通用模板及對應2種不同熒光修飾通 用探針，進行多重PCR-LDR反應和毛細管電泳技術，同時可檢出耳聾14個基因位點并對其 進行基因分型。本發(fā)明方法包括以下步驟：引物及探針設計，多重PCR體系反應、多重LDR 連接反應、測序儀結果檢測。本試劑盒由于測序結果的直接性，解決了結果的假陽性和假陰 性；3730x1測序平臺的樣本高通量性，可同時進行94例樣本的檢測；利用3730x1測序儀的 5色熒光檢測系統(tǒng)，一個泳道檢出14個耳聾基因位點，加快了檢測速度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測14個耳聾易感基因 GJB2:235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G、2596G > A共計14個耳聾易感基因位點的PCR-LDR檢測試劑盒。
[0011] 為了實現(xiàn)上述目的，該試劑盒包括PCR擴增試劑和LDR連接反應試劑、基因分型試 劑及質(zhì)控品。
[0012] 所述PCR擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，2 組引物混合物（Primerl包含GJB2、GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因共4對引物；Primer2 包含2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226及WSFl基因位點共5對引物）以及超純水；
[0013] 所述LDR連接反應試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測探針混合物，DNA連接 酶，IOX緩沖液及超純水。
[0014] 所述基因分型試劑包括：R0X-300內(nèi)標，用于基因分型的14個耳聾基因突變位點 對應的基因分型標準物。
[0015] 所述質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型質(zhì)控品為經(jīng)測序鑒定 14個位點均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、299-230delA > T、 176-191dell6，SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A共計14個耳聾易感基因位點的突變質(zhì)粒。
[0016] 使用所述的試劑盒進行復合PCR擴增反應的條件：PCR擴增體系的PH值為 8. 3-8. 9,鎂離子濃度為I. 5-3mM，4種dNTP的終濃度為200-300uM，Taq酶的用量為 0. 5-1U，2組引物混合物中單對引物終濃度為0. 5-5uM，LDR探針混合物中，通用探針終濃度 0. 1-0. 5uM，14組檢測探針終濃度為l-5uM。
[0017] 使用所述試劑盒進行LDR-PCR反應時，擴增階段反應及LDR連接反應分別在一個 復合體系中進行，同時擴增連接 GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191dell6，SLC26A4 : IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA : 1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A 共計 14 個耳聾易感基因位點。
[0018] 本發(fā)明14個耳聾易感基因位點PCR-LDR檢測試劑盒，其特征在于PCR復合擴增使 用2組多重引物混合物，LDR復合體系使用16組探針，其中包括2組通用探針，14組檢測探 針。
[0019] 用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191dell63個基因位點檢測的上下游 引物目的片段長度為1136bp，其序列分別為 ：
[0020] SEQ NO. I ：G2F, GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT
[0021] SEQ NO. 2 ：G2R, GAATCTATGTGTTGGGATATGGT
[0022] 用于IVS7-2A > G位點檢測的上下游引物目的片段長度為450bp，其序列分別為 為：
[0023] SEQ NO. 3 ：IVS7-2F, CACTGCTGGATTGCTCTC
[0024] SEQ NO. 4 ：IVS7-2R, CAAATGGCTTGACGTTTGT
[0025] 用于2168A > G位點檢測的上下游引物目的片段長度為700bp，其序列分別為為：
[0026] SEQ NO. 5 ：2168F, ATCACTTGAACTTGGGACAC
[0027] SEQ NO. 6 ：2168R, CTGGGCTTCTTTGTGGCCT
[0028] 用于1226G > A、1174A > T位點檢測的上下游引物目的片段長度為885bp，其序列 分別為為：
[0029] SEQ NO. 7 :1226-1174F，GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA
[0030] SEQ NO. 8 :1226-1174R，GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG
[0031] 用于1975G > C、2027T > A位點檢測的上下游引物目的片段長度為287bp，其序列 分別為為：
[0032] SEQ NO. 9 ：1975-2027F, TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA
[0033] SEQ NO. 10 ：1975-2027R, ATTGCCAAAGCTCCAAACGT
[0034] 用于線粒體12SrDNA基因1555A > G、1494C > T位點檢測的上下游引物目的片段 長度為923bp，其序列分別為為：
[0035] SEQ NO. 11 ： 1555-1492F, GATACCCCACTATGCTAGCCCTAA
[0036] SEQ NO. 12 :1555-1492R，GGTAGGTTTGTCGCCTCTACCTATAA
[0037] 用于GJB3基因538C > T位點檢測的上下游引物目的片段長度為600bp，其序列分 別為為：
[0038] SEQ NO. 13 ：GJB3F, CGTGTGGGGGGATGAGCAG
[0039] SEQ NO. 14 ：GJB3R, GCAGCGGCAGGTGGAAGC
[0040] 用于WSFl基因2158A > G、25966 > A位點檢測的上下游引物目的片段長度為 671bp，其序列分別為為：
[0041] SEQ NO. 15 ：WSF1F, CTGACCTGGCAGCAGTATCG
[0042] SEQ NO. 16 ：WSF1R, AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC
[0043] 本試劑盒使用16組LDR探針，其中包括2組通用探針，14組檢測探針
[0044] LDR 通用模板 I :CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG
[0045] 通用熒光探針 I :P-GCATCACTCAGAGGG-FAM
[0046] LDR 通用模板 2 :GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT
[0047] 通用熒光探針 2 :P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX
[0048] 176_191dell6檢測探針序列為：
[0049] GJB2_176_M :P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC
[0050] GJB2_176_de I ： TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA
[0051] GJB2_176_N0de I ： TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC
[0052] 235delC位點檢測探針序列為
[0053] GJB2_235_M :P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0054] GJB2_235_delC ：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA
[0055] GJB2_235_C ：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG
[0056] 299_230delAT位點檢測探針序列為
[0057] GJB2_299_M :P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0058] GJB2_299_de IAT ： TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC
[0059] GJB2_299_AT ： TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT
[0060] 用于SLC26A4基因1975G > C的檢測探針序列為：
[0061] 1975_M :P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0062] 1975_C ：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG
[0063] 1975_G ：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC
[0064] 用于SLC26A4基因2027T > A的檢測探針序列為
[0065] 2027_M :P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0066] 2027_T ：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA
[0067] 2027_Α ：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT
[0068] 用于SLC26A4基因1174Α > T的檢測探針序列為：
[0069] 1174_M :P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0070] 1174_A ：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT
[0071] 1174_T ：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA
[0072] 用于SLC26A4基因1226G > A的檢測探針序列為：
[0073] 1226_M :P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0074] 1226_G ：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC
[0075] 1226_A ：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT
[0076] 用于SLC26A4基因 IVS7-2A > G的檢測探針序列為：
[0077] IVS7-2_M :P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0078] IVS7-2_A ：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT
[0079] IVS7-2_G ：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC
[0080] 用于SLC26A4基因2168A > G的檢測探針序列為：
[0081] 2168_M ：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0082] 2168_A ：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT
[0083] 2168_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC
[0084] 用于12srRNA基因的1494C > T的的檢測探針序列為：
[0085] 1494_M :P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC
[0086] 1494_C ：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG
[0087] 1494_T ：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA
[0088] 用于12srRNA基因的1555G > A的的檢測探針序列為：
[0089] 1555_M ：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC
[0090] 1555_G ：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG
[0091] 1555_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT
[0092] 用于GJB3基因的538C > T的檢測位點的探針序列如下：
[0093] 538_M :P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0094] 538_C ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG
[0095] 538_T ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA
[0096] 用于WSFl基因的2158Α > G，2596G > Α，2個檢測位點的探針序列分別為：
[0097] 2158_M :P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC
[0098] 2158_Α ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT
[0099] 2158_G ： TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC
[0100] 2596_M ：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC
[0101] 2596_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC
[0102] 2596_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT
[0103] 所述16組探針，其中2條通用探針5'端需進行磷酸化修飾，3'端進行熒光染料標 記，所用的熒光染料為不同的熒光素。
[0104] 使用所述試劑盒時，所檢測的材料為人類基因組DNA，選用磁珠或Chelex-100法 提取基因組DNA提取對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本為：來源于人類的血 液、組織、羊水、濾紙片血斑、口腔拭子樣本、FTA卡血斑等。
[0105] 使用所述試劑盒進行PCR-LDR反應時，可在任何型號的PCR儀進行，PCR條件 為 ：95°3111丨11;95°308,60°308,72°608,30個循環(huán)；72°10111丨11 ;〇)1?連接反應條件： 95。2min;95。30S，60° 2min，30 個循環(huán)。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的實施方案，使用本試劑盒判定檢測結果的標準是：每次都同時檢測 陰性質(zhì)控品、野生型質(zhì)控品和突變型質(zhì)控品，檢測結果陰性質(zhì)控品為陰性，野生型質(zhì)控品為 野生型，突變型質(zhì)控品為陽性時，實驗才有效。
[0107] 有益效果：
[0108] 本試劑盒首次采用復合PCR-LDR連接酶檢測反應，同時對GJB2 :235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G、1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G、2596G > A進行PCR-LDR擴增，而后經(jīng)毛細管電泳后分析片段大小， 即可實現(xiàn)對14個耳聾位點的同時檢測。高溫連接酶（LDR)技術是利用高溫連接酶實現(xiàn)對 基因多態(tài)性位點的識別。高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處 存在著基因點突變類型的堿基錯配，則連接反應就不能進行，所以該方法特異性極強，我們 給予測序分型技術的LDR試劑盒是針對臨床應用設計，填補了國內(nèi)外基因分型及DNA多態(tài) 性檢測在遺傳性耳聾分子診測應用上的空白。相對傳統(tǒng)的測序技術，本試劑盒具有以下顯 著優(yōu)勢：
[0109] 降低成本：測序反應的所有相關試劑BigDye完全由ABI這樣的型國外企業(yè)掌握， 試劑成本昂貴，但必需使用無法替代，而PCR-LDR技術所使用得探針引物及試劑都可以在 國內(nèi)公司合成訂購，可大幅度降低成本。
[0110] 通量高=DNA序列的測定只是針對某一區(qū)段進行，而選中的區(qū)段可能只是一個位 點，而基于LDR技術的檢測系統(tǒng)可以進行多為點的SNP分型，本試劑盒采用復合PCR-LDR體 系，一次可以同時檢測14個耳聾基因位點信息，同時檢測上百例樣品，不僅提高了檢測效 率，也很大程度上節(jié)約成本費用。
[0111] 靈敏度高：傳統(tǒng)的測序法（Sanger法）檢測靈敏度低，無法檢測低滴度樣本（突變 比率小于15% );基于PCR-LDR的14位點耳聾易感基因檢測方案能夠突破傳統(tǒng)核酸突變檢 測技術的局限，對多個突變位點進行檢測，檢測靈敏度達到1 %
[0112] 操作簡單流程短：從DNA制備開始，僅需要5個小時，而傳統(tǒng)測序需要10個小時， 大大節(jié)約了人力物力和時間、防止多步驟操作而產(chǎn)生污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0113] 圖1是本發(fā)明的試劑盒針對GJB2基因：235delC突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0114] 圖2是本發(fā)明的試劑盒針對GJB2基因299-230delA > T突變個體血斑來源DNA 檢測分型后結果；
[0115] 圖3是本發(fā)明的試劑盒針對GJB2基因：176-191dell6突變個體血斑來源DNA檢 測分型后結果；
[0116] 圖4是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :IVS7-2A > G突變個體血斑來源DNA測序分 型后結果；
[0117] 圖5是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :2168A > G突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0118] 圖6是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :1226G>A突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0119] 圖7是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :1174A > T突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0120] 圖8是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :1975G>C突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0121] 圖9是本發(fā)明的試劑盒針對SLC26A4 :2027T > A突變個體血斑來源DNA檢測分型 后結果；
[0122] 圖10是本發(fā)明的試劑盒針對線粒體12SrDNA :1494C > T突變個體血斑來源DNA 檢測分型后結果；
[0123] 圖11是本發(fā)明的試劑盒針對線粒體12SrDNA :1555A > G突變個體血斑來源DNA 檢測分型后結果。
[0124] 圖12是本發(fā)明的試劑盒針對GJB3基因：538C > T位點突變個體血斑來源DNA檢 測分型后結果。
[0125] 圖13是本發(fā)明的試劑盒針對WSFl基因的2158A > G位點突變個體血斑來源DNA 檢測分型后結果。
[0126] 圖14是本發(fā)明的試劑盒針對WSFl基因的2596G > A位點突變個體血斑來源DNA 檢測分型后結果。
[0127] 圖15是本發(fā)明的試劑盒突變率靈敏度檢測試驗以1494位點為例說明的DNA檢測 結果
[0128] 圖16為野生型檢測結果
[0129] 圖17是本發(fā)明確定的最優(yōu)引物單重擴增及多重PCR產(chǎn)物凝膠圖像，17-1從左至右 Marker，GJB2、線粒體 12SrDNA、2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226、WSF1、及 GJB3 基因的 引物對應的擴增產(chǎn)物，Marker。17-2為多重PCR產(chǎn)物凝膠圖像，多重PCR體系-1包含GJB2、 GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因的PCR產(chǎn)物；多重PCR體系-2包含2168、1975-2027、 IVS7-2、1174-1226及WSFl基因位點的PCR產(chǎn)物。

【具體實施方式】
[0130] 實施例1 :14個耳聾易感基因位點的PCR-LDR檢測試劑盒及其使用
[0131] 1.試劑盒組成：PCR擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix， EX-Taq酶，2組引物混合物（Primerl包含GJB2、GJB3、線粒體12SrDNA及WSFl基因共4對 引物；Primer2 包含 2168、1975-2027、IVS7-2、1174-1226 及 WSFl 基因位點共 5 對引物） 以及超純水；LDR連接反應試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測探針混合物，DNA連 接酶，IOX緩沖液及超純水；基因分型試劑包括：R0X-300內(nèi)標，用于基因分型的14個耳聾 基因突變位點對應的基因分型標準物；質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型 質(zhì)控品為經(jīng)測序鑒定14個位點均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、 299-230delA > T、176-191dell6, SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > I'和 WSFl基因的2158A > G，2596G > A共計14個耳聾易感基因位點的突變質(zhì)粒。
[0132] 2.基因組DNA準備：待檢樣品選用磁珠或Chelex-IOO法提取基因組DNA，提取的 樣品基因組DNA定量在約lng/ul-10ng/ul。
[0133] 3.多重PCR反應：PCR緩沖液、MgC12, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8對引物 混合物以及超純水，按如下過程實驗：
[0134] 體系：25ul
[0135]

【權利要求】
1. 一種同時檢測14個耳聾易感基因的PCR-LDR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒包括包裝盒體（I)，PCR擴增試劑（2)，LDR連接反應試劑（3)，基因分型試劑（4)，質(zhì)控品 (5)； 所述PCR擴增試劑包括：PCR緩沖液、MgCl2, dNTPs的混合物Remix，EX-Taq酶，8對引 物混合物以及超純水； 所述LDR連接反應試劑包括：2組通用熒光探針及14組檢測探針混合物，DNA連接酶， IOX緩沖液及超純水； 所述基因分型試劑包括：ROX-300內(nèi)標，用于基因分型的14個耳聾基因突變位點對應 的基因分型標準物； 所述質(zhì)控品包括：陰性質(zhì)控品為滅菌的雙蒸水，野生型質(zhì)控品為經(jīng)測序鑒定14個位 點均為野生型的基因組DNA，陽性質(zhì)控品為GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191 del 16，SLC26A4 :IVS7-2A > G、2168A > G、1226 G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒 體 12SrDNA :1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A共計14個耳聾易感基因位點的突變質(zhì)粒； 使用所述的試劑盒進行復合PCR擴增反應的條件：PCR擴增體系的PH值為8. 3-8. 9,鎂 離子濃度為I. 5-3mM，4種dNTP的終濃度為200-300uM，Taq酶的用量為0. 5-1U，8對引物混 合物中單對引物終濃度為0. 5-5uM，LDR探針混合物中，通用探針終濃度0. 1-0. 5uM，14組檢 測探針終濃度為l_5uM ; 使用所述試劑盒進行LDR-PCR反應時，擴增階段反應及LDR連接反應分別在一個復 合體系中進行，同時擴增連接 GJB2 :235delC、299-230delA > T、176-191 dell6, SLC26A4 : IVS7-2A > G、2168A > G、1226G > A、1174A > T、1975G > C、2027T > A，線粒體 12SrDNA : 1555A > G\1494C > T，GJB3 基因：538C > T 和 WSFl 基因的 2158A > G，2596G > A 共計 14 個耳聾易感基因位點； 所述試劑盒中包括PCR復合擴增使用8對引物，LDR復合體系使用16組探針，其中包 括2組通用探針，14組檢測探針； 用于GJB2基因235delC、299_300delAT、176_191dell6 3個基因位點檢測的上下游引 物目的片段長度為1136bp，其序列分別為： SEQ NO. I ：G2F. GCCTTTCAGCTAACGAGAAGTTT SEQ NO. 2 ：G2R. GAATCTATGTGTTGGGATATGGT 用于IVS7-2A > G位點檢測的上下游引物目的片段長度為450bp，其序列分別為： SEQ NO. 3 ：IVS7-2F, CACTGCTGGATTGCTCTC SEQ NO. 4 ：IVS7-2R. CAAATGGCTTGACGTTTGT 用于2168A > G位點檢測的上下游引物目的片段長度為700bp，其序列分別為： SEQ NO. 5 ：2168F, ATCACTTGAACTTGGGACAC SEQ NO. 6 ：2168R. CTGGGCTTCTTTGTGGCCT 用于1226G > A、1174A > T位點檢測的上下游引物目的片段長度為885bp，其序列分別 為： SEQ NO. 7 ：1226-1174F, GTAGTTAAATGGTTAGTAATCAAGCACGA SEQ NO. 8 ：1226-1174R, GAAAATAGAATAGCTCCTAAAGCCCAG 用于1975G > C、2027T > A位點檢測的上下游引物目的片段長度為287bp，其序列分別 為： SEQ NO. 9 ：1975-2027F, TCTTCGTTTAGAATGGCAGCA SEQ NO. 10 ：1975-2027R,ATTGCCAAAGCTCCAAACGT 用于線粒體12SrDNA基因1555A > G、1494C > T位點檢測的上下游引物目的片段長度 為923bp，其序列分別為： SEQ NO. 11 ：M-F, gataccccactatgcttagccctaa SEQ NO. 12 ：M-R.ggtaggtttgtcgcctctacctataa 用于GJB3基因538C > T位點檢測的上下游引物目的片段長度為600bp，其序列分別 為： SEQ NO. 13 ：GJB3F, CGTGTGGGGGGATGAGCAG SEQ NO. 14 ：GJB3R, GCAGCGGCAGGTGGAAGC 用于WSFl基因2158A > G、2596G > A位點檢測的上下游引物目的片段長度為671bp， 其序列分別為： SEQ NO. 15 ：WSF1F, CTGACCTGGCAGCAGTATCG SEQ NO. 16 ：WSF1R, AGGAATGGGAAGAAAAAGAACGC 所述試劑盒使用16組LDR探針，其中包括2組通用探針，14組檢測探針 LDR 通用模板 I :CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGITTGCG 通用熒光探針 I :P-GCATCACTCAGAGGG-FAM LDR 通用模板 2 :GGCCAGTTAAGCTAAGTTACTGCCGGACAT 通用熒光探針 2 :P-TTAGCTTAACTGGCC-HEX 176-191 dell6檢測探針序列為： GJB2_176_M ：P-TGGCTGCAGGGTGTTGCATTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_176_deI ：TTTGCTAACTTCCCCTCTGACCCA GJB2_176_N0deI ： TTTATCGTAGCACACGTTCTTGCAGCC 235delC位點檢測探針序列為 GJB2_235_M :P-GGCCCATAGCCGGATGTGGTTTTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_235_delC ：TTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCA GJB2_235_C ：TTTTTTTGCGTGGACACGAAGATCAGCTGCAG 299-230delAT位點檢測探針序列為 GJB2_299_M :P-GTCTCCGGTAGGCCACGTGTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC GJB2_299_deIAT : TTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC GJB2_299_AT ：TTTTTTTTTTTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTCAT 用于SLC26A4基因1975G > C的檢測探針序列為： 1975_M ：P-AAGGCTATGGATTGGCACTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1975_C ：TAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAG 1975_G ：TTTAAAGATATAGCTCCACAGTCAAGCAC 用于SLC26A4基因2027T > A的檢測探針序列為 2027_M ：P-GTGATCTCACTCCAACAACTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2027_T ：TTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCA 2027_A ：TTTTTTTTTAAAACCAGAACCTTACCACCCGCT 用于SLC26A4基因1174A > T的檢測探針序列為： 1174_M ：P-GCTGATCCCAAAGGCAATGAATTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1174_A ：TTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTT I174_T ：TTTTTTTTTTCAAGAGAAGAATCCTGAGAAGATGTA 用于SLC26A4基因1226G > A的檢測探針序列為： 1226_M ：P-GGGAAAGAGCAGTGGTGGCCACTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 1226_G ：TTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGC 1226_A ：TTTTTTTTTTTTCCAGTGCTCTCCTGGACGGCCGTGT 用于SLC26A4基因IVS7-2A > G的檢測探針序列為： IVS7-2_M ：P-GAAATAAAACAAAAGATGTTAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC IVS7-2_A ：TTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCT IVS7-2_G ：TTTTTTTTTTTTTTGAAATGGCAGTAGCAATTATCGTCC 用于SLC26A4基因2168A > G的檢測探針序列為： 2168_M ：P-GGACCGTCAAAAAGAATGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2168 A ：TTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAT 2168_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTCTGTAGATAGAGTATAGCATCAC 用于12srRNA基因的1494C > T的的檢測探針序列為： 1494_M ：P-GTGACGGGCGGTGTGTACGCGCTTTTTTTTTTTTCGCACCTCTGTACTC 1494_C ：TTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGG 1494_T ：TTTTTTTTTTTTTCCTTTGAAGTATACTTGAGGAGA 用于12srRNA基因的1555G > A的的檢測探針序列為： 1555_M ：P-CTCCTCTATATAAATGCGTATTTTTTTTTTTTTTTCGAATTCATCACTC 1555_G ：TTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGG 1555_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTAGTACACTTACCATGTTACGACTTGT 用于GJB3基因的538C > T的檢測位點的探針序列如下： 538_M ：P-TTGTCGTACAGCTTGGCGCACTGGTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC 538_C ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCG 538_T ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTCCGTGCTTCTTGCCTGCA 用于WSFl基因的2158A > G，2596G > A，2個檢測位點的探針序列分別為： 2158_M ：P-GGCAGACTCGGCGCTGTTGTCGATTTTTTTTTTTTTTTCGCAAACCTGTACTC 2158_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAT 2158_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGAAGAACGGGAGCATGTTGAC 2596_M ：P-GTGCTCGATCTTCACGTGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTATGTCCGGCAGTAAC 2596_G ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTC 2596_A ：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCGCCATGCACGGTGCTGCGCCAGTT 所述16組探針，其中2條通用探針5'端需進行磷酸化修飾，3'端進行熒光染料標記， 所用的熒光染料為不同的熒光素。
2. 權利要求1所述所述試劑盒，其特征在于，所檢測的材料為人類基因組DNA，選用磁 珠或Chelex-100法提取基因組DNA提取對來源樣本進行處理得到的DNA ;所述的來源樣本 為：來源于人類的血液、組織、羊水、濾紙片血斑、口腔拭子樣本、FTA卡血斑等。
3. 權利要求1所述試劑盒，其特征在于，使用所述試劑盒進行PCR-LDR反應時，可在 任何型號的PCR儀進行，PCR條件為：95° 3min;95° 30s，60° 30s，72° 60s，30個循環(huán)； 72° 10min;LDR 連接反應條件：95° 2min;95° 30S，60。2min，30 個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313159SQ201410586158
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權日:2014年10月28日
【發(fā)明者】步迅, 張全芳, 劉艷艷 申請人:步迅