專利名稱：一種人類表皮生長因子受體(egfr)基因外顯子20的t790m突變快速檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2004年6月，美國學(xué)者Lynch和Paez等首先報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌中表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向藥物奏效的一個(gè)必要前提，已證實(shí)對EGFR編碼區(qū)基因突變型腫瘤，EGFR酪氨酸激酶抑制劑gefitinib(又稱Iressa或ZD1839)的有效率高達(dá)80％以上，而對無突變的野生型腫瘤上述藥物基本無效。再者，經(jīng)gefitinib療有效的患者，當(dāng)EGFR基因編碼區(qū)出現(xiàn)T790M(2369 C＞T)突變時(shí)則藥物失效，需要及時(shí)更換新的有效抑制劑或應(yīng)用其它治療方法。因此，通過檢測EGFR基因突變型，可以從晚期肺癌病人中篩選出最適治療對象進(jìn)行個(gè)體化治療，從而顯著提高藥物療效，節(jié)約資源。
本發(fā)明的優(yōu)勢PCR技術(shù)以其自身巧妙的原理有與眾不同的特點(diǎn)，高特異性、高敏感性及簡便快捷使其成為基因診斷首選的技術(shù)之一。
(1)高特異性，PCR擴(kuò)增嚴(yán)格遵守堿基配對原則的半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是世界上最嚴(yán)格的復(fù)制方式之一，其新合成的子鏈與模板形成完全互補(bǔ)的鏡像結(jié)構(gòu)，從而充分保證了復(fù)制的準(zhǔn)確性。另外，由于堿基互補(bǔ)原則，只有當(dāng)引物與目的基因完全互補(bǔ)時(shí)，反應(yīng)體系中的引物才能與模板產(chǎn)生復(fù)性，引物的延伸才得以進(jìn)行，因此引物與模板的互補(bǔ)是復(fù)制的最基本條件，這從另一方面規(guī)定了PCR反應(yīng)的高特異性。在生物界中，某種基因總有它最保守的、最具特征性的基因區(qū)段，它是某些生物，或某些型、亞型等功能分型所特有的。若能正確地選擇這一區(qū)域作為擴(kuò)增的目的基因，聯(lián)合探針雜交的特異性，便可以充分地保障PCR檢測的高度特異性。
(2)高敏感性，在PCR反應(yīng)中模板DNA以指數(shù)級(jí)迅速增加，擴(kuò)增反應(yīng)前期進(jìn)入以指數(shù)級(jí)迅速增加，擴(kuò)增反應(yīng)后期進(jìn)入平臺(tái)反應(yīng)期，一般經(jīng)過30個(gè)循環(huán)即1-2小時(shí)內(nèi)可以將靶序列增加百萬倍以上，可以將微量的目標(biāo)物(fg DNA)檢測出來。過去采用的一些微量檢測法，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和放射免疫分析(RIA)其靈敏度分別為ng級(jí)和pg級(jí)，而PCR可達(dá)fg級(jí)，理論上可以檢出病原體的單拷貝基因的存在。
(3)簡便快捷，Taq酶的使用使PCR技術(shù)可以自動(dòng)化完成，各種高效PCR儀相續(xù)問世使PCR操作可以在基層單位的實(shí)驗(yàn)室中順利完成。在PCR的實(shí)際應(yīng)用中，許多技術(shù)得到改進(jìn)，擴(kuò)增反應(yīng)體積減少，多種成分預(yù)先混合減少加樣步驟，這些簡化步驟大多不影響PCR的擴(kuò)增效果。特別是單管單人份的PCR試劑，使操作者節(jié)省時(shí)間精力，而且又不易污染，充分滿足了臨床快速診斷的要求PCR技術(shù)對樣品要求低，不必嚴(yán)格純化模板DNA，幾乎所有的臨床樣本都能用于PCR擴(kuò)增。
(4)經(jīng)濟(jì)實(shí)用，傳統(tǒng)的SNP或點(diǎn)突變檢測方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-SSO等，大多涉及電泳、酶切、顯色及拍照等后處理，操作費(fèi)時(shí)繁瑣，特異性和敏感性較差，不能自動(dòng)化及高通量檢測，也容易造成交叉污染，測序及芯片技術(shù)則耗時(shí)昂貴。本發(fā)明結(jié)合了PCR及分子探針的特性，可精確快速檢測EGFR基因外顯子20的T790M(2369 C＞T)突變，尤其是PCR實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，可使擴(kuò)增反應(yīng)和分子雜交在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，無須PCR后處理步驟，避免了污染，并能分辨單堿基差異，靈敏度高，操作簡便快速，適于大批量樣本的檢測，整個(gè)檢測可在2小時(shí)完成。我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。現(xiàn)時(shí)各大中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)基本上均配置了熒光PCR儀，本發(fā)明具有極廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法和試劑盒，其特征采用PCR擴(kuò)增人類染色體7p12 EGFR基因外顯子20的包含T790M(2369 C＞T)突變位點(diǎn)的基因序列，應(yīng)用分子熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，應(yīng)用熒光PCR儀實(shí)時(shí)測量PCR過程中反應(yīng)液的特征性熒光信號(hào)強(qiáng)度變化，或PCR后應(yīng)用熒光分光光度儀測量反應(yīng)液的特異熒光強(qiáng)度，進(jìn)行結(jié)果判斷。
根據(jù)人表皮生長因子受體(EGFR)基因Seq ID NONM_005228的cDNA序列選擇引物為可擴(kuò)增EGFR基因外顯子20的包含T790M(2369 C＞T)突變位點(diǎn)的基因序列的一對引物；選擇探針為在兩引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)與靶序列互補(bǔ)的兩條寡核苷酸探針，5’端分別用FAM或HEX修飾，3’端用氨基修飾并標(biāo)記DABCYL。其序列為
上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’.
野生型探針序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突變型探針序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL檢測T790M(2369 C＞T)突變的試劑盒包括反應(yīng)混合液；突變型對照；野生型對照；樣品提取液；使用說明書。試劑盒突變型對照為T790M(2369 C＞T)突變型DNA序列；野生型對照為T790M(2369 C＞T)野生型DNA序列。試劑盒反應(yīng)混合液為1×PCR緩沖液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0))；內(nèi)含兩引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.5U，反應(yīng)總體積50μl。
本發(fā)明保護(hù)所設(shè)計(jì)的引物及探針序列應(yīng)用于雜交芯片檢測人類染色體7p12EGFR基因外顯子20的T790M(2369 C＞T)突變。


圖1為PCR擴(kuò)增條件參數(shù)；圖2為熒光PCR儀檢測時(shí)可能出現(xiàn)的熒光信號(hào)增長曲線形式。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明試劑盒組成如下反應(yīng)混合液1×PCR緩沖液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/LTris-HCl(pH8.0))；內(nèi)含兩引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.0U，反應(yīng)總體積50μl。陽性對照為T790M(2369 C＞T)突變型DNA序列；陰性對照為其野生型DNA序列。
樣品提取液(1).二甲苯；(2).無水乙醇；(3).1.5％三乙醇胺月桂酸硫酸鹽(TLS)；(4).氯仿∶異戊醇(24∶1)；(6).TE(pH8.0)。
野生型探針序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突變型探針序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL委托上海申友生物技術(shù)有限公司合成。
PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。
上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’.
HotTaq酶購自大連寶生物工程有限公司。
dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)購自上海生工生物工程公司。
PCR薄壁反應(yīng)管購自大連寶生物工程有限公司，200μl。
檢測步驟(一)組織DNA提取切片脫臘取300mg左右3～5um厚組織切片放入1.5ml的eppendorf管，加1ml二甲苯，渦旋振蕩，離心5分鐘，棄上清；再重復(fù)二甲苯抽提兩次。用1ml無水乙醇洗滌沉淀片，渦旋振蕩，離心5分鐘，棄上清，重復(fù)洗滌一次。充分干燥。
充分剪碎或研漿適量組織(300mg左右)，石蠟包埋或切片須常規(guī)脫臘，移入5ml的eppendorf管，加入生理鹽水200ul，1.5％三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)200ul，0℃1小時(shí)，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1v/v)，充分振搖10min，3000r/min 10min，吸出上層水相入新管，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1 v/v)，充分振搖10min，3000r/min 10min，吸出上層水相，加入等體積冷乙醇，混勻離心離心10000r/min 1min，棄上清，取沉淀，溶于TE(pH8.0)20～30ul即為高純度DNA，4℃待用。
(二)PCR擴(kuò)增反應(yīng)(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合液取2ul上述DNA提取液作為模板，加入1×PCR緩沖液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/LMgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/LTris-HCl(pH8.0))；內(nèi)含兩引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.0U，反應(yīng)總體積50μl 。
(2)PCR擴(kuò)增條件(如圖1所示)
(三)結(jié)果判定(1)熒光PCR儀的實(shí)時(shí)檢測PCR過程中設(shè)定于58℃退火時(shí)同時(shí)檢測FAM及HEX熒光素的特征熒光信號(hào)增長，如果僅有FAM熒光素的信號(hào)呈特征性指數(shù)增長并穿過域值則說明該標(biāo)本為純合野生型；如果僅有HEX熒光素的信號(hào)呈特征性指數(shù)增長并穿過域值則說明該標(biāo)本為T790M(2369 C＞T)純合突變型；如果FAM及HEX熒光素的信號(hào)均呈特征性指數(shù)增長并穿過域值則說明該標(biāo)本為T790M(2369 C＞T)雜合突變型。(如圖2所示)(2)熒光分光光度計(jì)檢測若沒有PCR反應(yīng)完成后，熒光分光光度計(jì)于58℃分別檢測反應(yīng)管FAM及HEX熒光素的熒光強(qiáng)度，分別以陰性及陽性對照的相應(yīng)熒光強(qiáng)度為對照，將熒光強(qiáng)度高于相應(yīng)本底熒光強(qiáng)度4倍標(biāo)準(zhǔn)差作為有意義判斷。最終判斷模板DNA的突變性別。
權(quán)利要求
1.一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征采用PCR擴(kuò)增人類染色體7p12 EGFR基因外顯子20的包含T790M(2369 C＞T)突變位點(diǎn)的基因序列，應(yīng)用分子熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，應(yīng)用熒光PCR儀實(shí)時(shí)測量PCR過程中反應(yīng)液的特征性熒光信號(hào)強(qiáng)度變化，或PCR后應(yīng)用熒光分光光度儀測量反應(yīng)液的特異熒光強(qiáng)度，進(jìn)行結(jié)果判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征在于選擇引物為可擴(kuò)增EGFR基因外顯子20的包含T790M(2369 C＞T)突變位點(diǎn)的基因序列的一對引物上游引物F5’CCGCCTGCTGGGCATCTG 3’下游引物R5’GCGATCTGCACACACAGTTGAG 3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征在于其檢測T790M(2369 C＞T)突變的分子熒光探針在兩引物擴(kuò)增片段內(nèi)設(shè)計(jì)與靶序列互補(bǔ)的兩條寡核苷酸探針，5’端分別用FAM或HEX修飾，3’端用氨基修飾并標(biāo)記DABCYL。其序列為野生型探針序列Probe-wtFAM-5’-GCGACATCACGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL突變型探針序列Probe-muHEX-5’-GCGACATCATGCAGCTCATGCCCTGTCGC-3’-DABCYL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征在于熒光探針PCR檢測T790M(2369 C＞T)突變的試劑盒包括反應(yīng)混合液；突變型對照；野生型對照；樣品提取液；使用說明書。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征在于檢測T790M(2369 C＞T)突變的試劑盒反應(yīng)混合液為1×PCR緩沖液(0.1％TritonX-100；2.0～6.0mmol/L MgCl2；8mmol/L(NH4)2SO4；50mmol/L KCl；10mmol/L Tris-HCl(pH8.0))；內(nèi)含兩引物各0.3μmol/L，Probe-wt0.2μmol/L，Probe-mu0.3μmol/L；dNTP各250μmol/L，HotTaq酶1.5U，反應(yīng)總體積50μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法，其特征在于所設(shè)計(jì)探針序列應(yīng)用于雜交芯片檢測人類染色體7p12EGFR基因外顯子20的T790M(2369 C＞T)突變。
全文摘要
本發(fā)明是一種人類表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子20的T790M突變快速檢測方法。屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。根據(jù)人類染色體7p12 EGFR基因外顯子20的DNA序列設(shè)計(jì)一對引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)特異性擴(kuò)增包含T790M(2369 C＞T)突變位點(diǎn)的一段DNA序列，應(yīng)用一對分子熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，通過熒光PCR儀實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)管特征性的相應(yīng)熒光強(qiáng)度變化，或PCR后通過熒光分光光度儀直接測量反應(yīng)管的特異性熒光強(qiáng)度，檢測標(biāo)本是否存在T790M突變，該方法簡便快速，特異性強(qiáng)，適于大批量樣本快速檢測，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。本發(fā)明還提供了適于臨床應(yīng)用的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101041850SQ20061003429
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月20日
發(fā)明者呂成偉 申請人:呂成偉