專利名稱：諾瓦克病毒和輪狀病毒多重rt－pcr檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
專利說明諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測(cè)方法及試劑盒 本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法和試劑盒，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)檢疫、質(zhì)量監(jiān)督等部門，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。諾瓦克病毒(norovirus)和輪狀病毒(rotavirus)是世界范圍內(nèi)病毒性胃腸炎的重要病因，近年來的研究表明，胃腸炎病毒可直接通過人接觸傳播或間接地通過被污染的水、食物等傳播，因此世界衛(wèi)生組織又將其命名為食源性胃腸炎病毒。食源性胃腸炎病毒的感染劑量非常低，10-100個(gè)病毒粒子即可引發(fā)感染。在離體條件下存活力很強(qiáng)，對(duì)各種理化因子有較強(qiáng)抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反復(fù)凍融、超聲波處理都不能使其失活。且這類病毒的序列變異較大，有多種血清型存在。根據(jù)VP7抗原特異性可將輪狀病毒分為14個(gè)G型，根據(jù)VP4抗原特異性又可分為18個(gè)P型，G型和P型組合后代表某一輪狀病毒的血清型；諾瓦克病毒已知有15個(gè)基因型，且這個(gè)數(shù)目還會(huì)不斷的增加。而在世界不同地區(qū)，不同的時(shí)間，食源性胃腸炎病毒的流行株存在很大的差異，胃腸炎病毒的感染常伴有混合感染的趨勢(shì)，而現(xiàn)今的檢測(cè)方法靈敏度不夠高，因此對(duì)于疾病的診斷和治療帶來了很大的困難。近年來，食源性胃腸炎病毒的流行在世界范圍內(nèi)有不斷上升的趨勢(shì)，且流行范圍廣，傳染性強(qiáng)，二次攻擊率高，常造成急性嚴(yán)重的嘔吐和腹瀉，雖然不同病毒感染的癥狀輕重不一，但一般患者都具有低燒、嘔吐、腹瀉、頭痛等嚴(yán)重的脫水樣胃腸炎的癥狀。人群對(duì)這幾種病毒普遍易感，兒童和老人最為嚴(yán)重，為胃腸炎病毒的危險(xiǎn)人群。胃腸炎病毒的流行有一定的季節(jié)性，但全年均可發(fā)生，可呈暴發(fā)流行，也可呈散發(fā)流行，因此致使對(duì)其不能進(jìn)行及時(shí)有效的防護(hù)。
腹瀉病毒歷來是威脅人類健康特別是嬰幼兒健康的重大傳染病，目前對(duì)食源性胃腸炎病毒的治療尚未有特效藥物。無論在發(fā)達(dá)國(guó)家或是發(fā)展中國(guó)家，由輪狀病毒引起的腹瀉均有較高的發(fā)病率，是嬰幼兒發(fā)病和致死的最主要病因，在我國(guó)，情況更加嚴(yán)重，由A型輪狀病毒引起的嬰幼兒腹瀉和由B型輪狀病毒引起的成人腹瀉都非常流行。據(jù)WHO1997年統(tǒng)計(jì)，全世界每年有14億輪狀病毒感染者，在發(fā)展中國(guó)家有87萬(wàn)人因此而死亡。在美國(guó)，96％的嚴(yán)重非細(xì)菌性胃腸炎由NLV引起，其中24％為食源性的；1996年4月到1997年3月，我國(guó)北京的首都兒科研究所，利用桿狀病毒表達(dá)的諾瓦克類病毒衣殼蛋白作抗原，對(duì)各年齡組的人群諾瓦克類病毒的IgG抗體進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人群中IgG抗體陽(yáng)性高達(dá)89％，其中嬰兒陽(yáng)性率很高，為99％，這一調(diào)查結(jié)果反映了諾瓦克類病毒的感染在人群十分普遍。
輪狀病毒、諾瓦克病毒是世界范圍內(nèi)通過食物傳播的重要食源性病毒。由于在患者或無癥狀的攜帶者的糞便中病毒被大量排放，常導(dǎo)致胃腸炎疾病的暴發(fā)流行。這些病毒既可通過糞口途徑傳播，又可通過食源性或水體途徑傳播。食品(尤其是貝類)和水體性的感染可導(dǎo)致地域性大范圍、大量人口的感染，因此對(duì)食品和水中病毒的檢測(cè)顯得尤為重要。迄今為止，由于高特異性和靈敏性，RT-PCR是檢測(cè)食源性病毒最為高效的方法。但是常規(guī)的PCR都是單一地?cái)U(kuò)增，即每個(gè)反應(yīng)只能擴(kuò)增一個(gè)模板，在實(shí)際應(yīng)用中很難處理高通量的樣品，而且費(fèi)時(shí)耗力、成本較大。為了克服這些缺點(diǎn)，提高PCR檢測(cè)法的能力，Chamberlain等人在1988年首次建立了多重PCR技術(shù)(m-PCR)。m-PCR是指在同一個(gè)反應(yīng)體系中，加入多對(duì)特異性引物，如果存在與各引物對(duì)特異性互補(bǔ)的模板，即可同時(shí)在同一反應(yīng)管中擴(kuò)增出一條以上的目的DNA片段，實(shí)現(xiàn)了一次性檢測(cè)多個(gè)模板的目的。多重PCR已成功應(yīng)用于細(xì)菌、病毒的檢測(cè)。但尚未見有從環(huán)境樣本如水、食品等樣品中直接進(jìn)行食源性諾瓦克病毒和輪狀病毒多重PCR檢測(cè)研究的報(bào)告。
隨著環(huán)境的惡化，近年來，各種新型病毒相繼不斷出現(xiàn)和肆虐，SARS和禽流感的暴發(fā)流行，給人類的生活和健康帶來了極大的危害，也給國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展帶來極大的負(fù)面影響。因此，在現(xiàn)有檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，發(fā)展快速有效的胃腸炎病毒診斷和檢測(cè)方法及研制相關(guān)試劑盒投入實(shí)際應(yīng)用，對(duì)保障食品安全提高公共衛(wèi)生水平，未雨綢繆保障人類健康具有重大意義。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中的不足之處，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的特異性強(qiáng)、靈敏度高的多重RT-PCR檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上研制出同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，適用于處理大通量的樣品，可以推廣應(yīng)用到環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生領(lǐng)域、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。
本發(fā)明以輪狀病毒VP7基因的高保守區(qū)段設(shè)計(jì)各血清型通用的引物，堿基序列分別為上游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；下游引物5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；以諾瓦克病毒RNA多聚酶高保守區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)諾瓦克病毒GI、GII型的通用引物，堿基序列分別為上游引物5’-GAT TAC TCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；下游引物5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’本發(fā)明的目的具體可按如下方案來實(shí)現(xiàn)1.提取病毒核酸(1)取一定量的樣品，加900ul Trizol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；(2)加入200ul氯仿，用力振搖15S，再靜置2～3min；(3)4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；(4)加入500ul異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；(5)4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；(6)加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；(7)4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；(8)充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。
2.PCR擴(kuò)增將反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)的所需試劑一次性加入反應(yīng)管內(nèi)，兩次反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)完成，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程無須開蓋。
多重PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1uL、2mmol/LdNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L輪狀病毒引物各1μL、0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒引物各1μL、1.5U TaqE 1.5uL、25mmol/L MgCl22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
擴(kuò)增條件采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個(gè)循環(huán)，10個(gè)循環(huán)后退火溫度降至為50℃進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。
3.電泳、PCR產(chǎn)物序列測(cè)定取擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進(jìn)行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。
4.結(jié)果分析4.1多重RT-PCR特異性諾瓦克病毒和輪狀病毒在多重?cái)U(kuò)增中均得到了清晰特異的預(yù)期擴(kuò)增條帶，與100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，輪狀病毒的預(yù)期條帶為392bp，諾瓦克病毒的預(yù)期條帶為319bp。以混合模板單引物、單模板混合引物、混合模板混合引物三種反應(yīng)模式驗(yàn)證了本發(fā)明所涉及引物的特異性，三種模式的擴(kuò)增均有特異的預(yù)期帶，而引物之間及引物與模板之間沒有交叉反應(yīng)發(fā)生，每一個(gè)RT-PCR反應(yīng)都產(chǎn)生了清晰的大小為318bp和392bp的條帶。陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，見附

圖1。
4.2多重RT-PCR靈敏度將經(jīng)10倍梯度系列稀釋的病毒核酸進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，輪狀病毒可檢測(cè)到的最高靈敏度為50pg，諾瓦克病毒可檢測(cè)到的最高靈敏度為100pg，見附圖2。
本發(fā)明的同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒由以下試劑構(gòu)成輪狀病毒上游引物、輪狀病毒下游引物、諾瓦克病毒上游引物、諾瓦克病毒下游引物、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×緩沖液、DEPC水組成。一次檢測(cè)所用的組分量為輪狀病毒上游引物1uL；輪狀病毒下游引物1uL；諾瓦克病毒上游引物1uL；諾瓦克病毒下游引物1uL；MLV反轉(zhuǎn)錄酶1uL；Rnasin 0.5uL；TaqE 1.5uL；2mmol/L dNTP 2.5uL；25mmol/L MgCl22.5uL；10×緩沖液2.5uL；DEPC水補(bǔ)足剩余體積至25uL。圖1多重RT-PCR特異性分析。M100bpDNA分子標(biāo)準(zhǔn)；N陰性對(duì)照；1-2諾瓦克病毒(319bp)；3-4輪狀病毒(392bp)；5諾瓦克病毒和輪狀病毒。
圖2多重RT-PCR靈敏度分析。M100bpDNA分子標(biāo)準(zhǔn)；N陰性對(duì)照；1-6諾瓦克病毒(319bp)和輪狀病毒(392bp)的多重PCR靈敏度檢測(cè)，所對(duì)應(yīng)的核酸量依次為10ng，5ng，1ng，100pg，50pg，10pg。
圖3多重RT-PCR檢測(cè)貝類樣本結(jié)果。M100bpDNA分子標(biāo)準(zhǔn)；N陰性對(duì)照；1-5在貝類樣本中100pg的諾瓦克病毒(319bp)和輪狀病毒(392bp)核酸的多重?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施例1多重RT-PCR檢測(cè)方法用于同時(shí)檢測(cè)貝類樣品中輪狀病毒和諾瓦克病毒(1)病毒的生物富集從本地的水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買貝類，將其放養(yǎng)于一個(gè)盛有海水的容器中，然后投放諾瓦克病毒和輪狀病毒樣本于容器中，模擬自然水體的環(huán)境，使貝類自然富集。同時(shí)，以同樣的條件(不投毒)設(shè)立陰性對(duì)照。每隔8h換水及重新投毒一次，整個(gè)生物富集時(shí)間為24h。
(2)貝類中病毒的活化和濃縮將上面經(jīng)過生物富集的貝類，五只貝為一個(gè)樣，剝殼，取其胃和消化道1.5g，然后轉(zhuǎn)入50ml的Falcon管中，加入15ml冷的經(jīng)滅菌的0.05mol/L甘氨酸～0.14mol/L氯化鈉(pH7.5)，然后用Waring blender在冰上高速勻漿。為了防止交叉污染，應(yīng)用70％的酒精對(duì)Waring blender消毒，并在每個(gè)樣品勻漿后用Bursen beuner加熱1min。具體的過程如下(a)4℃，5000g，離心20min，收集上清，4℃存放；(b)把沉淀重新懸浮于15ml，pH7.5的0.5mol/L的蘇氨酸-0.14mol/L的氯化鈉中，渦旋60s；(c)4℃，5000g，離心20in。將兩次上清液混合，置于另一Falcon管中，棄去沉淀；(d)向上清液中加入15mlPEG6000(120g/L，即PEG6000，0.3mol/L的氯化鈉)，在4℃下放置2h；(e)8000g，4℃，離心30min，棄上清。將沉淀重新懸浮于15ml的PBS中(pH7.5)，再加入15ml的氯仿，渦旋60s；(f)4℃，2000g離心30min，取上清；(g)再加7.5ml 120g/L的PEG，4℃下放置兩小時(shí)；(h)4℃，14000g，離心15min，取上清；(i)PEG沉淀小球再用1ml，6mol/L的異硫氰酸胍溶液再懸浮，室溫放置10min；(j)4℃，12000g離心10min，取上清，用于RNA抽提。
(3)RNA抽提用美國(guó)生命技術(shù)公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒，抽提貝類濃縮物中的病毒RNA。取200～300ul樣品，加900ul Trizol試劑，用移液器反復(fù)混合均勻，離心15min，棄去上層液體后加入500ul異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。在分光光度計(jì)上測(cè)定所提取的RNA濃度和純度。
(4)多重RT-PCR檢測(cè)多重PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液2.5uL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶1uL、2mmol/L dNTP 2.5uL、0.3-0.5μmol/L輪狀病毒上下游引物各1uL、0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒上下游引物各1uL、1.5U TaqE1.5uL、25mmol/L MgCL22.5uL、模板2.5μL，加DEPC水至25μL。
擴(kuò)增條件采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個(gè)循環(huán)，10個(gè)循環(huán)后退火溫度降至為50℃進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。
(5)電泳、PCR產(chǎn)物序列測(cè)定取擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進(jìn)行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mLEB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海博亞生物公司完成。
(6)貝類中諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與100bp標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照，輪狀病毒的擴(kuò)增條帶為392bp，諾瓦克病毒的擴(kuò)增條帶為319bp。電泳結(jié)果如圖3，在1.5g貝類組織中，諾瓦克病毒和輪狀病毒檢測(cè)的核酸最高靈敏度均達(dá)到了100pg。
實(shí)施例2一種同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒多重RT-PCR試劑盒該試劑盒由以下試劑組成輪狀病毒上游引物50uL、輪狀病毒下游引物50uL、諾瓦克病毒上游引物50uL、諾瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/L dNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×緩沖液2mL、DEPC水2mL。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測(cè)方法，主要包括以下步驟(1)提取病毒核酸a.取一定量的樣品，加900uL Trizol試劑，用移液器反復(fù)混勻幾次后靜置5min；b.加入200ul氯仿，用力振搖15S，再靜置2～3min；c.4℃，12000g，離心15min，棄去上層液體；d.加入500uL異丙醇，充分混勻，室溫放置10min；e.4℃，12000g，離心10min，再次棄去上清；f.加入75％的乙醇，振搖，充分洗滌沉淀；g.4℃，7500g，離心5min，小心棄去乙醇；h.充分干燥后，將RNA沉淀懸浮于適量的無RNA酶的水中。(2)PCR擴(kuò)增多重PCR反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液2.5μL、20U Rnasin 0.5uL、200U MLV 1μL，2mmol/L dNTP 2.5μL，0.3-0.5μmol/L輪狀病毒上游引物和下游引物各1μL，0.3-0.5μmol/L諾瓦克病毒上游引物和下游引物各1μL，1.5U TaqE1.5μL，25mmol/L MgCL22.5μL，模板2.5μL，加DEPC水至25μL。將反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)的所需試劑一次性加入反應(yīng)管內(nèi)，兩次反應(yīng)在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)完成，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程無須開蓋。擴(kuò)增條件采用降落PCR進(jìn)行擴(kuò)增，條件為變性94℃ 5min，94℃ 40S，55℃-50℃ 1min，72℃ 40S，退火溫度每降低1℃2個(gè)循環(huán)，10個(gè)循環(huán)后退火溫度降至為50℃進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。(3)電泳、PCR產(chǎn)物序列測(cè)定取擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，制備1.4％的瓊脂糖凝膠直接進(jìn)行電泳，以Gold view染料替代0.5μg/mL EB，凝膠成像分析系統(tǒng)UV I觀察結(jié)果。(4)結(jié)果分析如果出現(xiàn)392bp擴(kuò)增條帶，證明該樣品存在輪狀病毒；如果出現(xiàn)319bp擴(kuò)增條帶，則證明該樣品存在諾瓦克病毒。
2.權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的輪狀病毒上游引物、輪狀病毒下游引物、諾瓦克病毒上游引物、諾瓦克病毒下游引物分別為5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT CCT GTT GGC CAT CC-3’；5’-GAT TACTCC AAG TGG GAC TCC AC-3’；5’-GAC AAT GTA ATC ATC ACC ATA-3’。
3.一種權(quán)利要求1所述的同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的試劑盒，由以下試劑構(gòu)成0.3～0.5μmol/L輪狀病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L輪狀病毒下游引物、0.3～0.5μmol/L諾瓦克病毒上游引物、0.3～0.5μmol/L諾瓦克病毒下游引物、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶、20U Rnasin、1.5U TaqE、引物、2mmol/L dNTP、25mmol/L MgCl2、10×緩沖液、DEPC水組成。
4.權(quán)利要求3所述的同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的檢測(cè)試劑盒由以下試劑組成輪狀病毒上游引物50uL、輪狀病毒下游引物50uL、諾瓦克病毒上游引物50uL、諾瓦克病毒下游引物50uL、200U MLV反轉(zhuǎn)錄酶45uL、20U Rnasin 25uL、1.5U TaqE 60uL、2mmol/LdNTP 150uL、25mmol/L MgCl2150uL、10×緩沖液2mL、DEPC水2mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒的多重RT－PCR檢測(cè)方法和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過提取樣品病毒核酸，經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定，結(jié)果如出現(xiàn)392bp擴(kuò)增條帶，證明該樣品存在輪狀病毒；如果出現(xiàn)318bp擴(kuò)增條帶，則證明該樣品存在諾瓦克病毒。本發(fā)明還相應(yīng)地建立了檢測(cè)試劑盒，可特異性強(qiáng)、靈敏、高效地同時(shí)檢測(cè)諾瓦克病毒和輪狀病毒，適用于處理大通量的樣品，可以推廣應(yīng)用到環(huán)境檢測(cè)、食品衛(wèi)生領(lǐng)域、商品檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1876839SQ200610032890
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月17日
發(fā)明者吳清平, 寇曉霞, 張菊梅, 郭偉鵬 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司