專利名稱：一種轉(zhuǎn)基因番茄高效穩(wěn)定表達體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達藥用蛋白、疫苗分子等的轉(zhuǎn)基因番茄體系。該體系是以番茄果實特異性E8啟動子、增強型的花椰菜花葉病毒35S啟動子與E8啟動子構(gòu)成的雙啟動子驅(qū)動疫苗分子等目的蛋白，以及NOS終止子構(gòu)成的基因表達操縱子，構(gòu)建中間載體、植物表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后所建立的番茄轉(zhuǎn)化、篩選鑒定以及穩(wěn)定高效表達外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植株品系培育和分子鑒定體系，包括所有涉及的載體、菌種，技術(shù)流程、試劑配方、最后所獲得的高效穩(wěn)定表達的疫苗或藥用蛋白及其轉(zhuǎn)基因番茄品系與應(yīng)用情況。
背景技術(shù)：
(一)植物生物反應(yīng)器的優(yōu)越性植物基因工程的實質(zhì)就是在分子水平上重組植物遺傳物質(zhì)，以獲得人們所期望的作物新品種。植物醫(yī)藥基因工程是將醫(yī)藥用目的基因?qū)胫参镞z傳物質(zhì)，獲得表達外源基因的轉(zhuǎn)基因植株，以生產(chǎn)醫(yī)藥用重組蛋白、抗體，研制轉(zhuǎn)基因口服疫苗。植物作為新型生物反應(yīng)器，具有以下幾方面的優(yōu)越性1.植物細胞具有全能性。
2.植物具有完整的真核細胞表達系統(tǒng)，可實現(xiàn)表達產(chǎn)物的糖基化、磷酸化，亞基的正確裝配以及蛋白的正確折疊等翻譯后加工，使其表達產(chǎn)物較原核表達系統(tǒng)具有更好的生物活性和免疫原性。
3.植物主要依靠光合作用生長，能實現(xiàn)大規(guī)模種植，是目前最經(jīng)濟、能大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)，故又稱之為“生物藥田”。
4.果蔬類植物如番茄、香蕉等以其獨具的可食(飼)性在疫苗研制方面展示了良好的開發(fā)應(yīng)用潛能。這種予“免疫接種”于“食用”的新型疫苗的開發(fā)，將使疫苗的使用變得簡便而價廉。一方面，可省去傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)所需要的繁瑣的下游蛋白分離提純步驟，節(jié)省大量的人力物力；另一方面，比傳統(tǒng)的免疫途徑更安全，不需要注射器和針頭之類的設(shè)備，可避免因使用未經(jīng)消毒的注射器和針頭而交叉感染經(jīng)血液傳播的疾病，如艾滋病和乙肝等；另，植物病毒等對人和動物無致病性，不會引起如致弱疫苗等存在的回復(fù)突變，以及在常規(guī)疫苗制備過程中病毒細菌的污染而引起的潛在致病的擔憂。
5.易于儲存和分發(fā)，不需要常規(guī)疫苗的冷鏈設(shè)備，可隨時長期給藥。
6.可實現(xiàn)大范圍給藥，可用于人、家畜和野生食草動物等，不需要過多的經(jīng)過特殊培訓(xùn)的專業(yè)醫(yī)護、技術(shù)人員的投入。
7.轉(zhuǎn)基因果蔬疫苗，在服用疫苗的同時，還提供了營養(yǎng)。
8.可實現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化可在設(shè)計構(gòu)建植物表達載體進行多基因的聯(lián)接；也可在獲得不同單基因轉(zhuǎn)化植株后，將鑒定后的兩種不同基因轉(zhuǎn)化的子代進行雜交培育，獲得表達雙基因產(chǎn)物的新植株品系。對實現(xiàn)多種疾病的同步防治，或?qū)ι钍窂?fù)雜、抗原多變的寄生蟲病防治均提供了一條新的疫苗防治思路。
(二)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中“轉(zhuǎn)基因沉默”現(xiàn)象近年來，用果蔬如番茄等作為口服疫苗蛋白及藥用蛋白表達系統(tǒng)，較被看好，有著巨大的開發(fā)潛能。但其離實際應(yīng)用還有一些距離，許多問題尚需深入研究。大量實驗結(jié)果顯示在植物基因轉(zhuǎn)化過程普遍存在外源基因的表達水平低甚至不表達，而且各獨立轉(zhuǎn)化體間出現(xiàn)顯著差異。這種外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達受到抑制的現(xiàn)象稱之為轉(zhuǎn)基因沉默(transgene silencing)。
基因沉默主要涉及外源基因之間或外源基因和植物內(nèi)源基因之間的互相作用，最重要的原因是存在多拷貝的同源DNA序列，包括蛋白編碼區(qū)以及啟動子等調(diào)控序列。轉(zhuǎn)基因沉默主要可發(fā)生在兩個階段轉(zhuǎn)錄水平上(transcriptionalgene silencing，TGS)，轉(zhuǎn)錄后水平上(post-transcriptional genesilencing，PTGS)。
(三)提高外源基因表達水平克服轉(zhuǎn)基因沉默的應(yīng)對策略分析啟動子是基因轉(zhuǎn)錄水平最為重要的調(diào)控因子之一，在決定基因表達方面作用關(guān)鍵，因此，選擇合適的植物啟動子和改進其活性對增強外源基因表達至關(guān)重要。
目前在植物基因轉(zhuǎn)化過程中廣泛使用的是組成型啟動子，其可驅(qū)動外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段的表達。雙子葉植物多使用CaMV35S啟動子。近年來，特異性表達啟動子的研究受到重視，其能調(diào)控外源基因在植物基因轉(zhuǎn)化體內(nèi)特定的時空秩序或在外源誘導(dǎo)因子的作用下呈現(xiàn)特異性表達，一方面可提高表達效能和表達水平，另一方面，尚可節(jié)省生物能耗，減小外源基因?qū)χ参锉旧淼挠绊?。特異性啟動子主要包括組織特異性啟動子和誘導(dǎo)特異性啟動子。組織特異性啟動子，如種子特異性表達啟動子、果實特異性啟動子、葉肉細胞特異性啟動子、根特異性啟動子等。誘導(dǎo)特異性啟動子主要有環(huán)境響應(yīng)啟動子，如光響應(yīng)啟動子、溫度響應(yīng)啟動子等；激素響應(yīng)啟動子，如IAA響應(yīng)啟動子、乙烯響應(yīng)啟動子等。這些特異性啟動子的克隆和應(yīng)用為實現(xiàn)外源基因在植物中的特異性表達奠定了基礎(chǔ)。
在植物基因轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，對現(xiàn)有的天然啟動子進行改造，構(gòu)建復(fù)合式啟動子也是一條提高啟動子活性的重要途徑。吳瑞等人將誘導(dǎo)型PI-II基因啟動子與水稻Actinl基因內(nèi)含子1進行組合，新型啟動子的表達活性提高了近10倍[32]外源基因的結(jié)構(gòu)，選用的密碼子是否符合植物受體的偏好；外源基因片段的大小，以及所選用的啟動子等諸多因素，均對轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。外源基因的片段大小可影響其能否穩(wěn)定表達，大片段的目的基因?qū)NA截斷(truncation)、位置效應(yīng)(position effect)以及共抑制效應(yīng)(co-suppression)較為敏感。而啟動子則是影響外源基因能否穩(wěn)定高效表達的最重要、最關(guān)鍵的因素之一。
(四)本發(fā)明構(gòu)建了高效穩(wěn)定表達外源目的蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄體系本發(fā)明克隆獲得了我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5果實特異性啟動子E82.2和E81.1基因，分別用番茄果實特異性E82.2啟動子以及E35S-E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動疫苗分子以及NOS終止子構(gòu)成的基因表達操縱子，構(gòu)建植物表達載體，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404；建立了番茄高頻再生體系和高效轉(zhuǎn)化體系；獲得能高效穩(wěn)定表達的疫苗分子重組蛋白及其番茄轉(zhuǎn)化株系(部分植株目的蛋白的表達量可達番茄組織可溶性總蛋白的10％以上，且經(jīng)過蛋白純化、Westernblot、ELISA分析表明所獲得的重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性)。本發(fā)明構(gòu)建了可用于外源疫苗分子及藥用蛋白生產(chǎn)的番茄高效穩(wěn)定表達體系技術(shù)平臺，為深入研發(fā)番茄口服疫苗及其藥用蛋白提供了良好的技術(shù)平臺。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是從我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5克隆分離了番茄果實特異性啟動子E82.2和E81.1基因，獲得載體pGEM-T-E82.2和pGEM-T-E81.1。分別用番茄果實特異性E82.2啟動子、植物組成型啟動子E35S以及以E35S和E81.1構(gòu)成E35S-E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動外源目的基因疫苗分子，與NOS終止子組成表達操縱子單元，亞克隆后構(gòu)建植物中間載體和表達載體，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得用于植物轉(zhuǎn)化的疫苗分子表達工程菌；優(yōu)化含培養(yǎng)基配方及操作流程等的技術(shù)方案建立了番茄高頻再生體系和番茄基因轉(zhuǎn)化體系，將植物轉(zhuǎn)化工程菌用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染番茄，卡那霉素抗性篩選獲取番茄轉(zhuǎn)基因植株以PCR等方法進行目的基因整合番茄基因組的鑒定；用RT-PCR鑒定目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達情況；用SDS-PAGE、Western blot分析鑒定目的基因在番茄轉(zhuǎn)化植株中的蛋白表達情況，并初步進行了番茄表達重組蛋白的純化并進行轉(zhuǎn)基因番茄植株T1代初步的遺傳分析，獲得能高效穩(wěn)定表達疫苗分子的番茄轉(zhuǎn)化株系(部分植株目的蛋白的表達量可達番茄組織可溶性總蛋白的10％以上，且經(jīng)過蛋白純化、Western blot、ELISA分析表明所獲得的重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性)。本發(fā)明構(gòu)建了可用于外源疫苗分子及藥用蛋白生產(chǎn)的番茄高效穩(wěn)定表達技術(shù)平臺。
這樣，在第一個方面，本發(fā)明提供了我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5番茄果實特異性啟動子E82.2基因序列Zhongshu No.5番茄果實特異性啟動子E82.2基因序列TCCCTAATGA TATTGTTCAT GTAATTAAGT TTTGTGGAAG TGAGAGAGTC CAATTTTGAT60AAGAAAAGAG TCAGAAAACG TAATATTTTA AAAGTCTAAA TCTTTCTACA AATAAGAGCA 120AATTTATTTA TTTTTTAATC CAATAAATAT TAATGGAGGA CAAATTCAAT TCACTTTGGT 180TGTAAAATAA ACTTAAACCA ATAACCAAAG AACTAATAAA TCCTGAAGTG GAATTATTAA 240GGATAAATGT ACATAGACGA TGAAGAAATA ATAGGTTCGA TGAATTAATA ATAATTAAGG 300ATGTTACAAT CATCATGTGC CAAGTATATA CACAATATTC TATGGGATTT ATAATTTCGT 360TACTTCACTT AACTTTTGCG TAAATAAAAC GAATTATCTG ATATTTTATA ATAAAACAGT 420TAATTAAGAA CCATCATTTT TAACAACATA GATATATTAT TTCTAATAGT TTAATGATAC 480TTTTAAATCT TTTAAATTTT ATGTTTCTTT TAGAAAATAA AAATTCAAAA AATTAAATAT 540ATTTACAAAA ACTACAATCA AACACAACTT CATATATTAA AAGCAAAATA TATTTTGAAA 600ATTTCAAGTG TCCTAACAAA TAAGACAAGA GGAAAATGTA CGATGAGAGA CATAAAGAGA 660ACTAATAATT GAGGAGTCCT ATAATATATA ATAAAGTTTA TTAGTAAACT TAATTATTAA 720GGACTCCTAA AATATATGAT AGGAGAAAAT GAATGGTGAG AGATATTGGA AAACTTAATA 780ATTAAGGATT TTAAAATATA TGGTAAAAGA TAGGCAAAGT ATCCATTATC CCCTTTTAAC 840TTGAAGTCTA CTAGGCGCAT GTGAAAGTTG ATTTTTTGTC ACGTCATATA GCTATAACGT 900AAAAAAAGAA AGTAAAATTT TTAATTTTTT TTAATATATG ACATATTTTA AACGAAATAT 960AGGACAAAAT GTAAATGAAT AGTAAAGGAA ACAAAGATTA ATACTTACTT TGTAAGAATT 1020TAAGATAAAT TTAAAATTTA ATAGATCAAC TTTACGTCTA GAAAGACCCA TATCTAGAAG 1080GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCGAAA ATAACTTTTA AATAATGAAT TTTAAATTTT 1140AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT GTAGCATTTT ACCTAAATAT TTCAACTATT 1200TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA ACAATAGAAA GTCTTGTGCA GACATTTAAT 1260CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT CTGAAGATTT TCGGGTTTAG TCCACAAGTT 1320TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AATTTTAGGT GAGAAGGTTT GATATTTATC TTTTGTTAAA 1380TTAATTTATC TAGGTGACTA TTATTTATTT AAGTAGAAAT TCATATCATT ACTTTTGCCA 1440ACTTGTAGTC ATAATAGGAG TAGGTGTATA TGATGAAGGA ATAAACAAGT TCAGTGAAGT 1500GATTAAAATA AAATATAATT TAGGTGTACA TCAAATAAAA ACCTTAAAGT TTAGAAAGGC 1560ACCGAATAAT TTTGCATAGA AGATATTAGT AAATTTATAA AAATAAAAGA AATGTAGTTG 1620TCAAGTTGTC TTCTTTTTTT TGGATAAAAA TAGCAGTTGG CTTATGTCAT TCTTTTACAA 1680CCTCCATGCC ACTTGTCCAA TTATTGACAC TTAACTAATT AGTTTGATTC ATGTATGAAT 1740
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在第五個方面，一種如權(quán)利要求1或2或3所限定之啟動子或E35S啟動子驅(qū)動目的疫苗分子，以NOS為終止子構(gòu)成植物表達外源疫苗分子的操縱子單元，及其構(gòu)建的植物中間載體pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG、pB35tSAG1、pB35E1tSAG1、pBE2tSAG1。其中植物表達操縱子單元構(gòu)成如下pB35MG含操縱子單元E35S啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pB35E1MG含操縱子單元E35S-E81.1復(fù)合式啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pBE2MG含操縱子單元E82.2啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pB35tSAG1含操縱子單元E35S啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子pB35E1tSAG1含操縱子單元E35S-E81.1復(fù)合式啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子pBE2tSAG1含操縱子單元E82.2啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子在第六個方面，一種如權(quán)利要求1或2或3或5所限定之啟動子或植物表達外源疫苗分子的操縱子單元構(gòu)建的植物表達載體pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG、pC35tSAG1、pC35E1tSAG1、pCE2tSAG1。
在第七個方面，一種如權(quán)力要求1或2或3或5或6所限定之啟動子或植物表達外源疫苗分子的操縱子單元構(gòu)建的植物表達載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株，即工程菌pC35MG/LBA4404、pC35E1MG/LBA4404、pCE2MG/LBA4404、pC35tSAG1/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404、pCE2tSAG1/LBA4404。
在第八個方面，一種限定植物培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件及其技術(shù)方案與操作流程的番茄高頻再生體系。
再生培養(yǎng)基1MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ZT0.2～0.5mg/L，IAA 0.1mg/L；或再生培養(yǎng)基2MS，ZT0.2～0.5mg/L；或再生培養(yǎng)基3MS，ZT0.2～0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L；培養(yǎng)條件為置人工光照氣候箱中，溫度條件23℃-25℃，2周繼代培養(yǎng)一次。
在第九個方面，一種限定植物培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，以及番茄外植體預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)以及高抗性篩選下的芽誘導(dǎo)、芽伸長、根誘導(dǎo)，以及篩選獲得植株后的練苗、移栽與栽培的技術(shù)方案與操作流程。包括(a)植物表達工程菌浸染懸浮液制備時加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度100μM，番茄外植體經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、浸染與共培養(yǎng)，使用上述再生培養(yǎng)基3。
對上述(a)所獲得的番茄轉(zhuǎn)化體進行芽誘導(dǎo)與芽伸長時期的抗性篩選培養(yǎng)，芽誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基由下列組分配制而成MS，ZT0.2-0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L，Cef 400mg/L，Kana 100mg/L芽伸長篩選培養(yǎng)基由下列組分配制而成MS，ZT0.2mg/L，Cef100-200mg/L，Kana100mg/L；(b)對上述(b)所獲得的芽伸長時期的番茄轉(zhuǎn)化體進行生根誘導(dǎo)抗性篩選培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因番茄植株的再生；使用的培養(yǎng)基為生根選擇培養(yǎng)基MS(備注其中大量元素減半)，IAA0.2mg/l，Cef100mg/L，Kana 50-100mg/L。
(c)對上述(f)抗性篩選獲得的轉(zhuǎn)基因番茄再生植株經(jīng)過練苗、移栽、大田培育至自然生長開花結(jié)果。
在第十個方面，獲得如權(quán)力要求1或2或3或5或6或7所限定的轉(zhuǎn)基因番茄植株親代和子代的高效穩(wěn)定表達外源目的基因的番茄品系，包含親代、子代的植株、種子、組織胚胎培養(yǎng)物，以及此轉(zhuǎn)基因番茄品系表達的重組外源目的蛋白或其抗原片段的用途，如用于制備動物或人的弓形蟲病診斷試劑或疫苗等。
在第十一個方面，本發(fā)明提供了從DNA、RNA、PROTEIN三個水平進行轉(zhuǎn)基因番茄篩選鑒定及子代分析的技術(shù)方案與操作流程。
(d)番茄基因組DNA的提??；(e)番茄總RNA的提??；(f)番茄可溶性總蛋白的提??；(g)對上述(e)所獲得的番茄基因組DNA以PCR擴增進行轉(zhuǎn)基因番茄外源插入序列的基因組整合分析，確認具有特異性的目的基因擴增帶；(h)對上述(f)所獲得的番茄總RNA以RT-PCR進行轉(zhuǎn)基因番茄外源插入目的疫苗分子在轉(zhuǎn)錄水平的表達分析，確認具有特異性的目的基因cDNA擴增帶；(i)對上述(g)所獲得的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，針對轉(zhuǎn)基因番茄表達外源疫苗蛋白的分子量大小，分別建立了小分子蛋白(20-50kDa)、(2.5-20kDa)區(qū)段的最佳電泳系統(tǒng)Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和Urea-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)；(j)對上述(j)電泳所獲得的蛋白質(zhì)Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠和Urea-Tricine聚丙烯酰胺凝膠，電轉(zhuǎn)移至NC膜或PVDF膜上，進行western blotting，鑒定所獲得蛋白免疫反應(yīng)性。確認轉(zhuǎn)基因番茄具有重組表達特定蛋白質(zhì)的存在；與已有技術(shù)相比有如下優(yōu)點植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中“轉(zhuǎn)基因沉默”以及外源目的蛋白表達量低、表達不穩(wěn)定仍是目前以植物作為新型生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白或疫苗所需要解決的問題。
本發(fā)明克隆獲得了我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5果實特異性啟動子E82.2和E81.1基因，分別用番茄果實特異性E82.2啟動子以及E35S-E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動疫苗分子并與NOS終止子構(gòu)成植物表達操縱子單元，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404獲得工程菌；通過優(yōu)化包括培養(yǎng)基等試劑配方、技術(shù)方案以及操作流程建立了番茄高頻再生體系、番茄基因轉(zhuǎn)化、抗性篩選、植株培育及其分子鑒定等完整的技術(shù)體系，獲得能高效穩(wěn)定表達的疫苗分子重組蛋白及其番茄轉(zhuǎn)化株系(部分植株目的蛋白的表達量可達番茄組織可溶性總蛋白10％以上，且經(jīng)過蛋白純化、Western blot、ELISA分析表明所獲重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性)。本發(fā)明構(gòu)建了可用于外源疫苗分子及藥用蛋白生產(chǎn)的番茄高效穩(wěn)定表達體系技術(shù)平臺，為深入研發(fā)番茄口服疫苗及其藥用蛋白提供了良好的技術(shù)平臺。


圖1番茄基因組DNA提取和番茄果實特異性E81.1啟動子PCR擴增結(jié)果1 番茄基因組DNA2，3 番茄果實特異性E81.1核心啟動子區(qū)PCR擴增片段4 E81.1PCR產(chǎn)物純化片段5DNA標準分子量圖2番茄果實特異性E82.2啟動子基因PCR擴增結(jié)果1 DNA標準分子量2 番茄果實特異性E82.2啟動子全長PCR擴增片段3 番茄果實特異性E81.1核心啟動子區(qū)PCR擴增片段圖3番茄果實特異性E81.1啟動子基因重組質(zhì)粒酶切鑒定圖1 DNA標準分子量2 pGEM-T空載體ApaI單酶切3 E81.1PCR產(chǎn)物純化片段 4 pGEM-T-E81.1 XbaI單酶切5，6 pGEM-T-E81.1 HindIII+BamHI雙酶切圖4番茄果實特異性E82.2啟動子基因重組質(zhì)粒酶切鑒定圖1，2 E82.2PCR產(chǎn)物純化片段 3 pGEM-T空載體ApaI單酶切4 pGEM-T-E82.2 HindIII+BamHI雙酶切 5 DNA標準分子量圖5以植物組成型啟動子E35S驅(qū)動MAG與終止子NOS組成的操縱子單元構(gòu)建植物中間載體pB35MG及植物表達載體pC35MG的構(gòu)建示意6以E35S和番茄果實特異性E81.1啟動子雙啟動子驅(qū)動MAG與終止子NOS組成的操縱子單元構(gòu)建植物中間載體pB35E1MG及植物表達載體pC35E1MG的構(gòu)建示意7以番茄果實特異性E82.2啟動子驅(qū)動MAG與終止子NOS組成的操縱子單元構(gòu)建植物中間載體pBE2MG及植物表達載體pCE2MG的構(gòu)建示意8番茄子葉在ZB3培養(yǎng)基中獲得高效再生圖9抗性篩選下的轉(zhuǎn)基因番茄芽的誘導(dǎo)與伸長圖10、11抗性篩選轉(zhuǎn)基因番茄誘導(dǎo)生根圖12轉(zhuǎn)基因番茄生根練苗后營養(yǎng)土栽培圖13轉(zhuǎn)基因番茄大田栽種后開花圖14、15轉(zhuǎn)基因番茄大田栽種后結(jié)果圖16部分轉(zhuǎn)基因番茄植株中MAG的PCR擴增結(jié)果圖1，4 pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株2，6 pC35E1MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株3，5，7 pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株 8陽性質(zhì)粒對照9 陰性對照植株 M DNA標準分子量圖17部分轉(zhuǎn)基因番茄植株果實和葉片總RNA的提取結(jié)果圖1正常組胚對照植株 2.3轉(zhuǎn)基因植株果實 4轉(zhuǎn)基因植株葉片圖18部分轉(zhuǎn)基因番茄植株中MAG的RT-PCR擴增結(jié)果圖1，5pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株葉片 2，6pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株果實3，7pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株果實 4pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化番茄植株葉片8 陰性對照植株9陽性質(zhì)粒對照M DNA標準分子量圖19HRP標記的弓形蟲tSAG1單克隆抗體K7H3(HRP-K7H3)對部分弓形蟲MAG轉(zhuǎn)基因番茄植株果實蛋白的Western-blot識別結(jié)果圖1 76號(pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)2 98號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR-)3 28號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)4 122號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)5 79號(pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)6 102號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)7 46號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)8 106號(pCE2MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)9 72號(pC35MG/LBA4404轉(zhuǎn)化植株，PCR+、RT-PCR+)10 陰性對照植株 M Sigma低分子量標準蛋白圖20HRP標記的弓形蟲tSAG1單克隆抗體Y3A8(HRP-Y3A8)對部分弓形蟲tSAG1轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片蛋白的Western-blot識別結(jié)果圖
1 陰性對照植株葉片蛋白+HRP-Y3A82 p8pC35E1tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+陰性鼠血清3 p8pC35E1tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A84 p7pC35E1tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A85 p6pC35E1tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A86 p5pC35tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A87 p4pC35tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A88 p3pC35tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A89 p2pC35tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A810 p1pC35E1tSAG1/LBA4404轉(zhuǎn)化植株葉片蛋白+HRP-Y3A8M低分子量標準蛋白圖21弓形蟲tSAG1轉(zhuǎn)基因番茄蛋白的SDS-PAGE分析1 陰性對照植株 2 tSAG1轉(zhuǎn)基因植株 3 標準分子量蛋白圖22弓形蟲tSAG1轉(zhuǎn)基因番茄蛋白的Western-blot分析1 陰性對照植株 2 tSAG1轉(zhuǎn)基因植株 3 標準分子量蛋白圖23 E.coli及轉(zhuǎn)基因番茄表達的弓形蟲tSAG1重組蛋白及其純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析1，5，8 低分子量標準蛋白2 E.coli表達的弓形蟲tSAG1融合型重組蛋白純化產(chǎn)物3 E.coli表達的弓形蟲tSAG1融合型重組蛋白酶切去擔體蛋白的純化產(chǎn)物4 E.coli表達的弓形蟲tSAG1融合型重組蛋白酶切后的擔體蛋白純化產(chǎn)物6 番茄表達的弓形蟲tSAG1重組蛋白純化產(chǎn)物7 弓形蟲tSAG1轉(zhuǎn)基因番茄植株可溶性總蛋白圖24HRP標記的弓形蟲tSAG1單克隆抗體Y3A8(HRP-Y3A8)對E.coli及轉(zhuǎn)基因番茄表達的弓形蟲tSAG1重組蛋白及其純化產(chǎn)物的Western-blot識別圖1 E.coli表達的弓形蟲tSAG1融合型重組蛋白酶切去擔體蛋白的純化產(chǎn)物2 E.coli表達的弓形蟲tSAG1融合型重組蛋白酶切后的擔體蛋白純化產(chǎn)物3 番茄表達的弓形蟲tSAG1重組蛋白純化產(chǎn)物4 弓形蟲tSAG1轉(zhuǎn)基因番茄植株可溶性總蛋白圖25弓形蟲MAG轉(zhuǎn)基因番茄T1株基因組DNA的提取1，2 陰性對照植株3，4 pC35MG轉(zhuǎn)化番茄T1株5，6，7 pCE2M轉(zhuǎn)化番茄植株M DNA標準分子量圖26弓形蟲MAG轉(zhuǎn)基因番茄T1代植株的PCR分析1，2，3 pC35MG轉(zhuǎn)化番茄T1代植株4，5，6 pCE2MG轉(zhuǎn)化番茄T1代植株7 陰性對照植株 8 陽性質(zhì)粒對照 M DNA標準分子量具體實施方式
實施例一 E81.1-pGEM-T和E82.2-pGEM-T的構(gòu)建1 引物的設(shè)計P1、P3為5’端引物，P2為3’端引物。P1、P2用于擴增Zhongshu No.5番茄的E81.1序列；P3、P2用于擴增E81.1及其上游1.1kb序列即果實特異性E8啟動子全長2.2kb片段E82.2。P15’CCG AAG CTT TCT AGA AG G AAT TTC ACGAAA TCG 3’；引入HindIII和XbaI酶切位點。P25’GCC TCT AGA GGA TCC TCTTTT GCA CTG TGA ATG3’；引入BamHI和XbaI酶切位。P35’GGC AAG CTT CCCTAA TGA TAT TGT TCA C3’引入HindIII酶切位點。
2 PGR循環(huán)條件95℃，5min；95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃，8min。
3 PCR產(chǎn)物的鑒定與純化用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用凍融法從瓊脂糖凝膠中切膠純化回收目的DNA片段，見圖1，圖2。
4 重組載體的構(gòu)建與篩選、鑒定按Promega公司pGEM-T載體操作手冊，將番茄果實特異性E81.1和E82.2啟動子PCR純化產(chǎn)物克隆進pGEM-T載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，接種到含有Amp+LB平板上，挑取單菌落于Amp+LB液體培養(yǎng)基中37℃250rpm搖過夜，收菌提取質(zhì)粒；用XbaI單酶切鑒定E81.1-pGEM-T重組質(zhì)粒，用HindIII/BamHI雙酶切鑒定E81.1-pGEM-T和E82.2-pGEM-T重組質(zhì)粒；含有正確插入子的重組質(zhì)粒送公司進行序列測定，見圖3，圖4。
實施例二 植物表達操縱子單元及其中間載體與表達載體的構(gòu)建(一)以E35S+MAG+NOS構(gòu)成植物表達操縱子的中間載體pB35MG及植物表達載體pC35MG的構(gòu)建(參見構(gòu)建流程圖5)將pCRII-Topo-MAG質(zhì)粒中的MAG用BamHI單酶切連接方式亞克隆進pBAC55載體，構(gòu)建中間載體pB35MG，其以E35S驅(qū)動MAG，3’端為終止子NOS3’序列，組成E35S/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元。用酶切和測序進行克隆鑒定用BamHI酶切鑒定插入子，XhoI鑒定插入子正反向，HindIII鑒定E35S/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元；由上?；瞪镉邢薰就瓿蓀B35MG載體中E35S/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元的測序鑒定。再將鑒定后的pB35MG中E35S/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元通過HindIH單酶切連接方式亞克隆進pCAMBIA2300質(zhì)粒中，構(gòu)建用E35S啟動子驅(qū)動MAG的植物表達載體pC35MG。重組質(zhì)粒用酶切進行鑒定用HindHI鑒定插入子，SacI鑒定插入子的正反向。使用單酶切插入克隆法，對載體片段和插入目的基因片段的準備要求較高，目的片段行酶切、切膠純化后基本能滿足克隆的要求，載體片段則需要在酶切、切膠純化后用CIP酶進行去磷酸化處理，以盡可能減少在連接過程中載體出現(xiàn)的自身環(huán)化現(xiàn)象，方法如下CIP酶去磷酸化體系(總體積20μl)酶切切膠純化后的線性化載體10μl10×CIP buffer 2μl(NEB buffer 3)CIP酶 1μlDDW 7μl37℃水浴15min后，在加入CIP酶1μl，55℃水浴45min；滅活CIP酶，可在體系中加入1/10體積的0.5M EDTA(2μl)，65℃滅活1h℃或75℃滅活10min；再加入200μlpH8.0TE，混勻后加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提純化；取上清加入1/10體積3MNaAc(pH7.0)和2.5倍體積的無水乙醇，置-20℃沉淀至少30min；4℃離心12000rpm 15min，DNA沉淀用70％乙醇洗滌1-2次，干燥DNA，溶解DNA于10μl TE(pH8.0)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)以E35S-E81.1雙啟動子+MAG+NOS組成植物表達操縱子單元的中間載體pB35E1MG及植物表達載體pC35E1MG的構(gòu)建(參見構(gòu)建流程圖6)用XbaI單酶切連接法將E81.1-pGEM-T載體中的E81.1啟動子亞克隆進pB35MG載體中，構(gòu)建含E35S和E81.1雙啟動子驅(qū)動下的MAG中間載體pB35E1MG。用酶切法進行重組質(zhì)粒的鑒定XbaI鑒定插入子的大小，BamHI鑒定插入子的正反向。再將證實后的pB35E1MG質(zhì)粒中E35SE81.1/MAG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元通過HindIII單酶切連接方式亞克隆進pCAMBIA2300質(zhì)粒中，構(gòu)建用E35S和E81.1雙啟動子驅(qū)動MAG的植物表達載體pC35E1MG。重組質(zhì)粒用酶切進行鑒定用HindIII鑒定插入子，KpnI鑒定插入子的正反向。
(三)以E82.2啟動子+MAG+NOS組成的植物表達操縱子單元的中間載體pBE2MG及植物表達載體pCE2MG的構(gòu)建(參見構(gòu)建流程圖7)
采用平粘端定向克隆法用E82.2-pGEM-T載體中的番茄果實特異性啟動子E82.2置換下pB35MG載體中的E35S啟動子，構(gòu)建以E82.2啟動子驅(qū)動下的MAG基因中間載體pBE2MG。
1 E82.2插入子片段的準備E82.2-pGEM-T，先用ApaI酶切后，1％瓊脂糖電泳切膠純化；用T4 DNA聚合酶補平粘端后，酚、氯仿抽提純化；再用SpeI酶切后，切膠純化E82.2插入小片段。
2 pB35MG載體片段的準備用ApaI酶切后，1％瓊脂糖電泳切膠純化；用T4 DNA聚合酶補平粘端后，酚、氯仿抽提純化；再用SpeI酶切后，切膠純化pB35MG載體片段。
3 T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂于LB Amp+平板，倒置培養(yǎng)12-18hs；挑取單菌落至2ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中250rpm、37℃搖6-10hs。
4 提取質(zhì)粒，電泳鑒定，滯后者疑為重組質(zhì)粒，用NcoI/SpeI雙酶切進一步進行酶切鑒定。
5 將鑒定后的pBE2MG重組質(zhì)粒中E82.2/TGMG/NOS3’結(jié)構(gòu)單元通過HindIII單酶切連接方式亞克隆進pCAMBIA2300質(zhì)粒中，構(gòu)建用E82.2啟動子驅(qū)動TGMG基因的植物雙元載體pCE82MG。重組質(zhì)粒用酶切進行鑒定用HindIII鑒定插入子，KpnI鑒定插入子的正反向。
實施例三 番茄高頻再生體系的建立(一)番茄外植體的選擇上述萌發(fā)8-12天的番茄幼苗，取其子葉和下胚軸(不帶頂芽)，子葉和葉盤下表面朝下，切割處傷口緊貼于再生培養(yǎng)基。
(二)激素的選擇細胞分裂素選擇ZT、6-BA；生長素選擇IAA。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS1，激素選擇不同，以下三種激素配方均可獲得高頻再生再生培養(yǎng)基1ZT0.2-0.5mg/L，IAA 0.1mg/L再生培養(yǎng)基2ZT0.2-0.5mg/L再生培養(yǎng)基3ZT0.2-0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L(三)培養(yǎng)條件置人工氣候箱中，光照條件同無菌苗的培養(yǎng)，溫度條件23℃-25℃，2周繼代培養(yǎng)一次。
實施例四 番茄轉(zhuǎn)化、篩選、再生、培育體系的建立
(一)農(nóng)桿菌浸染懸浮液的準備分別挑取攜帶有三種啟動子驅(qū)動下的弓形蟲MAG和tSAG1的工程菌株pC35MG/LBA4404、pC35E1MG/LBA4404、pCE2MG/LBA4404、pC35tSAG1/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404、pCE2tSAG1/LBA4404單菌落，接種于3-5ml YEB(Str+50mg/L kana+50mg/L)液體培養(yǎng)基中，于28℃200rpm振搖過夜，次日按1∶20轉(zhuǎn)接至新鮮YEB(Str+Kana+)液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm振搖約5hs至菌液OD600為0.6-0.8。將培養(yǎng)物于4000rpm離心10min，棄上清，菌體用液體MS0稀釋10-20倍，可根據(jù)情況在此時加入AS至終濃度100μM，再置于28℃ 200rpm振搖2h，所獲菌液即為工程菌浸染懸浮液，可作為番茄外植體的浸染轉(zhuǎn)化。
(二)外植體的預(yù)培養(yǎng)、浸染和共培養(yǎng)1預(yù)培養(yǎng)切取8-10天苗齡的番茄子葉和下胚軸，分別置于再生培養(yǎng)基1或2或3中，23℃-25℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)2天。
2浸染與共培養(yǎng)取經(jīng)過2天預(yù)培養(yǎng)的番茄子葉和下胚軸，分別置于上述制備好的含pC35M、pC35E1M、pCE2M、pC35tSAG1、pC35E1tSAG1、pCE2tSAG1的農(nóng)桿菌浸染懸浮液中，浸染20-30min，其間搖動幾次；再用無菌濾紙吸去多余的農(nóng)桿菌液；取一張無菌濾紙鋪于培養(yǎng)基(同預(yù)培養(yǎng))上，將浸染好的番茄子葉與下胚軸置于其上，于23℃-25℃暗培養(yǎng)2天。
(三)篩選培養(yǎng)與植株再生1 番茄轉(zhuǎn)化體芽誘導(dǎo)與芽伸長時期的篩選培養(yǎng)芽誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基MS，ZT0.2-0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L，Cef 400mg/L，Kana 100mg/L芽伸長篩選培養(yǎng)基MS，ZT0.2mg/L，Cef100mg/L，Kana100mg/L。
將浸染農(nóng)桿菌后共培養(yǎng)2天的番茄子葉與下胚軸，用滅菌DDW清洗3次以去除外植體表面的農(nóng)桿菌，在滅菌濾紙上吸干外植體上的水份，轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基中，23℃±1℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)，2周繼代一次，觀察芽誘導(dǎo)生長情況，出芽的外植體轉(zhuǎn)移至芽伸長選擇培養(yǎng)基中，長愈傷的外植體繼續(xù)用原培養(yǎng)基繼代持續(xù)轉(zhuǎn)化體的芽誘導(dǎo)。同時設(shè)立番茄外植體正常再生的正對照，以及未轉(zhuǎn)化的外植體在抗性篩選培養(yǎng)基上生長的負對照。
2 番茄轉(zhuǎn)化體的生根篩選培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因植株的再生生根選擇培養(yǎng)基MS(備注其中大量元素減半)，IAA0.2mg/l，Cef100mg/L，Kana 50-100mg/L。
切取在番茄芽伸長選擇培養(yǎng)基上生長至3cm以上的小苗，插入生根選擇培養(yǎng)基中，于25-28℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)，觀察根的再生與苗的生長狀況。待轉(zhuǎn)基因苗生根后長至近培養(yǎng)瓶高時，可開蓋，繼續(xù)在光照人工氣候箱中練苗2-3天，移栽至營養(yǎng)土盆中，進行根的進一步發(fā)育，最后移栽至土壤中，自然生長開花結(jié)果。
實施例五、PCR對轉(zhuǎn)基因番茄植株DNA水平的檢測(一)轉(zhuǎn)基因番茄植株基因組DNA的提取1 采集大田栽種的轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片或果實；2 取3％CTAB提取液，加3％2-ME，置60-65℃水浴中預(yù)熱；3 用液氮研磨新鮮的果實或去掉葉柄的幼嫩葉片，然后迅速加入預(yù)熱的3％CTAB提取液600μl/管，搖勻，置60-65℃水浴45-60min，期間，每10min搖動一次；加入等體積冷的氯仿∶異戊醇(24∶1)，完全混勻后，4℃15000rpm離心10min；4 取上清，重復(fù)4一次；5 取上清，加入1倍體積冷的異丙醇，室溫沉淀DNA，可用tip頭將DNA挑出，或用10000rpm離心30sec，DNA沉淀再用70％乙醇洗滌2次，干燥DNA后，加入0.5mlTE重懸DNA，加入1μl/管10mg/ml的RNAase，混勻后于37℃消化30min-1h；6 用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次；7 加入等體積冷的異丙醇，室溫沉淀DNA，10000rpm離心30sec；8 干燥DNA，重懸于0.4mlTE，加入1/103M NaAc(pH5.0)和2-2.5倍體積的無水乙醇，于-20℃沉淀20min，4℃ 14000rpm離心15min；9 DNA沉淀用70％乙醇洗滌2次，干燥DNA后，加入適量TE重懸DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)PCR擴增轉(zhuǎn)基因番茄植株中的目的基因以三種啟動子驅(qū)動下的弓形蟲MAG轉(zhuǎn)基因植株葉片或果實提取的DNA為檢測模板，正常再生未轉(zhuǎn)基因番茄植株葉片或果實提取的DNA為陰性對照模板，弓形蟲MAG植物表達質(zhì)粒為陽性對照模板。
引物擴增MAG編碼區(qū)360bp DNA片段P15’CTC TCG AGG CAA TGG GAA ACA AC 3’；P25’ATG GAT CCT CAC TCC AGG TGG G 3’；PCR擴增條件95℃預(yù)變性5min；95℃1min，56℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃充分延伸8min。
(三)瓊脂糖凝膠電泳鑒定用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的基因組DNA的質(zhì)量，用2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物。
實施例六、RT-PCR對轉(zhuǎn)基因番茄植株轉(zhuǎn)錄水平RNA的鑒定(一)轉(zhuǎn)基因番茄植株總RNA的提取1 取適量(200mg-500mg)新鮮植物葉片或果實，在液氮下充分研磨后，加入600μl/管Trizol試劑，充分混勻；2 室溫放置5min；3 加入200μl/管氯仿，用力振蕩1min，冰浴20min；4 4℃12000rpm離心20min；5 取上清至新的1.5mlEp管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇混勻后，置-80℃沉淀過夜；6 4℃12000rpm離心20min，去上清；7 RNA沉淀用70％乙醇洗滌2次，在超凈臺中風干；8 加入滅菌無RNAase DDW131.5μl/管，待RNA完全溶解，加入無RNAase的DNAase I于37℃水浴消化30min-1h，其酶切體系如下10×DNAase I buffer 15μlDNAase I3μlRibonuclease inhibitor 0.5μl加原溶解RNA的滅菌無RNAase水131.5μl，總體積150μl/管9 加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，上清移至新的1.5mlEp管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后，置-80℃沉淀1h；10 4℃12000rpm離心20min，去上清；11 RNA沉淀用70％乙醇洗滌2次，在超凈臺中風干；加入適量滅菌無RNAase DDW(20-50μl)，Ribonuclease inhibitor 0.5μl/管，溶解后，取少量用Bio-Rad Smart SpecTM3000型核酸蛋白定量分析儀進行RNA含量的測定；
12 1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的轉(zhuǎn)基因番茄植株RNA的質(zhì)量，注意用0.1％DEPC水配制電泳緩沖液(TBE)及用其配制瓊脂糖凝膠，所用電泳槽、試劑瓶等均用0.1％DEPC水清洗處理。
(二)RT-PCR對轉(zhuǎn)基因番茄植株目的基因RNA水平的檢測1 取提取的植株果實或葉片RNA 2μg，加入Oligo(dT)引物50pmol，DEPC H2O補平體積至13.5μl，置70℃水浴5min，冰浴5min；2 再加入AMV逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(終體積25μl)AMV 5×buffer 5μldNTP(10mM) 2.5μlRibonuclease inhibitor 0.5μl焦磷酸鈉(40mM) 2.5μlAMV1μl置于42℃反應(yīng)1h。
3 以逆轉(zhuǎn)錄獲得的植株果實和葉片cDNA為模板，PCR擴增目的基因，PCR反應(yīng)體系DDW19.5μl10×PCR buffer 2.5μldNTP(10mM) 0.5μl5’primer(20μM) 0.5μl3’primer(20μM) 0.5μlTag酶 0.5μlcDNA模板 1μlPCR反應(yīng)程序基本同前。
4 2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT-PCR擴增產(chǎn)物。
實施例七、轉(zhuǎn)基因番茄植株中目的基因的表達蛋白的鑒定與分析(一)植物總蛋白的提取采用蛋白提取液P buffer。
1 采集三種啟動子驅(qū)動弓形蟲MAG和tSAG1的轉(zhuǎn)基因番茄植株的果實和葉片，同時將正常再生的未轉(zhuǎn)基因植株的果實和葉片作為陰性植株對照，加入液氮在研缽中迅速研磨成粉；3 加入蛋白提取液P buffer，充分混勻，置4℃冷浸過夜；
4 4℃15000-18000rpm離心20min，取上清，用Bio-Rad Smart SpecTM3000型核酸蛋白定量分析儀進行蛋白含量的測定，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (二)Western-blot分析1 SDS-PAGE分析提取的轉(zhuǎn)基因番茄果實或葉片總蛋白，根據(jù)蛋白含量可選用加入5×或2×蛋白上樣buffer，采用使用Tris-Tricine、Urea-Tricine電泳緩沖系統(tǒng)，恒定電流30mA電泳7小時，Bio-rad電泳槽，銀染，黑馬凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析鑒定。
銀染基本流程取下SDS-PAGE膠，用DDW稍沖洗，置銀染固定液中固定2h，轉(zhuǎn)移至浸泡液中40-45min，DDW洗5min×3次，銀染液中避光染色40min，置顯色液中顯色，觀察蛋白條帶染色情況，及時用DDW終止顯色。
2 蛋白的半干轉(zhuǎn)移取下剛電泳結(jié)束的SDS-PAGE膠，用蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10-15min；同時裁切同樣大小的PVDF膜，先用甲醇浸透后，置蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡5-10min；從負極至正極方向按“厚濾紙-膠-膜-厚濾紙”的順序依次疊放，注意排盡氣泡，10V轉(zhuǎn)印20-25min；轉(zhuǎn)印后的PVDF膜，用麗春紅S染色以證實目的條帶的轉(zhuǎn)印效果，然后用甲醇將膜浸透后，置干凈濾紙上自然干透(室溫30min-1h)，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3 Western-blot鑒定(1)直接檢測法取出轉(zhuǎn)印的PVDF膜，裁切成條，用甲醇浸透DDW漂洗后，用0.3％Tween-20 37℃恒溫孵育箱封閉1-2h；棄去封閉液，直接加入HRP標記的rtSAG1單抗或弓形蟲速殖子免疫兔血清純化IgG，37℃孵育1h；用洗液洗滌5min×4次；DAB顯色液避光顯色5-20min，觀察反應(yīng)條帶情況，及時用DDW沖洗終止顯色。
(2)間接檢測法操作流程基本同直接檢測法，僅直接法中直接使用標記的特異性抗體，而間接法中一抗未標記，再加入標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗。間接法中一抗37℃孵育1.5-2.5h，洗滌5min×4次；二抗37℃孵育40min-1h，洗滌5min×4次。
番茄高~1序列表<110>(周曉紅，陳曉光)<120>(一種轉(zhuǎn)基因番茄高效穩(wěn)定表達體系)<140>(專利申請?zhí)?<141>(2006-03-9)<160>3<210>1<211>2191<212>DNA<213>中國中蔬5號番茄(Lycopersicon esculentum.Zhongshu No.5)<220>
<221>Promoter<222>(1)......(2191)TCCCTAATGA TATTGTTCAT GTAATTAAGT TTTGTGGAAG TGAGAGAGTC CAATTTTGAT 60AAGAAAAGAG TCAGAAAACG TAATATTTTA AAAGTCTAAA TCTTTCTACA AATAAGAGCA120AATTTATTTA TTTTTTAATC CAATAAATAT TAATGGAGGA CAAATTCAAT TCACTTTGGT180TGTAAAATAA ACTTAAACCA ATAACCAAAG AACTAATAAA TCCTGAAGTG GAATTATTAA240GGATAAATGT ACATAGACGA TGAAGAAATA ATAGGTTCGA TGAATTAATA ATAATTAAGG300ATGTTACAAT CATCATGTGC CAAGTATATA CACAATATTC TATGGGATTT ATAATTTCGT360TACTTCACTT AACTTTTGCG TAAATAAAAC GAATTATCTG ATATTTTATA ATAAAACAGT420TAATTAAGAA CCATCATTTT TAACAACATA GATATATTAT TTCTAATAGT TTAATGATAC480TTTTAAATCT TTTAAATTTT ATGTTTCTTT TAGAAAATAA AAATTCAAAA AATTAAATAT540ATTTACAAAA ACTACAATCA AACACAACTT CATATATTAA AAGCAAAATA TATTTTGAAA600ATTTCAAGTG TCCTAACAAA TAAGACAAGA GGAAAATGTA CGATGAGAGA CATAAAGAGA660ACTAATAATT GAGGAGTCCT ATAATATATA ATAAAGTTTA TTAGTAAACT TAATTATTAA720GGACTCCTAA AATATATGAT AGGAGAAAAT GAATGGTGAG AGATATTGGA AAACTTAATA780ATTAAGGATT TTAAAATATA TGGTAAAAGA TAGGCAAAGT ATCCATTATC CCCTTTTAAC840TTGAAGTCTA CTAGGCGCAT GTGAAAGTTG ATTTTTTGTC ACGTCATATA GCTATAACGT900AAAAAAAGAA AGTAAAATTT TTAATTTTTT TTAATATATG ACATATTTTA AACGAAATAT960AGGACAAAAT GTAAATGAAT AGTAAAGGAA ACAAAGATTA ATACTTACTT TGTAAGAATT 1020TAAGATAAAT TTAAAATTTA ATAGATCAAC TTTACGTCTA GAAAGACCCA TATCTAGAAG 1080GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCGAAA ATAACTTTTA AATAATGAAT TTTAAATTTT 1140AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT GTAGCATTTT ACCTAAATAT TTCAACTATT 1200TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA ACAATAGAAA GTCTTGTGCA GACATTTAAT 1260CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT CTGAAGATTT TCGGGTTTAG TCCACAAGTT 1320TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AATTTTAGGT GAGAAGGTTT GATATTTATC TTTTGTTAAA 1380TTAATTTATC TAGGTGACTA TTATTTATTT AAGTAGAAAT TCATATCATT ACTTTTGCCA 1440ACTTGTAGTC ATAATAGGAG TAGGTGTATA TGATGAAGGA ATAAACAAGT TCAGTGAAGT 1500GATTAAAATA AAATATAATT TAGGTGTACA TCAAATAAAA ACCTTAAAGT TTAGAAAGGC 1560ACCGAATAAT TTTGCATAGA AGATATTAGT AAATTTATAA AAATAAAAGA AATGTAGTTG 1620TCAAGTTGTC TTCTTTTTTT TGGATAAAAA TAGCAGTTGG CTTATGTCAT TCTTTTACAA 1680CCTCCATGCC ACTTGTCCAA TTATTGACAC TTAACTAATT AGTTTGATTC ATGTATGAAT 1740ACTAAATAAT TTTTTAGGAC TGACTCAAAT ATTTTTATAT TATCATAGTA ATATTTATCT 1800AATTTTTAGG ACCACTTATT ACTTAATAAT AAATTAACTA CAACTATATT ATTGTTGTGA 1860AACAACAACG TTTTGGTTGT TATGATGAAA CGTACACTAT ATCAGTATGA AAAATTCAAA 1920ACGATTAGTA TAAATTATAT TGAAAATTTG ATATTTTTCT ATTCTTAATC AGACGTATTG 1980GGTTTCATAT TTTAAAAAGG GACTAAACTT AGAAGAGAAG TTTGTTTGAA ACTACTTTTG 2040TCTCTTTCTT GTTCCCATTT CTCTCTTAGA TTTCAAAAAG TGAACTACTT TATCTCTTTC 2100TTTGTTCACA TTTTATTTTA TTCTATTATA AATATGGCAT CCTCATATTG AGATTTTTAG 2160AAATTATTCT AATCATTCAC AGTGCAAAAG A 2191<210>2<211>1198<212>DNA<213>中國中蔬5號番茄(Lycopersicon esculentum，Zhongshu No.5)<220>
<221>Promoter<222>(1)......(1198)CGACCTAGTG ATTCCGAAGC TTTCTAGAAG GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCAAAA 60ATAACTTTTA AATAATGAAT TTTAAATTTT AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT120GTAGCATTTT ACCTAAATAT TTCAACTATT TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA180ACAATAGAAA GTCTTGTGCA GACATTTAAT CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT240CTGAAGATTT TCGGGTTTAG TCCACAAGTT TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AAATTTTAGG300TGAGAAGGTT TGATATTTAT CTTTTGTTAA ATTAATTTAT CTAGGTGACT ATTATTTATT360TAAGTAGAAA TTCATATCAT TACTTTTGCC AACTTGTAGT CATAATAGGA GTAGGTGTAT420ATGATGAAGG AATAAACAAG TTCAGTGAAG TGATTAAAAT AAAATATAAT TTAGGTGTAC480ATCAAATAAA AACCTTAAAG TTTAGAAAGG CACCGAATAA TTTTGCATAG AAGATATTAG540
番茄高~1TAAATTTATA AAAATAAAAG AAATGTAGTT GTCAAGTTGT CTTCTTTTTT TTGGATAAAA600ATAGCAGTTG GCTTATGTCA TTCTTTTACA ACCTCCATGC CACTTGTCCA ATTGTTGACA660CTTAACTAAT TAGTTTGATT CATGTATGAA TACTAAATAA TTTTTTAGGA CTGACTCAAA720TATTTTTATA TTATCATAGT AATATTTATC TAATTTTTAG GACCACTTAT TACTAAATAA780TAAATTAACT ACTACTATAT TATTGTTGTG AAACAACAAC GTTTTGGTTG TTATGATGAA840ACGTACACTA TATCAGTATG AAAAATTCAA AACGATTAGT ATAAATTATA TTGAAAATTT900GATATTTTTC TATTCTTAAT CAGACGTATT GGGTTTCATA TTTTAAAAAG GGACTAAACT960TAGAAGAGAA GTTTGTTTGA AACTACTTTT GTCTCTTTCT TGTTCCCATT TCTCTCTTAG 1020ATTTCAAAAA GTGAACTACT TTATCTCTTT CTTTGTTCAC ATTTTATTTT ATTCTATTAT 1080AAATATGGCA TCCTCATATT GAGATTTTTA GAAATTATTC TAATCATTCA CAGTGCAAAA 1140GAGGATCCTC TAGAGGCAAT CCCGCGGCCA TGGCGGCCGG GAGCATGCGA CGTCGGGC 1198<210>3<211>1734<212>DNA<213>中國中蔬5號番茄(Lycopersicon esculentum，Zhongshu No.5)<220>
<221>Promoter<222>(1)......(1734)AAGCTTTGAG TGGCCGTAGA TTTGCAAAAG CAATGGCTAA CAGACACATA TTCTGCCAAA 60CCCCAAGAAG GATAATCACT TTTCTTAGAT AAAAAAGAAC AGACCAATAT ACAAACATCC120ACACTTCTGC AAACAATACA TCAGAACTAG GATTACGCCG ATTACGTGGC TTTAGCAGAC180TGTCCAAAAA TCTGTTTTGC AAAGCTCCAA TTGCTCCTTG GCGTTGAGCA CCGGCGAGCC240GGAGTTGCCG CCGGTGGTAT CCAGGTTGGT CAGGAAGTTG ACCGTCTGGG TCTTCAGCGC300CGGGTCGGCG GTGCTGCCGA AGTCACCCTT GGCAATCGCC GCCAGCAGCG GCTTGGGCGC360ATCGAACGGA TAGGCGTTGG TGTTCTTCTC GACGATGCCG GCCACGGTGG TCACCGGCGA420GTAGGTCACG CCATCGCGCG GGTGCAGCGC CTCCACCTTG CCGTAGCTGA TGCGCAGGGT480GCGGTTGGCA TCCGGGTACA CATCTCCACT GACGTAAGGG ATGACGCACA ATCCCACTAT540CCTTCGCAAG ACCCTTCCTC TATATAAGGA AGTTCATTTC ATTTGGAGAG AACACGGGGG600ACTCTAGAAG GAATTTCACG AAATCGGCCC TTATTCAAAA ATAACTTTTA AATAATGAAT660TTTAAATTTT AAGAAATAAT ATCCAATGAA TAAATGACAT GTAGCATTTT ACCTAAATAT720TTCAACTATT TTAATCCAAT ATTAATTTGT TTTATTCCCA ACAATAGAAA GTCTTGTGCA780GACATTTAAT CTGACTTTTC CAGTACTAAA TATTAATTTT CTGAAGATTT TCGGGTTTAG840TCCACAAGTT TTAGTGAGAA GTTTTGCTCA AAATTTTAGG TGAGAAGGTT TGATATTTAT900CTTTTGTTAA ATTAATTTAT CTAGGTGACT ATTATTTATT TAAGTAGAAA TTCATATCAT960TACTTTTGCC AACTTGTAGT CATAATAGGA GTAGGTGTAT ATGATGAAGG AATAAACAAG 1020TTCAGTGAAG TGATTAAAAT AAAATATAAT TTAGGTGTAC ATCAAATAAA AACCTTAAAG 1080TTTAGAAAGG CACCGAATAA TTTTGCATAG AAGATATTAG TAAATTTATA AAAATAAAAG 1140AAATGTAGTT GTCAAGTTGT CTTCTTTTTT TTGGATAAAA ATAGCAGTTG GCTTATGTCA 1200TTCTTTTACA ACCTCCATGC CACTTGTCCA ATTGTTGACA CTTAACTAAT TAGTTTGATT 1260CATGTATGAA TACTAAATAA TTTTTTAGGA CTGACTCAAA TATTTTTATA TTATCATAGT 1320AATATTTATC TAATTTTTAG GACCACTTAT TACTAAATAA TAAATTAACT ACTACTATAT 1380TATTGTTGTG AAACAACAAC GTTTTGGTTG TTATGATGAA ACGTACACTA TATCAGTATG 1440AAAAATTCAA AACGATTAGT ATAAATTATA TTGAAAATTT GATATTTTTC TATTCTTAAT 1500CAGACGTATT GGGTTTCATA TTTTAAAAAG GGACTAAACT TAGAAGAGAA GTTTGTTTGA 1560AACTACTTTT GTCTCTTTCT TGTTCCCATT TCTCTCTTAG ATTTCAAAAA GTGAACTACT 1620TTATCTCTTT CTTTGTTCAC ATTTTATTTT ATTCTATTAT AAATATGGCA TCCTCATATT 1680GAGATTTTTA GAAATTATTC TAATCATTCA CAGTGCAAAA GAGGATCCTC TAGA 173權(quán)利要求
1.一種我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5番茄果實特異性啟動子E82.2，具有SEQ ID NO1的基因序列。
2.一種我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5番茄果實特異性啟動子E81.1，具有SEQ ID NO2的基因序列。
3.一種我國優(yōu)良純種番茄Zhongshu No.5番茄果實特異性啟動子E81.1基因與植物組成型啟動子E35S基因構(gòu)成的E35S-E81.1復(fù)合式啟動子，具有SEQ IDNO3的基因序列。
4.一種如權(quán)利要求1或2所限定的啟動子的中間載體pGEM-T-E82.2和pGEM-T-E81.1。
5.一種如權(quán)利要求1或2或3所限定之啟動子或E35S啟動子驅(qū)動目的疫苗分子，以NOS為終止子構(gòu)成植物表達外源疫苗分子的操縱子單元，及其構(gòu)建的植物中間載體pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG、pB35tSAG1、pB35E1tSAG1、pBE2tSAG1。其中植物表達操縱子單元構(gòu)成如下pB35MG含操縱子單元E35S啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pB35E1MG含操縱子單元E35S-E81.1復(fù)合式啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pBE2MG含操縱子單元E82.2啟動子+疫苗分子MAG+NOS終止子pB35tSAG1含操縱子單元E35S啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子pB35E1tSAG1含操縱子單元E35S-E81.1復(fù)合式啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子pBE2tSAG1含操縱子單元E82.2啟動子+疫苗分子tSAG1+NOS終止子。
6.一種如權(quán)利要求1或2或3或5所限定之啟動子或植物表達外源疫苗分子的操縱子單元構(gòu)建的植物表達載體pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG、pC35tSAG1、pC35E1tSAG1、pCE2tSAG1。
7.一種如權(quán)力要求1或2或3或5或6所限定之啟動子或植物表達外源疫苗分子的操縱子單元構(gòu)建的植物表達載體的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株，即工程菌pC35MG/LBA4404、pC35E1M6/LBA4404、pCE2MG/LBA4404、pC35tSAG1/LBA4404、pC35E1tSAG1/LBA4404、pCE2tSAG1/LBA4404。
8.一種番茄高頻再生培養(yǎng)過程中所使用的培養(yǎng)基，再生培養(yǎng)基1MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，ZT0.2～0.5mg/L，IAA 0.1mg/L；或再生培養(yǎng)基2MS，ZT0.2～0.5mg/L；或再生培養(yǎng)基3MS，ZT0.2～0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L；培養(yǎng)條件為置人工光照氣候箱中，溫度條件23℃-25℃，2周繼代培養(yǎng)一次。
9.一種高效的番茄轉(zhuǎn)化方法及其所使用的培養(yǎng)基(a)植物表達工程菌浸染懸浮液制備時加入乙酰丁香酮(AS)至終濃度100μM，番茄外植體經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、浸染與共培養(yǎng)，使用上述再生培養(yǎng)基3。(b)對上述(a)所獲得的番茄轉(zhuǎn)化體進行芽誘導(dǎo)與芽伸長時期的抗性篩選培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基芽誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基由下列組分配制而成MS，ZT0.2-0.5mg/L，6-BA 0.5mg/L，IAA 0.1mg/L，Cef 400mg/L，Kana 100mg/L芽伸長篩選培養(yǎng)基由下列組分配制而成MS，ZT0.2mg/L，Cef100-200mg/L，Kana100mg/L；(c)對上述(b)所獲得的芽伸長時期的番茄轉(zhuǎn)化體進行生根誘導(dǎo)抗性篩選培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因番茄植株的再生，使用的培養(yǎng)基為生根選擇培養(yǎng)基MS(備注其中大量元素減半)，IAA0.2mg/l，Cef100mg/L，Kana 50-100mg/L。
10.獲得如權(quán)力要求1或2或3或5或6或7所限定的轉(zhuǎn)基因番茄植株親代和子代的高效穩(wěn)定表達外源目的基因的番茄品系，包含親代、子代的植株、種子、組織胚胎培養(yǎng)物。
11.獲得如權(quán)力要求1或2或3或5或6或7所限定的轉(zhuǎn)基因番茄植株親代和子代的高效穩(wěn)定表達的重組外源目的蛋白或其抗原片段的用途，用于制備動物或人的弓形蟲病診斷試劑或疫苗等。
全文摘要
本發(fā)明克隆獲得了我國優(yōu)良純種番茄ZhongshuNo.5果實特異性啟動子E82.2和E81.1基因，分別用番茄果實特異性E82.2啟動子以及E35S－E81.1復(fù)合式雙啟動子驅(qū)動疫苗分子并與NOS終止子構(gòu)成植物表達操縱子單元，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404獲得工程菌；通過優(yōu)化包括培養(yǎng)基等試劑配方、技術(shù)方案以及操作流程建立了番茄高頻再生體系、番茄基因轉(zhuǎn)化、抗性篩選、植株培育及其分子鑒定等完整的技術(shù)體系，獲得能高效穩(wěn)定表達的疫苗分子重組蛋白及其番茄轉(zhuǎn)化株系(部分植株目的蛋白的表達量可達番茄組織可溶性總蛋白10％以上，且經(jīng)過蛋白純化、Western blot、ELISA分析表明所獲重組蛋白具有良好的免疫學(xué)活性)。本發(fā)明構(gòu)建了可用于外源疫苗分子及藥用蛋白生產(chǎn)的番茄高效穩(wěn)定表達體系技術(shù)平臺，為深入研發(fā)番茄口服疫苗及其藥用蛋白提供了良好的技術(shù)平臺。
文檔編號C12N15/63GK1821407SQ20061003415
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日
發(fā)明者周曉紅, 陳曉光 申請人:周曉紅, 陳曉光