專利名稱：生物發(fā)光微生物數(shù)量抗干擾快速檢測試劑盒的制作方法
專利說明生物發(fā)光微生物數(shù)量抗干擾快速檢測試劑盒 本發(fā)明涉及一種利用ATP生物發(fā)光法進行微生物數(shù)量快速檢測的方法及檢測試劑盒，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。生物發(fā)光法檢測微生物細胞數(shù)量具有快速簡單的優(yōu)點，整個過程僅為十幾分鐘，而常規(guī)的細菌、酵母和霉菌總數(shù)測定采用平板培養(yǎng)計數(shù)法，從開始培養(yǎng)到肉眼可見的菌落需要幾天，因此在微生物數(shù)量快速檢測方面具有很強的優(yōu)勢。通過ATP生物發(fā)光法進行的微生物數(shù)量測定技術(shù)由于不需要培養(yǎng)過程，具有較高的靈敏度，可用于工廠在生產(chǎn)過程進行微生物總數(shù)的在線檢測，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供快速檢測手段。目前國外少數(shù)發(fā)達國家已有靈敏的生物發(fā)光儀和很高純度的檢測試劑盒，然而不論高靈敏度的發(fā)光檢測儀還是高純度的發(fā)光檢測試劑，其價格都非常之高，簡單的儀器一般為5～10萬元/臺，稍好的其價格達到10～40萬元/臺，與儀器配套的試劑盒價格為30～50元/次，這對于我國的情況來說，檢測成本太高，因此在國內(nèi)完全未得到應(yīng)用。要實現(xiàn)ATP生物發(fā)光法在我國的大規(guī)模應(yīng)用，必須解決儀器和發(fā)光試劑兩大核心問題，本研究近年來一直致力于生物發(fā)光檢測技術(shù)和生物發(fā)光檢測儀器的研究與開發(fā)，目前生物發(fā)光檢測儀已研制出樣機，因此構(gòu)建生物發(fā)光檢測試劑盒和建立程序化的檢測技術(shù)對于推廣應(yīng)用顯得特別重要。本發(fā)明的目的在于構(gòu)建高靈敏度的ATP生物發(fā)光檢測試劑盒，建立標準化的細菌、酵母、霉菌及飲用水中微生物及藻類細胞數(shù)量的檢測技術(shù)，實現(xiàn)微生物總數(shù)的快速檢測，為衛(wèi)生監(jiān)督和食品生產(chǎn)質(zhì)量控制提供關(guān)鍵技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種利用生物發(fā)光法快速檢測微生物數(shù)量的快速檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括熒光素酶及其保護劑、D-熒光素、標準ATP、發(fā)光檢測緩沖液、非細胞ATP去除劑、微生物細胞ATP抽提劑等試劑。(1)熒光素酶須經(jīng)純化，活力本底比達到50～500，活力要求在0.5mL發(fā)光檢測系統(tǒng)中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的發(fā)光脈沖值CP6S不低于7000，活力檢測在0.5mL發(fā)光檢測系統(tǒng)中加0.1mL熒光素酶、0.1mL 1×10-7mol/L ATP和0.3mL 25mmol/L pH7.8的發(fā)光檢測緩沖液進行，本底以無菌超純水代替標準ATP在0.5mL發(fā)光檢測系統(tǒng)中進行。(2)酶保護劑采用海藻糖、PEG6000和BSA的混合系統(tǒng)，含10～100mg/L海藻糖、5～100mg/L PEG、1～20mg/L BSA。酶液與酶保護劑按10∶1比例混合。(3)發(fā)光檢測緩沖液(簡稱GB)可采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等緩沖鹽中的一種配制成濃度為25mmol/L、pH7.2的緩沖液，優(yōu)選甘氨酰甘氨酸，將其配制為含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2的緩沖液。(4)D-熒光素的發(fā)光活力須達到相當于Sigma L9504的水平。(5)非目的細胞ATP去除劑AE用含有50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgSO4，1mmol/LEDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為0.1～10mg/mL。(6)微生物細胞ATP釋放劑Ec含1～30g/L TritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨(CTAB)、0.1～3.0g/L二甲亞砜(DMSO)、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.01～0.1g/L硫酸鎂(MgSO4)。
本發(fā)明檢測試劑盒可預(yù)先按比例取熒光素酶100mL，加入酶保護劑10mL、含50～150mgD-熒光素的發(fā)光檢測緩沖液(含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2)10mL，得到120mL的ATP生物發(fā)光試劑，用棕色瓶裝。
為提高該生物發(fā)光試劑盒的抗干擾能力，還可以增加抗干擾培養(yǎng)基?？垢蓴_培養(yǎng)基包括抗防腐劑型、抗消毒劑型及抗臭氧型液體大樣檢測培養(yǎng)基，它們可分別消除防腐劑山梨酸及山梨酸鉀、苯甲酸及苯甲酸鈉，消毒劑二氧化氯、過氧乙酸、次氯酸鈉和過氧化氫以及臭氧和余氯的干擾，在檢測含有干擾的樣品時，與普通液體培養(yǎng)基相比，可大大提高檢測的靈敏度，具體用法見表1。
表1 抗干擾微生物液體培養(yǎng)基可以消除的干擾物質(zhì)及其濃度
應(yīng)用該檢測試劑盒進行微生物數(shù)量快速測定的標準方法是通過在選定的生物發(fā)光儀和選定的系統(tǒng)中做ATP標準曲線，取對數(shù)后得到線性回歸方程，將經(jīng)過非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統(tǒng)中用同一批酶進行ATP生物發(fā)光檢測，同時做空白對照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對發(fā)光值取對數(shù)后，通過建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據(jù)細菌、酵母、霉菌和單細胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細菌、酵母、霉菌孢子或單細胞微藻的細胞數(shù)，或只計相當于細菌數(shù)量。如同一樣品中既有細菌、酵母、霉菌或微藻且須分別計量時，則須有一個依細胞大小分級過濾的過程。
應(yīng)用該檢測試劑盒建立微生物數(shù)量快速檢測程序化的具體方法為1.標準ATP曲線的制作在生物發(fā)光儀0.5mL檢測系統(tǒng)中，用ATP生物發(fā)光試劑盒進行10-12～10-6mol/L系列標準ATP濃度發(fā)光檢測，并做出對數(shù)曲線和線性回歸方程。檢測系統(tǒng)為0.1mL熒光素酶(FL)+0.1mL ATP+0.3mL發(fā)光檢測緩沖液，在發(fā)光儀上進行系列標準ATP和用無菌水代替不加ATP的空白的發(fā)光脈沖值(CP6S或CPM值測量)，去除空白值的凈相對發(fā)光值(ΔCP6S或ΔCPM)在雙對數(shù)坐標上做折線圖、趨勢線和回歸方程。
2.樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理包括非目標ATP的去除，微生物細胞的分級過濾，樣品中干擾成份的去除，樣品稀釋或濃縮到適合ATP生物發(fā)光法的檢測范圍等，依樣品的形態(tài)、性質(zhì)和內(nèi)含物及檢測目標進行相應(yīng)處理。非目標ATP的去除聯(lián)合采用微孔濾膜和ATP去除劑的辦法，可以節(jié)省試劑。微生物細胞的分級過濾依樣品所含雜質(zhì)情況，先采用20μm大孔經(jīng)微孔濾膜去除雜質(zhì)，然后在真空條件下通過8μm、3μm、0.45μm和0.22μm的無菌微孔濾膜過濾。樣品中干擾成份的去除可通過離心加無菌超純水洗滌方法或用微孔濾膜過濾的辦法進行。對于含有防腐劑、消毒劑或臭氧的食品、飲料等樣品，需要較高的檢測靈敏度的時候可用與抗干擾培養(yǎng)基進行預(yù)孵育以提高抗干擾能力和檢測靈敏度。樣品稀釋或濃縮可用無菌超純水稀釋，濃縮可通過8000～12000r/min離心方法進行，亦可用微孔濾膜分級過濾的辦法。
3.微生物細胞ATP的抽提將經(jīng)過預(yù)處理的樣品用微生物細胞ATP抽提劑Ec進行ATP的提取，具體過程為Ec與液體樣品按1∶1比例加入后，室溫作用1.5～2.0min；濾膜上微生物細胞ATP提取則加入1～2ml Ec，室溫作用1.5～2.0min即可。其中ATP抽提劑Ec的制備方法為每升無菌超純水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
4.ATP生物發(fā)光測試取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL發(fā)光檢測緩沖液的發(fā)光管中，搖勻，加入ATP生物發(fā)光試劑0.1ml，搖勻后立即置發(fā)光檢測儀中進行發(fā)光檢測，讀取發(fā)光脈沖計數(shù)值CP6S或CPM，同時進行空白樣品的對照測試。其中發(fā)光檢測緩沖液(GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mg/mL BSA，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/L DTT，pH7.2。ATP生物發(fā)光試劑按比例取熒光素酶100mL，加入酶保護劑10mL、含100mg D-熒光素的發(fā)光檢測緩沖液10mL，得到120mL的ATP生物發(fā)光試劑。
5.樣品中相應(yīng)微生物細胞ATP含量的計算ATP生物發(fā)光測試后的樣品發(fā)光值去除空白后的凈相對發(fā)光值取對數(shù)后，通過回歸方程(lg[ATP]＝A+Blg(ΔCP6S)或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，相關(guān)性R大于0.98為好，其中A和B為回歸方程的系數(shù))，計算樣品中相應(yīng)的ATP濃度。
6.樣品中細菌、酵母、霉菌和單細胞藻類數(shù)量或以細菌計的微生物總數(shù)的計算根據(jù)本發(fā)明前期研究結(jié)果，細菌細胞的ATP含量為3×10-16g/cell；酵母菌的ATP含量為3×10-14g/cel；霉菌孢子的平均ATP含量為3×10-15g/cell；單細胞藻的ATP含量為3×10-14g/cell換算成細菌、酵母、霉菌和單細胞藻類的細胞數(shù)，或只計相當于細菌的總數(shù)量。
注式中505為ATP的分子量。

圖1在上海上立生物發(fā)光儀SHG-C和廣東環(huán)凱微生物科技公司研制的發(fā)光儀HKM-NRD(1)機上0.5mL系統(tǒng)中，檢測系統(tǒng)為0.1mL生物發(fā)光試劑(FL)+0.1mL標準ATP+0.3mL發(fā)光檢測緩沖液(GB)。橫坐標為所加標準ATP濃度(在10-12～10-6mol/L范圍)的Lg[ATP]，縱坐標為對應(yīng)的相對發(fā)光值的LgΔCP6S1。實施例1生物發(fā)光法快速檢測試劑盒的構(gòu)建(發(fā)光試劑為FL04113)(1)試劑的預(yù)先配制熒光素酶保護劑取500mg海藻糖、500mg PEG6000及15mg BSA，溶解于10mL無菌蒸餾水中，搖勻后通過0.22μm的無菌微孔濾膜過濾除菌即可。
標準ATP溶液采用Sigma公司的二鈉鹽A-2383 55.1mg，溶解于10mL無菌餾水中，配成濃度為1×10-2mol/L，用1.5ml無菌離心管裝，每管0.1ml。
非細胞ATP去除劑AP其具體成份和制作過程是用含50mmol/L Tris-HCl，10mmol/LMgS04，1mmol/L EDTA，1mg/mL BSA，pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為5mg/ml，并通過0.22μm的無菌微孔濾膜過濾。
微生物細胞ATP提取液Ec每升無菌超純水中加入20g TritonX-100、2.0g CTAB、2.0gDMSO、0.05g EDTA、0.05g MgSO4，加熱使其溶解，振勻即成。
發(fā)光檢測緩沖液(簡稱GB)含25mmol/L甘氨酰甘氨酸，0.5mmol/L EDTA，0.5mmol/LDTT，pH7.2。
(2)生物發(fā)光試劑(FL04113)的配制取純化的熒光素酶100mL，加入酶保護劑10mL、含100mg D-熒光素的發(fā)光檢測緩沖液10mL，得到120mL溶液，分裝到60個小的棕色瓶中，每瓶2mL，凍干。
(3)生物發(fā)光法快速檢測試劑盒的構(gòu)建該檢測試劑盒包括生物發(fā)光試劑(FL04113)4瓶，每瓶2mL；0.1mL濃度為1×10-2mol/L的標準ATP溶液10管；無菌蒸餾水4瓶，每瓶25mL；發(fā)光檢測緩沖液4瓶，每瓶20mL；1瓶20mL微生物細胞ATP提取液Ec；1個棕色瓶裝非細胞ATP去除劑AP 5mL。
該試劑盒用于實施例2～6的檢測。
實施例2FL04113 ATP生物發(fā)光標準ATP曲線在上海上立生物發(fā)光儀SHG-C和廣東凱微生物科技公司研制的發(fā)光儀HKM-NRD(1)機上0.5mL系統(tǒng)中，檢測標準濃度范圍在10-12～10-6mol/L的ATP發(fā)光值，檢測系統(tǒng)為0.1mL FL+0.1mL標準ATP+0.3mL GB，并做出對數(shù)曲線和線性回歸方程，結(jié)果見表1和附圖1。
從表1可見在SHG-C發(fā)光儀上進行發(fā)光檢測，當ATP濃度在10-10～10-6mol/L時線性較好，在0.5mL發(fā)光系統(tǒng)中的回歸曲線為Lg[ATP]＝-12.4792+1.0374LgΔCPM，R＝0.9977，n＝5；在HKM-NRD(I)發(fā)光儀上，當ATP濃度在10-10～10-6mol/L時線性較好，回歸曲線為Lg[ATP]＝-10.8382+0.9547LgΔCP6S1，R＝0.9951，n＝5。兩臺儀器上的檢測靈敏度均為10-10mol/L。
表1 FL041130在SHG-C和HKM-NRD(I)機上檢測的ATP的發(fā)光值
實施例3酵母人工樣品的發(fā)光檢測(SHG-C)(1)在SHG-C上的發(fā)光檢測在0.5mL系統(tǒng)中于SHG-C上進行釀酒酵母樣品檢測，人工酵母樣平板培養(yǎng)結(jié)果為1.44×107cfu/mL(原液簡為Y0)，檢測系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mL標準ATP或H2O樣+0.3mL GB，發(fā)光檢測結(jié)果見表2。
表2 酵母人工樣品在SHG-C上發(fā)光檢測結(jié)果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell計。標準ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明當酵母菌樣的濃度在103cells/m～107cells/mL時，用ATP生物發(fā)光法檢測較能反應(yīng)出真實的水平。
(2)在HKM-NRD(1)機上的發(fā)光檢測在0.5ml系統(tǒng)中于廣東環(huán)凱HKM-NRD(1)機上上進行釀酒酵母人工樣品檢測，人工酵母樣平板培養(yǎng)結(jié)果為1.44×107cfu/mL(原液簡為Y0)，檢測系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mL GB，發(fā)光檢測結(jié)果見表3。
表3 酵母人工樣品在HKM-NRD(1)機上發(fā)光檢測結(jié)果
注酵母菌含ATP量按3×10-14g/cell計。
結(jié)果表明兩臺儀器的檢測結(jié)果比較接近，當酵母菌樣的濃度在103cells/m～107cells/mL時，用ATP生物發(fā)光法檢測較能反應(yīng)出真實的水平。
實施例4細菌人工樣品的發(fā)光檢測(SHG-C)在0.5ml系統(tǒng)中于SHG-C上進行釀酒酵母樣品檢測，人工細菌樣品ATCC25922平板培養(yǎng)結(jié)果為6.4×108cfu/mL(原液簡為Y0)，檢測系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mLGB，發(fā)光檢測結(jié)果見表4。
表4 細菌人工樣品在SHG-C上發(fā)光檢測結(jié)果
注細菌的平均ATP含量為3×10-16g/cell，標準ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明用ATP生物發(fā)光法檢測微生物數(shù)量時，速度很快，具體的檢測過程只需十幾分鐘，通過標準回歸方程和細菌的ATP含量換算關(guān)系，可以得出細胞數(shù)，在細菌細胞數(shù)為104cells/mL~108cells/mL，較能反應(yīng)出真實的水平。
實施例5霉菌人工樣品的ATP發(fā)光檢測在0.5mL系統(tǒng)中于SHG-C上進行霉菌MIG3.95孢子人工樣品檢測，MIG3.95孢子數(shù)顯微計數(shù)值為9.45×107cfu/mL(原液簡稱M0)，檢測系統(tǒng)0.1mL FL+0.1mLATP或H2O樣+0.3mL GB，ATP發(fā)光檢測結(jié)果見表4。
表5 霉菌人工樣品的ATP發(fā)光測試結(jié)果
注霉菌孢子的平均ATP含量按3×10-16g/cell計算，標準ATP采用1×10-7mol/L。
結(jié)果表明用ATP生物發(fā)光法檢測霉菌孢子數(shù)時，當孢子數(shù)在103～108cells/mL之間ATP生物發(fā)光法換算的結(jié)果和顯微鏡計數(shù)結(jié)果差異不算大。
實施例6；瓶裝飲用水微生物數(shù)量的生物發(fā)光測定1、水樣1#天然泉水廠儲水池水、2#5加侖天然飲用泉水、3#5加侖飲用凈水、4#礦泉水水處理過錳沙前水(1#～4#樣品均由懷疑產(chǎn)品有藻類污染的瓶裝飲用水廠家提供)、5#水庫水、6#天臺水池水。
2、水樣預(yù)處理參照常規(guī)取樣方法取飲用水樣100～1000mL(根據(jù)樣品的潔凈程度而定)，振搖使樣品分散均勻，然后抽真空分別通過8μm、3μm及0.45μm經(jīng)滅菌處理的微孔濾膜，并分別用50mL無菌去離子水洗滌過濾漏斗和微孔濾膜。
3.樣品ATP的提取濾膜截留細胞ATP的提取將抽濾樣品后的各種濾膜取下，分別置于50mL無菌小燒杯中，加入1mL無菌超純水，再加入1mL細胞ATP抽提液Ec，用槍頭輕輕吸打，作用1.5min。分別取1mL不同濃度的ATP標準品取代1mL無菌去離子水做同樣處理作為標準樣；空白微孔濾膜做同樣處理作為空白樣。
4.發(fā)光測試在0.5ml系統(tǒng)中于SHG-C上進行ATP生物發(fā)光測試。吸取0.1mL樣品ATP提取液于發(fā)光管中，加入0.3mL發(fā)光檢測緩沖液中，再加入0.1mL配制好的生物發(fā)光試劑(FL04113)，立刻搖勻，置于25℃生物發(fā)光檢測儀中進行發(fā)光脈沖計數(shù)。同時作1×10-7mol/L ATP標準品和空白樣的發(fā)光檢測。
5.樣品中ATP濃度計算依測試樣品的凈相對發(fā)光值ΔCP6S，根據(jù)回歸方程計算樣品的ATP濃度。
6.樣品中相應(yīng)微生物細胞數(shù)計算在分級過濾的濾膜上截留的不同微生物細胞內(nèi)ATP含量后，根據(jù)不同細胞的ATP含量轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的細胞數(shù)。
7.實驗結(jié)果采用8μm、3μm和0.45μm的濾膜對飲用水樣品進行分級過濾，檢測濾膜截留ATP量換算成樣品中的微藻細胞數(shù)及細菌數(shù)(表5)。結(jié)果表明，樣品中的微藻主要由8μm的濾膜截留，3μm和0.45μm的濾膜截留的主要是細菌。從表5的檢測結(jié)果看，樣品在污染藻類的同時，亦污染了細菌和真菌，提示水處理工藝或包裝材料的清洗消毒不完善。由于飲用水樣品中存在的對發(fā)光檢測造成干擾的物質(zhì)較少，用濾膜截留微生物細胞發(fā)光檢測結(jié)果與平板計數(shù)法較為相近，因此可以達到快速檢測飲用水中污染的微生物的目的，有利于生產(chǎn)現(xiàn)場監(jiān)控和產(chǎn)品分析。
表6 濾膜法截留飲用水中微藻和細菌分級檢測結(jié)果
注表中A表示換算成微藻細胞的數(shù)量，B表示換算成細菌的數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種微生物數(shù)量的生物發(fā)光法抗干擾快速檢測試劑盒，其特征在于包括熒光素酶及其保護劑、D-熒光素、標準ATP、發(fā)光檢測緩沖液、非細胞ATP去除劑、微生物細胞ATP抽提劑。
2.一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測試劑盒，其特征在于按比例取熒光素酶100mL，加酶保護劑10mL、含50～150mg D-熒光素的發(fā)光檢測緩沖液10mL，預(yù)先混合配制成ATP生物發(fā)光試劑。
3.權(quán)利要求1或2所述的一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測試劑盒，其中熒光素酶須經(jīng)過純化，活力本底比達到50～500，在1mL發(fā)光檢測系統(tǒng)中加入0.1mL 1×10-7mol/L ATP的發(fā)光脈沖值CP6S不低于7000。
4.權(quán)利要求1或2所述的微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測試劑盒，其中D-熒光素的發(fā)光活力須達到相當于Sigma L9504的水平。
5.權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒，其中熒光素酶保護劑含50～75％海藻糖、10～15％ PEG6000和10～15％的BSA。
6.權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒，所用發(fā)光檢測緩沖液采用甘氨酰甘氨酸、Tricine、Tris、Glycine amide、Phosphate、MOPS、TES等緩沖鹽中的一種配制成濃度為25mmol/L、pH7.2的緩沖液。
7.權(quán)利要求6所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒，所用發(fā)光檢測緩沖液含25mmol/L甘氨酰甘氨酸、0.5mg/mL BSA、0.5mmol/L EDTA、0.5mmol/L DTT、pH7.2。
8.權(quán)利要求1所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒，非細胞ATP去除劑的配制方法為將含有50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L MgSO4、1mmol/L EDTA、1mg/ml BSA、pH6.8的緩沖液配制焦磷酸酶至濃度為0.1～10mg/mL。
9.權(quán)利要求1所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒，微生物細胞ATP去除劑含1～30g/LTritonX-100、0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化銨、0.1～3.0g/L二甲亞砜、0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸、0.01～0.1g/L硫酸鎂。
10.權(quán)利要求1或2所述的一種微生物數(shù)量生物發(fā)光快速檢測試劑盒，其特征在于還含有抗防腐劑型、抗消毒劑型或抗臭氧型液體大樣檢測培養(yǎng)基中的一種或幾種抗干擾培養(yǎng)基。
11.利用權(quán)利要求1或2所述的生物發(fā)光法快速檢測試劑盒進行快速檢測的方法，按下述步驟進行(1)標準ATP曲線的制作在生物發(fā)光儀0.5mL系統(tǒng)中，進行10-12～10-6mol/L系列標準ATP濃度發(fā)光檢測，并做出對數(shù)曲線和線性回歸方程Lg[ATP]＝A+BLgΔCP6S或lg[ATP]＝A+Blg(ΔCPM)，其中A和B為回歸方程的系數(shù)；(2)樣品的預(yù)處理依樣品的形態(tài)、性質(zhì)和內(nèi)含物及檢測目標進行相應(yīng)樣品預(yù)處理包括非目標ATP的去除、微生物細胞的分級過濾、樣品中干擾成份的去除、最后將樣品稀釋或濃縮到適合ATP生物發(fā)光法的檢測范圍等；(3)微生物細胞ATP的抽提將經(jīng)過預(yù)處理的樣品用微生物細胞ATP抽提劑Ec進行ATP的提取，具體過程為Ec與液體樣品按1∶1比例加入后，室溫作用1.5～2.0min；濾膜上微生物細胞ATP提取則是將抽濾樣品后的各種濾膜取下，分別置于50mL無菌小燒杯中，加入1～2mL細胞ATP抽提液Ec，室溫作用1.5～2.0min；(4)ATP生物發(fā)光測試取0.1mL ATP提取液，加入含0.3mL發(fā)光檢測緩沖液的發(fā)光管中搖勻，再加入生物發(fā)光試劑0.1mL，搖勻后立即置發(fā)光檢測儀中進行發(fā)光檢測，讀取發(fā)光脈沖計數(shù)值CP6S或CPM，同時進行1mL無菌去離子水空白樣品的對照測試。(5)樣品中相應(yīng)微生物細胞ATP含量的計算ATP生物發(fā)光測試后的樣品發(fā)光值去除空白后的凈相對發(fā)光值取對數(shù)后，通過標準曲線回歸方程，計算樣品中相應(yīng)的ATP濃度。(6)樣品中細菌、酵母、霉菌和單細胞藻類數(shù)量或以細菌計的微生物總數(shù)的計算
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用ATP生物發(fā)光法進行微生物數(shù)量快速檢測的方法及檢測試劑盒，快速檢測試劑盒包括熒光素酶及其保護劑、D－熒光素、標準ATP、發(fā)光檢測緩沖液、非細胞ATP去除劑、微生物細胞ATP抽提劑等試劑。應(yīng)用該檢測試劑盒進行微生物數(shù)量快速測定的標準方法是通過在選定的生物發(fā)光儀和選定的系統(tǒng)中做ATP標準曲線，取對數(shù)后得到線性回歸方程，將經(jīng)過非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統(tǒng)中用同一批酶進行ATP生物發(fā)光檢測，同時做空白對照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對發(fā)光值取對數(shù)后，通過建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據(jù)細菌、酵母、霉菌和單細胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細菌、酵母、霉菌孢子或單細胞微藻的細胞數(shù)，或只計相當于細菌數(shù)量。
文檔編號C12Q1/25GK1876829SQ20061003438
公開日2006年12月13日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者吳清平, 吳慧清, 張菊梅, 李程思 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司