專利名稱：來源于抗-vp6駱駝科動物抗體的單體vhh結(jié)構(gòu)域、二聚體結(jié)構(gòu)域、免疫方法、輪狀病毒檢測 ...的制作方法
來源于抗-VP6駱駝科動物抗體的單體VHH結(jié)構(gòu)域、二聚體 結(jié)構(gòu)域、免疫方法、輪狀病毒檢測方法、組合物、用于輪狀病 毒感染的預(yù)防和治療方法本發(fā)明涉及來源于抗-VP6駱駝科動物抗體的單體VHH結(jié)構(gòu)域、二聚體結(jié)構(gòu)域、免 疫方法、輪狀病毒檢測方法、組合物、用于輪狀病毒感染的預(yù)防和治療方法。更具體地，本發(fā) 明涉及來源于駱駝科動物抗體的單體結(jié)構(gòu)域(VHH)，其中所述結(jié)構(gòu)域可以是SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2，SEQ IDNo. 3或SEQ ID No. 4中所示的任一種氨基酸序列，且其中所述結(jié)構(gòu)域 結(jié)合A組輪狀病毒的蛋白VP6。
背景技術(shù)：
A組輪狀病毒(RV)是在兒童和許多有經(jīng)濟(jì)學(xué)利益的動物物種(牛、豬馬、南美洲駱 駝等等)的幼崽中嚴(yán)重腹瀉的主要原因。作為公共健康問題，在發(fā)展中國家中，RV是第三 大最常見的與嚴(yán)重腹瀉有關(guān)的死亡的原因(每年200萬例死亡)。在另一個方面，在意欲用 于消費(fèi)的動物如小牛中的RV-引起的腹瀉導(dǎo)致與預(yù)防或治療相關(guān)的高成本。A組RV是由三聯(lián)蛋白衣殼組成的顆粒。外衣殼表面由蛋白VP4和VP7組成，該 兩種蛋白是高度可變的抗原；迄今為止，至少已經(jīng)記述了 27種VP4(P-型)變體和16種 VP7(G-型)變體。每種G-P型組合誘導(dǎo)與其他G-P型具有低交叉反應(yīng)性的中和抗體；因為 該原因，在疫苗中需要包括在目標(biāo)物種中循環(huán)的不同毒株。中間衣殼由三聚體蛋白VP6組成，其代表51%的病毒體質(zhì)量。取決于在蛋白VP6 中存在或不存在兩種不同的表位(由單克隆抗體mAb255/60和631/9識別)，A組RV毒株 另外分類為I，II，I+II和非I非II亞組(Sb)。人RV通常為Sb II，而動物RV主要為Sb I。蛋白VP6是高度免疫原性的；天然感染的人和動物發(fā)展針對VP6表位的強(qiáng)體液應(yīng)答。不 論上述亞組，VP6是所有A組RV中高度保守的蛋白(> 90%的氨基酸同一性)，并且共享 的共有抗原可以通過廣泛反應(yīng)性多克隆抗血清或單克隆抗體檢測。因此，VP6是大部分設(shè) 計用來檢測A組RV的免疫診斷測試中的靶抗原。針對該蛋白的抗體在體外不具有中和活 性。然而，在小鼠中，IgA單克隆抗體設(shè)法阻斷病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。目前，預(yù)防動物中RV-引起的腹瀉基于被動免疫，而在人類中使用主動免疫。在 動物中，將在腸胃外滅活的病毒疫苗應(yīng)用于妊娠的雌獸，以通過由初乳和乳汁傳遞母體抗 體而保護(hù)新生動物。該策略在防止嚴(yán)重腹瀉癥狀和減少感染的家畜的發(fā)病率(morbility) 和死亡率方面是高度有效的，但是這不能預(yù)防RV傳染，因為這不顯著減少由感染的動物分 泌的病毒數(shù)量(Parreno，V. C.等，Vet Immunol Immunopathol (獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理 學(xué))100:7-24，2004)。只有在腸腔內(nèi)持續(xù)存在高滴度的被動抗-RV抗體(天然產(chǎn)生的或人 工添加到乳汁中的)完全防止腹瀉，且顯著減少病毒分泌(Fernandez，F(xiàn).M.等，Vaccine (疫 苗)16 507-16,1998 ； Saif, L.J.等，Infectlmmun (傳染免疫學(xué))41 :1118_31，1983，和 Saif, L. J.等，Adv Exp Med Biol (實驗醫(yī)學(xué)和生物學(xué)進(jìn)展)216B 1815-23，987)。在兒童中，已經(jīng)批準(zhǔn)了兩種通過遺傳復(fù)性(reassociation)減毒的活病毒疫苗。 已經(jīng)證明兩種產(chǎn)品針對嚴(yán)重RV-引起的腹瀉的良好功效。然而，鑒于與先前人類中所用的 疫苗相關(guān)的內(nèi)填歷史(Murphy, T. V.等，J InfectDis (傳染病雜志)187 1309-13，2003)和最近在天然感染的兒童中發(fā)現(xiàn)RV病毒血癥(Ray，P.等，J Infect Dis (傳染病雜志)194 588-93，2006，和 Blutt, S. E.等，Lancet362 1445-9，2003)，所述疫苗的無害性已經(jīng)引起懷 疑，特別是在早熟的(premature)、免疫抑制的和營養(yǎng)不良的兒童中。因此，對于RV-引起的 腹瀉的預(yù)防和治療需要備選的補(bǔ)充策略。被動免疫策略，如哺乳，施用由牛初乳或蛋類純化的抗-RV抗體(人和?？?RV IgG和雞蛋蛋黃IgY)顯示出減少人和動物中的腹瀉疾病。但是以低成本方式且具有可重現(xiàn) 的特性生產(chǎn)大量抗體的可能性很低。因此，需要生產(chǎn)設(shè)計用于動物和人類中的被動抗-RV 免疫的抗體，特別是可以以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的抗體，所述抗體不引起免疫學(xué)反應(yīng)，所述抗體充 分小足以有效到達(dá)保守的內(nèi)在蛋白的表位，且所述抗體能夠識別和抑制來自不同基因型的 毒株的復(fù)制(多反應(yīng)性的)。駱駝科動物抗體重鏈的VHH結(jié)構(gòu)域，具有15kDa的重量，是具有完全的抗原-結(jié)合 能力的最小的已知天然結(jié)構(gòu)域，其對于產(chǎn)生關(guān)于具有天然抗原識別能力的單鏈片段的編碼 DNA文庫是理想的。此外，免疫美洲駝(llamas)的策略可以用來使VHH文庫富含針對目的 抗原的那些。由于其特別的特性，來源于美洲駝抗體重鏈的VHH結(jié)構(gòu)域是用于開發(fā)診斷試 劑和設(shè)計用于預(yù)防或治療RV-引起的腹瀉的產(chǎn)品的非常通用的工具。例如，在酵母中產(chǎn)生 的針對G3G-型RV毒株的VHH，最近已經(jīng)報道在體外表現(xiàn)出中和活性，且純化的VHH能夠減 少泌乳小鼠中的RV-引起的腹瀉的發(fā)生和持續(xù)時間(Pant，N.等，J Infect Dis(傳染病 雜志)194 1580-8，2006，和 van der Vaart J. M.等，Vaccine (疫苗)，5 月 8 日，24 (19) 4130-7,2006)。然而，這些作者尚不能鑒定獲得的VHH針對何種病毒蛋白，且他們假定它們 可能針對外在蛋白的構(gòu)象表位。專利文獻(xiàn)W0 2006/056306公開了 VHH結(jié)構(gòu)域或其片段的生產(chǎn)和作為關(guān)于由致腸 病微生物如RV產(chǎn)生的傳染病的治療的應(yīng)用。其表明了所述VHH的生產(chǎn)或其在特定位點(diǎn)釋放 系統(tǒng)中的應(yīng)用。例如，其公開了特定的VHH在胃腸系統(tǒng)中通過包封在藻酸鹽中的釋放。此 外，作為一種釋放方法，其提議使用轉(zhuǎn)基因益生菌(probiotic)微生物，其釋放特定的VHH 抗體且其中所述微生物可以在人腸道中集群。其提議使用由益生菌微生物包封或表達(dá)的 VHH抗體制備藥物或食品的不同方法。所生產(chǎn)的VHH不與VP6結(jié)合，應(yīng)該不是中和性的，且 還不被自身利用，但是在受控釋放系統(tǒng)內(nèi)。Muyldermans Serge的專利文獻(xiàn)US 20050054001，公開重鏈抗體，重鏈抗體的功能 結(jié)構(gòu)域，功能VH結(jié)構(gòu)域或其片段，其包括特定修飾的或突變的氨基酸序列的。其沒有公開 與結(jié)合RV VP6的VHH結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的序列。專利文獻(xiàn)W0 00/65057公開了包括單可變結(jié)構(gòu)域的單價蛋白，其結(jié)合病毒抗原， 特別是乳球菌屬(Lactococcus)的噬菌體P2。其僅公開了抑制所述噬菌體的VHH序列。Hamers等的專利文獻(xiàn)US 2007/0009512,以及相同發(fā)明人的早先的文獻(xiàn)公開了免 疫球蛋白的重鏈片段及其用于獸醫(yī)用治療如被動免疫治療或血清治療的應(yīng)用。所述的VHH 僅是被破傷風(fēng)毒素。用來獲得所述VHH的方法來自免疫的駱駝科動物的mRNA。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個目的是提供來源于駱駝科動物抗體的單體結(jié)構(gòu)域(VHH)，其中所述 結(jié)構(gòu)域可以是SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3或SEQ ID No.4中所示的一個氨基 酸序列，且其中所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合A組RV的蛋白VP6。
本發(fā)明的另一個目的是提供結(jié)合A組RV的蛋白VP6的二聚體結(jié)構(gòu)域，其中所述融合蛋白包括SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4中所示的至少一個單 體序列。在優(yōu)選實施方案中，所述融合蛋白包括SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11 和SEQ ID No. 12中所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供輪狀病毒免疫檢測法，其包括使包含RV的樣品與SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8， SEQ ID No. 9中所示的一個氨基酸序列或它們的組合相接觸；和顯色。所述免疫檢測法可以通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行，例如基于免疫捕獲的檢 測 ELISA，ELISP0T，競爭性 ELISA，磁珠或 pen-side。本發(fā)明的另一個目的是提供賦予哺乳動物被動免疫性的組合物，其包括SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8 或SEQ ID No. 9中所示的任何序列，賦形劑和免疫調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明的另一個目的是提供針對由RV產(chǎn)生的感染的預(yù)防方法，其包括給需要其 的哺乳動物施用有效量的 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12或其組合中所示的任何序列，其中所述 序列是單獨(dú)的或與包封且保護(hù)它們免于在胃腸道被降解的物質(zhì)組合。本發(fā)明的另一個目的是提供關(guān)于由RV產(chǎn)生的感染的治療方法，其中所述方法包括給需要其的哺乳動物施用有效量的SEQ ID No. 1，SEQ IDNo. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ IDNo. 11，SEQ ID No. 12 或其組合中所示的任何序 列，所述序列是單獨(dú)的或與包封且保護(hù)所述抗體免于在胃腸道被降解的物質(zhì)組合。附圖描述

圖1.美洲駝免疫。免疫時間表，免疫時間過程中的樣品收集、最終采血和血清中 輪狀病毒抗體反應(yīng)的評估抗體滴度通過下列各項測量(i)使用重組VP6的ELISA，(ii) 使用輪狀病毒(IND ;Sb IP[5]G6)的ELISA，(iii)病毒中和和(iv)使用相同輪狀病毒 (IND ；Sb IP[5]G6)的ELISPOT。接種時間點(diǎn)用箭頭表示。圖2.通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測天然的和重組的VP6蛋白。BRV IND(A)或重組 VP6(B)在還原條件下；或非還原條件下運(yùn)行，且用下列各項檢測泳道1和8-牛多克隆血 清抗-A 組 RV ;2 和 9-抗 VP6 Mab (RG25A10) ；3 和 10-VHH 2KA4 抗 VP6 ；4 和 11-VHH 2KD1 抗 VP6 ；5 和 12-VHH 3B2 抗 VP6 ；6-和 13 VHH 3A6 抗 VP6 ；7 和 14-不相關(guān)的 VHH0圖3. VHH-ELISA 用來自不同動物物種的不同亞組反應(yīng)性和G/P型特征檢測輪狀 病毒毒株。A)抗體-捕獲的單體 VHH 2KA4，2KD1，3A6 (2 μ g/ 孔)。B)用二價 VHH biv2KA4，biv2KDl，biv3A6 (1 μ g/孔)直接包被。牛輪狀病毒 IND(SbI ；P[5]G6)，C486(SbI ；P[1]G6)和 B223(SbI ；P[11]G10)；人輪狀病毒 Wa(SbII ；P[8] Gl)和馬輪狀病毒H2 (Sb非I，非II ；P[12]G3)的組織培養(yǎng)物上清；陽性糞便與用牛輪狀 病毒IND試驗感染的小牛的病毒釋放峰值相對應(yīng)的糞便樣品；MA-104 假感染細(xì)胞的上清。 PBS (反應(yīng)空白)，陰性糞便對于輪狀病毒是陰性的小牛糞便樣品。誤差柱表示兩次獨(dú)立測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4.體外輪狀病毒熒光病灶減少測定。將每種單價VHH 2KA4，2KD1，3A6*3B2的4倍稀釋物與相同體積的包含100FFU的輪狀病毒混合。認(rèn)為引起感染率減少> 80%的 VHH濃度是具有保護(hù)性的。A.牛輪狀病_$ C486 (與用于接種和小鼠攻擊的Ag同源)
B.牛輪狀病_iIND(與用于結(jié)合劑選擇的Ag同源)；
C.牛輪狀病_| B223 ；
D.人輪狀病_|ffa ；
E.馬輪狀病_| H2。該圖表示兩次獨(dú)立的測定的概括結(jié)果。圖5.在用輪狀病毒攻擊的新生小鼠中通過單價VHH 2KA4，2KD1，3A6和3B2獲得 的針對腹瀉的保護(hù)率。從第0天至第5天，幼崽用lOOiigdOOiil)的每種VHH喂養(yǎng)，每天 一次，通過胃內(nèi)途徑。在第1天，在常規(guī)喂食后2小時，用RV胃內(nèi)攻擊幼崽。每天追蹤腹瀉 情況，直到攻擊后96小時。A.攻擊30DD50(6xl05FFU)牛輪狀病毒C486。實驗在每組5只小鼠的三次獨(dú)立 測定中進(jìn)行。B.攻擊316DD50鼠輪狀病毒ECw。實驗在每組5只小鼠的兩次獨(dú)立的測定中進(jìn) 行。C.通過ELISA定量在10% w/v小腸勻漿中的病毒釋放。符號#意指與未處理/攻擊的組顯著不同的感染動物的百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)isher精確檢驗， p < 0. 05。柱表示每組在405nm處ELISA吸光度的平均值。誤差柱表示士標(biāo)準(zhǔn)偏差。ELISA 截斷值0. 200。圖6A.顯示VHH在粉紋夜蛾(T. ni)幼蟲中的表達(dá)。表達(dá)水平足夠高，足以在考馬 斯染色中檢測出兩條預(yù)測分子量的條帶。B.顯示在幼蟲系統(tǒng)中表達(dá)的VHH的量化。圖7顯示使用來自幼蟲的VHH的ELISA技術(shù)。將來自表達(dá)VP6的幼蟲[Ag(+)]或 由感染了非-插入型重組桿狀病毒(baculovirus)的幼蟲[Ag(-)]的總可溶蛋白(TSP)提 取物用來包被ELISA微量滴定平板(Polysorp，Nunc，丹麥)，以在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽 緩沖液pH 9. 6中40 y g/孔開始連續(xù)稀釋，且在4°C溫育過夜(0. N)。發(fā)明詳述為了本申請的目的，術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是可以不依賴于蛋白鏈的其余部分而進(jìn)化、行 使功能和存在的一部分蛋白(抗體)序列和結(jié)構(gòu)。每個結(jié)構(gòu)域形成緊湊的三維結(jié)構(gòu)域，且 通?？梢元?dú)立地穩(wěn)定和折疊。許多蛋白由數(shù)個結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域組成。一個結(jié)構(gòu)域可能在多個 進(jìn)化相關(guān)的蛋白中出現(xiàn)。結(jié)構(gòu)域在長度上從約25個氨基酸到至多500個氨基酸長度之間 變化。結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合表位。本申請的結(jié)構(gòu)域結(jié)合A組RV的蛋白VP6。為了本申請的目的，術(shù)語“VHH”，"VHH結(jié)構(gòu)域”，“單體VHH”和“VHH單體”被認(rèn)為 具有相同的含義且可以互換。為了本申請的目的，術(shù)語“蛋白VP6”，“抗原VP6”和“VP6”被認(rèn)為具有相同的含義
且可以互換。為了本申請的目的，術(shù)語“二聚體結(jié)構(gòu)域”，"VHH 二聚體”和“二聚體VHH”被認(rèn)為 具有相同的含義且可以互換。
術(shù)語“同源二聚體”定義為由兩個相同的單體結(jié)構(gòu)域，通過或不通過連接序列形成 的蛋白或多肽。術(shù)語“異源二聚體”定義為由兩個不同的單體結(jié)構(gòu)域、通過或不通過連接序列形成 的蛋白或多肽。表述“適當(dāng)?shù)纳L條件”是指為了提高轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(由本發(fā)明定義的載體轉(zhuǎn)化的、 轉(zhuǎn)染的或感染的)的生長而建立的適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。例如，將感染的幼蟲保持在28°C的生長室 內(nèi)，且在指定的時間進(jìn)行收集。為了本發(fā)明的目的，“疫苗”是一種用于引入針對特定疾病的免疫性的制劑。設(shè)計 用于賦予哺乳動物被動免疫性的組合物，其特征在于，其包括選自由SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12， 和它們的組合形成的組的氨基酸序列；賦形劑和免疫調(diào)節(jié)劑。表述施用給哺乳動物以預(yù)防由RV產(chǎn)生的感染的“有效量的氨基酸序列(多肽)”， 是指預(yù)先估算的結(jié)合最終將感染宿主生物體的病原體(病毒)的表位并阻斷其作用所需要 的氨基酸序列(多肽)的量。表述施用給哺乳動物用于治療由RV產(chǎn)生的感染的“有效量的氨基酸序列(多 肽)”，是指結(jié)合表位和阻斷已經(jīng)感染宿主生物體的病原體的作用所需要的氨基酸序列(多 肽)的量。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“哺乳動物”一般是指哺乳動物(Mammalia)綱的成員，例 如人、牛、山羊、綿羊、豬和馬。連接序列定義為連接兩個單體結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。記述了針對A組RV的中間衣殼蛋白VP6的VHH抗體的選擇、獲得和表征。表明本 發(fā)明的VHH是廣泛反應(yīng)性蛋白，其可以操作以用于檢測A組RV的通用免疫診斷測定中。此 外，表明一些所選擇的抗-VP6VHH在體外具有廣泛的中和活性，且一些所述VHH在體內(nèi)保護(hù) 免遭病毒攻擊?；谒麄兊牧私?，本發(fā)明人相信本發(fā)明的VHH是最先記述的結(jié)合蛋白VP6 且具有中和活性的分子。為了獲得本發(fā)明的VHH結(jié)構(gòu)域，進(jìn)行圖1所示的動物免疫時間表。為了評估美洲 駝的免疫反應(yīng)，抗-RV和抗-VP6抗體滴度通過ELISA、病毒中和(VN)測定分析，且在外周血 中的循環(huán)的特異性抗體-分泌細(xì)胞通過ELISP0T分析。如預(yù)料的，在接種后(DPI)第0天， 美洲駝對抗-RV抗體是陽性的，表明先前與該抗原接觸過。然而，沒有抗體_分泌細(xì)胞在血 液中循環(huán)。在注射后第7天，由ELISA確定的抗-IND-RV或抗-VP6抗體滴度較高，且在外 周血中檢測到RV-特異性抗體-分泌細(xì)胞的峰值(16個產(chǎn)生抗-RV IgG的細(xì)胞/5x10s個 單核細(xì)胞)。從注射后第14天體液反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定水平，其具有高的針對全病毒和蛋白VP6 的抗體滴度。相反，對于所研究的所有不同RV(IND，B223, ffa和H2)，中和抗體滴度保持近 似且非常低。盡管在血清中獲得非常高的抗體滴度，但是在血液中檢測到的抗-RV抗體分 泌細(xì)胞的量隨著每次加強(qiáng)而減少(圖1)。因為這一原因，且為了提供足夠的時間以有助于 抗體親和成熟，美洲駝直到很晚以后，即注射后第246天(約在第4次給藥后7個月)才接 受最后的VP6給藥。最后，美洲駝在最后加強(qiáng)后4天時采血，達(dá)到26. 8個抗-RV IgG分泌 細(xì)胞/5x10s個單核細(xì)胞的數(shù)值。自900ml血液中提取6xl08個單核細(xì)胞(依據(jù)ELISP0T結(jié) 果，其包含至少32，160個RV-特異性IgG抗體-分泌細(xì)胞)。由處理的RNA (210 y g)，產(chǎn)生包含6xl07個克隆的VHH噬菌體文庫。所用的接種方案顯示，為了獲得本發(fā)明的VHH，更重 要的是獲得高的特異性抗體_分泌細(xì)胞的數(shù)值而不是高的針對目的抗原的抗體滴度。在所 用的接種方案中，獲得充足數(shù)量的特異性抗體_分泌細(xì)胞是可能的。在免疫過程中獲得的 結(jié)果允許我們突出強(qiáng)調(diào)，追蹤免疫的美洲駝的免疫反應(yīng)以建立VHH文庫的最佳方法是選擇 評估外周血中循環(huán)的特異性抗體_分泌細(xì)胞的數(shù)量而不是針對目的抗原的血清抗體滴度 的技術(shù)。根據(jù)所獲得的抗體-分泌細(xì)胞的模式，表明在最后兩次給藥之間具有長的時間間 隔的接種方案促進(jìn)更多數(shù)量的特異性抗體_分泌細(xì)胞在外周血中循環(huán)。還表明，在接種后 4天時，比在接種后7天時，存在更多數(shù)量的針對目的抗原的循環(huán)抗體_分泌細(xì)胞。接種方 案應(yīng)該以這樣的方式進(jìn)行，以致在最后一次給藥后至少5個月時對美洲駝施用加強(qiáng)劑量， 且當(dāng)在外周血中達(dá)到約20個抗-靶抗原IgG抗體-分泌細(xì)胞的數(shù)量時，產(chǎn)生噬菌體集落。 優(yōu)選地，對于抗-VP6VHH，外周血中IgG抗體-分泌細(xì)胞的數(shù)量必須是約30個抗-完整-rt IgG抗體-分泌細(xì)胞。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員明白其他的免疫方案可以用來獲得對本發(fā)明 的方法和組合物合適的VHH。為了選擇表達(dá)抗-RV VHH的噬菌體，在體外使用RV IND作為抗原進(jìn)行三輪選擇。 選擇了 192個克隆。限制性分析對于所有在VHH文庫中表現(xiàn)出大VP6-結(jié)合多樣性的克隆 進(jìn)行；這是通過噬菌體ELISA確定的。所述克隆還通過ELISA分析以確定它們結(jié)合RV和 VP6的能力。從具有不同序列的14個克隆中，選擇10個表現(xiàn)出較強(qiáng)的針對RV和VP6的特 異性結(jié)合的克隆，且將它們亞克隆在提供羧基端六組氨酸標(biāo)記物的表達(dá)載體中，以促進(jìn)其 純化(表1)。表 1選擇VHH結(jié)構(gòu)域的定量評估的結(jié)果的總結(jié) 1使用抗-組氨酸抗體與平板結(jié)合。選擇了 4個與對應(yīng)于不同亞組的RV毒株更強(qiáng)結(jié)合的克?。贿@些克隆稱為2KA4(SEQ ID No. 1)，2KD1(SEQ ID No. 2)，3A6 (SEQ ID No. 3)和 3B2 (SEQ ID No. 4)，由蛋白質(zhì)印跡評 估，其識別重組VP6及其天然副本RV IND，這表明所述VHH結(jié)合該蛋白VP6的構(gòu)象表位(圖 2)。在下文中，稱為2KA4，2KD1，3A6和3B2的VHH為本發(fā)明的VHH結(jié)構(gòu)域。編碼每一 VHH結(jié)構(gòu)域的DNA序列如下SEQ ID No. 5 編碼 SEQ ID No. 1 結(jié)構(gòu)域；SEQ ID No. 6 編碼 SEQ ID No. 2 結(jié)構(gòu)域；SEQ ID No. 7 編碼 SEQ ID No. 3 結(jié)構(gòu)域；SEQ ID No. 8 編碼 SEQ ID No. 4 結(jié)構(gòu)域；本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知編碼所述結(jié)構(gòu)域的任何DNA序列在本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。例如，氨基酸序列SEQ ID No. 1可以由DNA序列SEQ IDNo. 5或由因為遺傳密碼的簡并 而與SEQ ID No. 5不同的另一 DNA序列編碼。相同的舉例對于由各自的DNA序列(SEQ ID No. 6，7和8)編碼的每一氨基酸序列(SEQ ID No. 2，3和4)是正確的。本發(fā)明的抗-VP6特異性VHH作為用于RV免疫診斷的試劑是非常有效的。本發(fā)明 的VHH的單體形式在ELISA中作為捕獲抗體、作為二抗或利用抗-His抗體固定而測定。本 發(fā)明的VHH能夠檢測具有不同特異性亞組和不同的G與P型的人或動物來源的RV毒株(圖 3A)。另一方面，構(gòu)建表達(dá)載體來產(chǎn)生特異性結(jié)合VP6的本發(fā)明的二聚體VHH，這構(gòu)成與同人IgA鉸鏈序列相似的連接序列結(jié)合的相同VHH基因。本發(fā)明的二聚體VHH還在ELISA中 作為直接的捕獲進(jìn)行評估，其對于所研究的所有RV毒株表現(xiàn)出清楚的、可重現(xiàn)的信號(圖 3B)。本發(fā)明的二聚體VHH可以用于ELISA平板致敏，由此消除對使用VHH捕獲抗體的需要， 且顯示出比它們的單體副本更好的RV檢測結(jié)果。值得強(qiáng)調(diào)的是，在大腸桿菌(E. coli)周質(zhì)(periplasma)中表達(dá)的單體VHH的產(chǎn) 量與由其他作者在大腸桿菌和酵母中報道的那些相當(dāng)。已證明本發(fā)明的單體和二聚體VHH對于RV的診斷是非常有效的，且因此，可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何免疫診斷中用作重組單克隆抗體。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的 是，本發(fā)明的單體和二聚體VHH結(jié)構(gòu)域可以用于檢測RV的任何類型的免疫診斷測定，且所 述測定落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的抗-VP6結(jié)構(gòu)域可以用來構(gòu)建二聚體如本文所述的那些，例如，同源二聚 體，或可以融合形成異源二聚體，例如，通過融合結(jié)構(gòu)域3B2和結(jié)構(gòu)域3A6，或融合任意兩個 本發(fā)明的VHH單體。此外，三個或更多本發(fā)明的VHH單體也可以融合或組合產(chǎn)生同源三聚 體或異源三聚體。由本發(fā)明的VHH單體的組合產(chǎn)生的所有多聚體形式，不管它們是否包含 連接序列，均落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的VHH二聚體具有 SEQ ID No.9，或 SEQ ID No. 10，或 SEQ ID No. 11，或 SEQ ID No. 12 公開的序列。例如，所 述二聚體可以包括氨基酸連接序列，如SEQ ID No. 13中所示的序列，或作用為鉸鏈序列的 任何其他序列。下述表格顯示本發(fā)明的二聚體和單體VHH的一些特征。表2特征 1由針對RV IND和重組VP6的WB確定2基于一組6份培養(yǎng)物，其每份0. 51，利用抗-組氨酸標(biāo)記柱來純化。3 檢測 RV 毒株 Sb I, Sb II，Sb 非 I;非 II。本發(fā)明的抗-VP6VHH結(jié)構(gòu)域能夠在體外中和不同的RV毒株。4個本發(fā)明的單體 中的3個(2KD1，3A6和3B2)在體外表現(xiàn)出廣泛的中和活性。每種VHH的中和能力對于評 估的所有RV毒株是相似的。由3. 9 μ g/ml開始的單體濃度能夠在體外完全中和由100FFU RV 毒株 C486(P[1]G6)，IND(P[5]G6), Β223 (P[11]G10), Wa P[8]Gl 和 H2(P[12]G3)產(chǎn)生的 傳染性。表3列出了具有關(guān)于每種單體2mg/ml的濃度的溶液針對不同RV毒株的中和滴度。表 3不同的單體和二聚體VHH結(jié)構(gòu)域的中和滴度 1關(guān)于不同RV毒株的中和抗體滴度，表示為減少> 80%的每100FFU的每種RV毒 株產(chǎn)生的病灶形成單位的最高VHH稀釋的倒數(shù)。因此，所述VHH單體能夠中和屬于通常不誘導(dǎo)交叉中和作用的不同G/P型組合的 RV毒株。具有最高中和能力的VHH單體是單體2KD1。另一方面，盡管單體2KA4在ELISA 中能夠適當(dāng)?shù)刈R別所有RV，但是它不中和任何所研究的毒株。本發(fā)明的VHH中和高滴度的 抗原性不同RV毒株的能力是非常顯著的，且使得它們成為多中和性分子；這種特性使得它 們成為用于RV引起的腹瀉的潛在的預(yù)防或治療工具，而與血清型無關(guān)(27種P-型和16種 G-型)。二聚體VHH表現(xiàn)出比它們的單體副本低的中和活性。評估了本發(fā)明的VHH單體治療和預(yù)防由RV感染產(chǎn)生的腹瀉的能力。為了這一目 的，給新生小鼠施用每日胃內(nèi)劑量的VHH，持續(xù)5天(第0天到第4天)。在第1天，用病毒 株C486攻擊小鼠，同樣通過胃內(nèi)途徑(圖5)。60%用本發(fā)明的單體VHH 3B2處理的小鼠受 到保護(hù)免于遭受RV引起的腹瀉。當(dāng)在處理的小鼠和未處理的小鼠或用不相關(guān)的VHH處理 的那些之間進(jìn)行比較時，該種保護(hù)作用顯著更大(P = 0.0108)，其中所有的小鼠患有腹瀉 (表4和圖5)。此外，與對照組相比較，在用本發(fā)明的VHH處理的動物中的腹瀉的嚴(yán)重性和 持續(xù)時間顯著降低。表 4在泌乳小鼠中針對輪狀病毒攻擊的保護(hù)作用 na 不適用具有不同字母的同一欄的平均值顯著不同(Kruskal ffallis, p < 0. 05)。具有不同字母的感染動物的百分?jǐn)?shù)顯著不同(Fisher精確檢驗，p < 0. 05)。值得注意的是，最高中和滴度針對人異源RV毒株(Wa，SbII，P[8]Gl)獲得，認(rèn)為所 述毒株是世界范圍內(nèi)與兒童腸胃炎最常相關(guān)的毒株。這些抗體片段的生產(chǎn)和純化可以以高產(chǎn)率進(jìn)行，導(dǎo)致較低的生產(chǎn)成本。這在發(fā)展 中國家特別有重大意義，在發(fā)展中國家中，感染量級和由RV引起的發(fā)病率(morbility) /死亡率是巨大的，且治療和預(yù)防成本是關(guān)鍵的局限性因素。本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員明白，基于本文公開的內(nèi)容，本發(fā)明的VHH結(jié)構(gòu)域可以通 過合成相對應(yīng)的核苷酸序列且在任何宿主細(xì)胞中對其進(jìn)行表達(dá)而生產(chǎn)，無需產(chǎn)生噬菌體文庫。本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員清楚的是，本發(fā)明的VHH單體、VHH 二聚體或VHH多聚體的不同組合和混合物可以用于RV感染的免疫診斷、預(yù)防和對RV感染的哺乳動物的治療，而不 改變本發(fā)明的精神，且其中所有可能的組合和混合物均落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。正如前文已經(jīng)提及的，選擇了 4種與對應(yīng)于不同亞組的RV毒株更強(qiáng)結(jié)合的克隆。 這些克隆稱為 2KA4(SEQ ID NO 1)，2KD1 (SEQ ID NO :2)，3A6 (SEQ ID NO :3)禾口 3B2 (SEQ ID NO :4)，通過蛋白質(zhì)印跡評估時，其識別重組VP6及其天然副本RV IND，這表明所述VHH結(jié) 合該蛋白VP6的線性表位。本發(fā)明的所述結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO: 1-4)或編碼它們的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5-8)可以插入到適當(dāng)?shù)闹亟M載體，諸如表達(dá)載體中。因此，本發(fā)明還涉及包括所述序列的表 達(dá)載體。所述載體的選擇是將要向其中引入所述載體的宿主細(xì)胞類型的函數(shù)。舉例來說， 所述載體可以是這樣的質(zhì)?；蜉d體，其一旦被引入到宿主細(xì)胞中，就整合或不在所述宿主 細(xì)胞的基因組中。所述載體可以通過利用本領(lǐng)域技術(shù)中包括的任何已知的方法[Sambrok 等1989]獲得。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的載體可以用來插入到植物或動物細(xì)胞的基因 組中。因此，本發(fā)明的載體可以是，例如，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或能 夠在植物或動物細(xì)胞中表達(dá)的病毒載體。在特定的實施方案中，用于本發(fā)明的病毒載體是 桿狀病毒(Baculovirus)(見實施例5)。所述載體可以用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染植物、藻類或動物細(xì)胞，優(yōu)選昆蟲或幼蟲細(xì) 胞。因此，本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是動物細(xì)胞，優(yōu)選是昆蟲細(xì)胞，且更優(yōu)選 是所述昆蟲的幼蟲的細(xì)胞。因此，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因非人動物，諸如轉(zhuǎn)基因昆蟲或轉(zhuǎn)基因 幼蟲，其以高產(chǎn)率表達(dá)由SEQ ID:l-4表征的肽。因此，本發(fā)明的載體可以用來生產(chǎn)和/或保存由SEQ ID NO 1-4和/或9-12表征 的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域的方法，其包括在允許產(chǎn)生所 述結(jié)構(gòu)域的條件下生長用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染的細(xì)胞或生物體。用于最優(yōu)化轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞或生物體的培養(yǎng)物的條件將取決于所用的細(xì)胞或生物體的類型。如果需要的話， 用于生產(chǎn)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域的方法還包括按照本領(lǐng)域已知的任何方法對它們的分離和純化。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及特征在于包括任何本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域的抗體·來源于駱駝科動物抗體的單體VHH結(jié)構(gòu)域，其特征在于其包括選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4形成的組的序列，其中所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合A 組輪狀病毒(RV)的蛋白VP6。 結(jié)合A組RV的蛋白VP6的二聚體VHH結(jié)構(gòu)域，其特征在于其包括選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的序列形成的組的至少一個單體序 列。本發(fā)明的另一個方面涉及用于免疫檢測RV的試劑盒，其包括選自由SEQ ID No. 1， SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQID No. 12，以及它們的組合形成組的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸 序列，其用于預(yù)防由RV產(chǎn)生的感染的方法。換言之，本發(fā)明涉及選自由SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2，SEQID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列用于制備用于預(yù)防由RV產(chǎn)生的感染的組合 物的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還涉及選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的 組的氨基酸序列，其用于治療由RV產(chǎn)生的感染的方法。換言之，本發(fā)明涉及選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11， SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列用于制備用于治療由RV產(chǎn)生的感染 的組合物的應(yīng)用。最后，本發(fā)明涉及用于被動免疫的方法，其包括在人或動物體內(nèi)接種有效量的上 文定義的抗體。按照布達(dá)佩斯條約的微生物保藏質(zhì)粒pFBMelVHH(見實施例5)于02. 07. 08日期保藏在西班牙典型培養(yǎng)物收 藏中心(Spanish Type Culture Collection) (CECT)；瓦倫西亞大學(xué)(University of Valencia)，西班牙，保藏號為CECT7431。
實施例本發(fā)明通過下述實施例最好地示例，其不應(yīng)該解釋為對其范圍施加的限制。相反， 必須清楚地明白，可以使用本說明書在不背離本發(fā)明精神和/或本發(fā)明范圍的條件下可能 向本領(lǐng)域技術(shù)人員提示的其他實施方案、修改及其等價物。實施例1 本發(fā)明的單體和二聚體VHH的獲得和純化本發(fā)明的VHH文庫的獲得在選擇VHH的生物淘選過程中使用參照牛IND RV毒株(Sbl ；P[5]G6)作為抗原。 為了具有代表不同亞組與來自不同動物物種和來自人類的G和P型的不同組合的反應(yīng)性的 RV組，在進(jìn)行的不同測定中包括表4中列出的參照RV毒株來產(chǎn)生VHH。病毒在猴腎細(xì)胞 (MA-104)中繁殖。還包括來自在預(yù)接種和在病毒擴(kuò)散峰值的時刻感染IND毒株的缺乏初乳 的新生小牛的糞便樣品。表 5在生產(chǎn)和表征本發(fā)明的VHH的過程中進(jìn)行的不同方法中使用的參照輪狀病毒毒
株 美洲駝的免疫來源于牛RV毒株的蛋白VP6C486(SbIP[l]G6)，在用重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞中產(chǎn)生。一歲齡的雄性美洲 駝在第0，21，28，35和246天時接受5次包含與INTA油佐劑(Marcol Arcel Span 吐溫)混 合的500 μ gVP6的粗細(xì)胞提取物的給藥。在每次接種后的第0，4和7天采集血清和血液樣 品。通過ELISA和病毒中和(VN)(進(jìn)一步參見下文)評估體液反應(yīng)。為了評估效應(yīng)B細(xì)胞反 應(yīng)，調(diào)整ELISPOT測定，其基于先前在豬和小牛中進(jìn)行的ELISPOT測定(Parreno，V. C.等， Vet Immunol Immunopathol (獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理學(xué))100 :7_24，2004，和 Parreno， V. V.等，J Vet Med B Infect Dis Vet PublicHealth (獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志B傳染病和獸醫(yī)公共 衛(wèi)生)48 =713-20, 2001，結(jié)合于此僅作為參考)，確定接種的美洲駝外周血中的RV-特異性 抗體-分泌細(xì)胞的數(shù)目。簡言之，在96-孔平板中生長的感染了 BRV IND (通過免疫熒光檢 測具有超過80%的感染)的MA-104細(xì)胞使用70%丙酮固定，空氣干燥且保存在-20°C直 到對它們進(jìn)行使用。將來源于接種的美洲駝的外周血(PB)的單核細(xì)胞(MNC)懸浮液添加 到孔中(IxlO6 ；5x10s ；2, 5x10s和1，25x10s個細(xì)胞/孔)。在以500g離心5分鐘后，將平板 在37°C在5% CO2中溫育12-14小時。將平板用含有0. 05%吐溫-20的PBS洗滌，以去除 黏附的細(xì)胞，且通過在37°C加入以1/1，500稀釋的在ELISA中使用的相同綴合物2小時，及隨后通過50iU TMB過氧化物酶底物系統(tǒng)(KLP，馬里蘭，美國)來形成點(diǎn)印跡(spots)。依據(jù)由INTA’ s動物福利道德委員會核準(zhǔn)的流程，由經(jīng)過訓(xùn)練的人員在獸醫(yī)的監(jiān) 督下進(jìn)行美洲駝樣品的處理、接種和收集。VHH文庫的產(chǎn)生和本發(fā)明的VP6-結(jié)合VHH的選擇由在最后注射后4天收集的總 共900ml血液中，通過Ficoll Paque梯度離心提取6xl08個單核細(xì)胞；然后，將它們離心，冷 凍在液氮中，并隨后保存在_80°C。使用RNA提取設(shè)備(Macherey Nagel ；Nucleospin RNA II)提取總RNA，獲得250 ii gRNA。隨后，利用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶設(shè)備(Invitrogen)， 使用 OligodT (12-18)引物(Invitrogen)或隨機(jī)引物(Invitrogen)，合成第一 cDNA 鏈。在 20- u 1的反應(yīng)混合物中，使用0. 2，1或5 ii g的總RNA。使用引物CALL01 (SEQ ID No. 14)和 CALL02 (SEQ ID No. 15)，通過PCR特異性擴(kuò)增編碼VHH和VH的cDNA，所述引物與前導(dǎo)序列 和CH2序列退火。在與900-pb的片段(外顯子VH-CH1-CH2)分離后，從1. 6%瓊脂糖凝膠洗 脫600-pb的片段(外顯子VHH-CH2，無外顯子CH1)。然后，使用在構(gòu)架區(qū)1 (SEQ ID No. 16) 和構(gòu)架區(qū)4(SEQ ID No. 17)退火的引物，和使用包含用于隨后的克隆步驟的限制性位點(diǎn)的 引物:VHHfor2 (SEQ ID No. 18)，其具有關(guān)于Ncol和PstI的限制性位點(diǎn)，和VHHrev2 (SEQ ID No. 19)，其具有關(guān)于NotI的限制性位點(diǎn)，通過另外的嵌套式PCR擴(kuò)增VHH。使用上游限 制性位點(diǎn)Ncol或PstI和下游限制性位點(diǎn)NotI，將最終PCR片段連接在噬菌粒載體pAO-Lib 巾，pAO-Lib ^ pHEN4 Wjftrp^^ (ArbabiGhahroudi M, Desmyter A, ffyns L, Hamers R, Muyldermans S.Selectionand identification of single domain antibody fragments from camelheavy-chain antibodies (來自駱駝重鏈抗體的單結(jié)構(gòu)域抗體片段的選擇和鑒 定).FEBS Lett. 1997年9月15日；414(3) :521_6)，其包含在插入VHH后去除的不相關(guān)的 長序列，以這樣的方式來延遲不具有VHH插入物的載體的潛在的增殖。用所連接的材料轉(zhuǎn) 化大腸桿菌(TG1)細(xì)胞，且接種細(xì)胞。從平板上刮下菌落，在增補(bǔ)了甘油(50%終濃度)的 LB培養(yǎng)基中洗滌且保存在-80°C。使用噬菌體展示技術(shù)由所述文庫選擇特異性VHH。將VHH文庫用M13輔助噬菌 體(Invitrogen)感染，且拯救并用PEG沉淀表達(dá)VHH全體的噬菌體顆粒，如Marks，J. D.， Hoogenboom, H. R. ，Bonnert, T. P. ，McCafferty, J. ，Griffiths, A. D. ，Winter, G. JMB, 1991 所述。特異性VHH的富集通過兩至三輪體外選擇進(jìn)行，即，通過稱為生物淘選的技術(shù)進(jìn)行。 免疫管在4°C用半純化的BRV IND(SbI ；P[5]G6)的1/50稀釋物或用來自豚鼠的抗-RV多 克隆抗血清在PH 9. 6的碳酸緩沖液中的1/5，000稀釋物包被過夜，然后是封閉步驟，且捕 獲相同的BRV IND的1/50稀釋物。拯救的噬菌體用BRV IND溫育，這是直接進(jìn)行的或具有 這樣的步驟，即先前捕獲的，洗滌，和結(jié)合的噬菌體顆粒用100mM pH 10.0的三乙胺洗脫，且 立即用pH 7.4的撲化中和。洗脫的噬菌體用來感染指數(shù)生長的TG1細(xì)胞。在第二或第三 輪生物淘選后，生長單個克隆，且通過噬菌體ELISA分析相對應(yīng)的VHH克隆。本發(fā)明的單體和二聚體VHH的表達(dá)和純化將在ELISA中為陽性的克隆 的VHH cDNA用限制性酶Ncol和NotI重新克隆在表達(dá)載體pHEN6中(Conrath， K.E.M.等.Antimicrob Agents Chemother (抗菌劑化學(xué)治療)45 :2807_12，2001，結(jié)合于此 僅作為參考)，所述表達(dá)載體提供周質(zhì)的pelB靶向序列和羧基端六_組氨酸標(biāo)記物。使用 引物 Bivfor2(SEQ ID No. 20)和 Bivrev2 (SEQ ID No. 21) (SEQ ID No. 22)，通過 VHH 序列的 PCR擴(kuò)增來構(gòu)建二價VHH，所述引物編碼與人IgA鉸鏈相關(guān)的連接體。將PCR產(chǎn)物和包含VHH模板的PHEN6載體用Ncol和PstI消化，且連接以產(chǎn)生載體pAO-biv，其包含所述二價VHH。 為了產(chǎn)生單價或二價VHH，用不同的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1 Blue細(xì)胞。在27°C用ImM 異丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)誘導(dǎo)VHH表達(dá)16小時 (Sambrook, J.，和 Russell，D. W. , 2001,Molecular Cloning(分子克隆))。在離心細(xì)胞后， 通過滲透壓休克提取周質(zhì)蛋白。使用N-High-TrapHP螯合柱(Amersham Biosciences (安 馬西亞生物科學(xué)))從所述周質(zhì)提取物中純化VHH。實施例2 本發(fā)明的VHH的表征蛋白質(zhì)印跡將在桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)的VP6濃縮物，和BRV IND濃縮物重懸 在Laemmli樣品緩沖液中，煮沸10分鐘。然后將它們通過12% SDS-PAGE柱運(yùn)行，且轉(zhuǎn)移 到Immobilon P膜上(Millipore，Berdford，MA)。該膜用包含10%脫脂奶的PBS/吐溫 (0.05%)封閉45分鐘，并且將每種VHH(4i!g/ml)在環(huán)境溫度下溫育2小時。然后，將膜 用PBS/吐溫(0.05%)洗滌，且用抗-五組氨酸抗體(在PBS/吐溫(0.05%)BSA(3%)中 的1/500稀釋物)在4°C溫育過夜。最后，將它們用HRP-綴合的山羊抗-小鼠IgG(l/5，000 稀釋物)(Amersham(安馬西亞)，Pharmacia，Biotech(生物技術(shù)))在環(huán)境溫度下溫育40 分鐘。測定用ECL (Amersham Biosciences (安馬西亞生物科學(xué)))顯色。 本發(fā)明的VHH的測序為了測序VHH，使用“M13正向”和“M13反向，，寡核苷酸，按 照這一方法進(jìn)行Big Die終止子循環(huán)測序快速反應(yīng)試劑盒(Big Die Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) (AppliedBiosystem(應(yīng)用生物系統(tǒng)))，在 ABI-Prism 377 DNA自動測序儀(PerkinElmer, Applied Biosystems (應(yīng)用生物系統(tǒng)))中進(jìn)行。實施例3 使用本發(fā)明的VHH的RV免疫檢測測定酶免疫測定(ELISA)和蛋白質(zhì)印跡通過直接用RV致敏或通過用在限菌豬中產(chǎn)生 的多克隆抗體捕獲RV或重組VP6，在Maxisorp 96-孔平板(Nunc)中進(jìn)行ELISA實驗。作 為用于陰性對照的抗原，使用假感染的MA-104細(xì)胞和在桿狀病毒中表達(dá)的不相關(guān)的蛋白 (牛腹瀉病毒的蛋白E2)。使用PBS作為空白，且使用未免疫的豚鼠血清作為陰性捕獲。按照Parreno，V. C.等，Vet Immunol Immunopathol (獸醫(yī)免疫學(xué)和免疫病理 學(xué))100 7-24,2004所述分析美洲駝血清中抗-RV抗體的存在，且使用由Ferndndez等 (Fernandez, F. M.等，Vaccine (疫苗)16 =507-16,1998)修改的方法分析抗-VP6抗體的存 在。美洲駝IgG使用1/2，000稀釋的過氧化物酶-標(biāo)記的山羊抗-美洲駝IgG(H+L) (Bethyl, lab inc, Montgomery, CA, USA)檢測。通過噬菌體ELISA分析來源于由生物淘選獲得的單個克隆的噬菌體。簡言之，將 在載體phen4中包含不同VHH基因的單個指數(shù)生長的大腸桿菌TG1克隆用M13輔助噬菌體 感染，以產(chǎn)生表達(dá)與表面蛋白融合的VHH的噬菌體顆粒，并且在用BRV IND或VP6致敏的 ELISA平板中測定包含噬菌體后代的培養(yǎng)物上清。結(jié)合的噬菌體使用HRP-綴合的抗-M13p8 抗體(Amersham(安馬西亞)，Pharmacia, Biotech (生物技術(shù)))的1/5，000稀釋物在環(huán)境 溫度下進(jìn)行檢測40分鐘。測定使用H202/ABTS(Zymed)進(jìn)行顯色。首先，將用羧基端6-His標(biāo)記物純化的單價或二價VHH作為用于通過ELISA檢測 RV或VP6的試劑來研究，如上文所述，所述ELISA通過抗-五組氨酸單克隆抗體(Qiagen， 1/5，000)和HRP-綴合的山羊抗-小鼠抗體進(jìn)行顯色。其次，將這些作為RV捕獲劑進(jìn)行分 析，均通過10 u g/ml VHH的直接ELISA平板致敏和通過10 u g/ml抗-組氨酸單克隆抗體，且隨后是20yg/ml VHH捕獲。該測定使用RV多克隆抗血清來顯色，所述RV多克隆抗血清來自用BRV IND (1/2，OOO稀釋物)和1/5，000稀釋的過氧化物酶-標(biāo)記的抗-牛IgG(H+L) (KPL，Gaitherburg，馬里蘭，美國)超免疫的缺乏初乳的小牛。二聚體VHH作為處于10 μ g/ml的RV捕獲劑通過ELISA檢測。單體VHH還作為二抗進(jìn)行測定，且ELISA使用抗-五組氨酸單克隆抗體和 HRP-綴合的山羊抗-小鼠抗體(1 1，000稀釋物)(Amersham(安馬西亞)，Pharmacia, Biotech (生物技術(shù)))進(jìn)行顯色。病毒中和測定關(guān)于病毒IND，C486，B223, Wa和H2在美洲駝血清樣品和純化的 VHH中的中和抗體滴度通過熒光病灶中和(FFN)確定，如在To，T.L.等(J Gen Virol (遺 傳病毒學(xué)雜志)79(Pt 11) :2661-72，1998)中所述。簡言之，將100 μ 1連續(xù)稀釋的美洲 駝血清，選擇純化的VHH單體或二聚體與等病毒體積混合，以獲得100個病灶形成單位 (FFU)/100 μ 1混合物，且在37°C溫育1小時。將100 μ 1的抗體-病毒混合物涂布在ΜΑ-104 單層(4個重復(fù))上，且在37°C溫育48小時。平板用70%丙酮固定，且測定使用來自用RV 超免疫的缺乏初乳的小牛的FITC-標(biāo)記的抗-RV抗體進(jìn)行顯色(developed)。VN滴度表示 為導(dǎo)致> 80%的熒光病灶數(shù)目減少的樣品中的最高稀釋的倒數(shù)。實施例4 本發(fā)明的單體和二聚體VHH用于預(yù)防和/或治療哺乳動物的應(yīng)用在新生小鼠中的RV保護(hù)測定從第0天開始，每天一次，持續(xù)5天，使用胃內(nèi)探針，將100 μ g在100 μ 1中的每種 抗-VP6 VHH單體施用給4日齡的Balb/c小鼠。在第1天，常規(guī)VHH給藥后2小時，泌乳的 小鼠用100 μ 1包含2xl06FFU/ml的BRVC486(SbI ；P[1]G6)攻擊，并然后使用20 μ 1 5%碳 酸氫鹽溶液攻擊，同樣通過胃內(nèi)途徑。接種能夠在100%的未處理的對照小鼠中引起腹瀉。 實驗中所用的對照組為(i)用RV接種且未用抗體處理的小鼠；ii)用相同量的不相關(guān)VHH 處理的小鼠，所述不相關(guān)VHH針對細(xì)胞蛋白；iii)用450 μ g來源于豚鼠多克隆抗血清、針 對同源RV的VN滴度為2048的親和純化的IgG處理的小鼠；iv)用相同量的來自血清反應(yīng) 陰性對照豚鼠的IgG處理的小鼠；ν)未感染和處理的小鼠。在5天的研究過程中，臨床上通 過直接觸診小鼠腹部而評估RV引起的腹瀉。腹瀉的嚴(yán)重性通過基于糞便的顏色和硬度指 定數(shù)值，按每日進(jìn)行分析，如VanCot t，J.L.等，J Virol (病毒學(xué)雜志)80 :4949_61，2006所 述。使用Fisher精確檢測來比較各組之間患有腹瀉的小鼠的比例。使用Kruskal Wallis 無參數(shù)檢測來比較處理組之間的腹瀉的平均發(fā)作、持續(xù)時間和嚴(yán)重性。實施例5 重組桿狀病毒生成重組桿狀病毒BacMelVHH由包含VHH 3B2完整序列的phen 6質(zhì)粒產(chǎn)生。使用下 述引物=SEQ ID NO 23和SEQ ID NO :24，由phen 6質(zhì)粒PCR擴(kuò)增蛋白。然后利用包含在 相對應(yīng)的引物中的BamHI和XbaI限制性位點(diǎn)，將擴(kuò)增子與來源于蜜蜂蜂毒肽(melitin)的 昆蟲信號序列一起框內(nèi)克隆到pFaStMelB2載體中。得到的pFBMelVHH質(zhì)粒通過自動化測 序表征，且用來利用Bac-to-Bac 桿狀病毒系統(tǒng)(InVitr0gen，USA)按照供應(yīng)商的使用說 明產(chǎn)生重組桿狀病毒BacMelVHH。在sf21昆蟲細(xì)胞中繁殖和擴(kuò)增重組的桿狀病毒，以達(dá)到 107-109pfu/ml的感染滴度，且將儲液保存在4°C用于日常應(yīng)用，和保存在-80°C用于長期 儲存。昆蟲生長條件和接種
對于表達(dá)實驗，使用已知的pfu/幼蟲劑量，對重約250mg的第五齡期幼蟲(在蛹 化前的最后齡期的幼蟲)在腹足附近(體腔前)注射重組桿狀病毒。將感染的幼蟲保持 在28°C的生長室內(nèi)，且在指定的時間進(jìn)行收集。然后，立即冷凍幼蟲，且在處理之前保持 在-20°C。還使用已知的劑量感染昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物。將感染的細(xì)胞在28°C保持72小時。最 后，收獲感染的培養(yǎng)物，且同樣將細(xì)胞沉淀立即冷凍，且在處理之前保持在-20°C。制備蛋白提取物通過將冷凍的幼蟲混合于在PBS IX中包含triton 0,01%,DTT 25mM和蛋白抑制 劑混合物(完全，Roche (羅氏)，德國)的提取緩沖液中來獲得來自粉紋夜蛾幼蟲的總可溶 蛋白(TSP)。分析蛋白提取物進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色和免疫印跡分析，從而量化和檢測包含在TSPs中的特異性VHH 蛋白。因此，將20iig TSP/泳道上樣到12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。在電泳后，凝膠用 考馬斯藍(lán)溶液染色，或轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Schleicher & Schuell，)上，以進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。對于蛋白質(zhì)印跡測定，將SDS_PAGE(12% )轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Bio-Rad，USA) 上。膜用PBS-0.05%吐溫20(PBST)4%脫脂奶(封閉緩沖液，BF)在4°C封閉過夜，并且然 后在室溫(RT)用兔抗-VHH血清(在BF中1 100)溫育1小時。膜用PBST洗滌3次，且 最后加入抗_兔IgG-HRP-標(biāo)記的綴合物(在BF中1 2000，Sigma (西格瑪)，美國)1小 時作為二抗。在用PBST徹底洗滌之后，使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)在Hyperfilm ECL薄 膜(AmershanK安馬西亞)，美國)上檢測蛋白條帶(見圖6A)。功能性分析使用來自表達(dá)VP6(牛輪狀病毒蛋白)的幼蟲[Ag(+)]或來自用非插入重組桿狀 病毒感染的幼蟲[Ag㈠]的TSP提取物來包被ELISA微量平板(Polysorp, Nunc，丹麥)， 在50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，pH 9. 6中以40 y g/孔開始連續(xù)稀釋，且在4°C溫育過 夜(0.N)。第二天，平板用PBST洗滌四次。平板相繼在持續(xù)搖動下在37°C溫育1小時，使 用封閉溶液(PBST-2% BSA, 100 yl/孔)溫育30分鐘。然后，使用來自表達(dá)VHH的幼蟲的 TSP提取物，以2，5 yg/孔稀釋度處于封閉緩沖液中1小時。然后，平板用PBST洗滌4次， 且再封閉30分鐘。然后，加入100 ill/孔的在兔中制備的針對VHH的多克隆抗體(1 100 稀釋)，且在37°C溫育1小時。平板用PBST洗滌4次。最后，加入100 ill/孔的1 2000 稀釋在封閉溶液中的抗-兔IgG-HRP標(biāo)記的綴合物。對于底物反應(yīng)，將平板洗滌4次，且 向平板中加入100 ill/孔的ImM 2,2’ -連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)ABTS， (KPL，美國)。允許過氧化物酶反應(yīng)，以在室溫下顯色5-10分鐘，且在ELISA微量平板讀數(shù) 儀(Multiskan EX, Thermo Electron Corp (熱電公司)，美國)中在405nm處讀取反應(yīng)(見 圖7)。
權(quán)利要求
來源于駱駝科動物抗體的單體VHH結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其包括選自由SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4形成的組的序列，其中所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合A組輪狀病毒(RV)的蛋白VP6。
2.按照權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述駱駝科動物選自由駝羊(Lamaglama), 無峰馬它(Lama pacos)，原馬它(Lama guanicoe)禾口馬各馬(Vicugna vicugna)形成的組。
3.按照權(quán)利要求2的結(jié)構(gòu)域，其特征在于所述駱駝科動物是駝羊(Lamaglama) 0
4.按照權(quán)利要求1的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其結(jié)合在A組RV中存在的VP6抗原的線性 表位，其中選自由SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3和SEQID No. 4形成的組的所述結(jié)構(gòu)域是中和 性的。
5.結(jié)合A組RV的蛋白VP6的二聚體VHH結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其包括選自由SEQID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的序列形成的組的至少一個單體序 列。
6.按照權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其是包括兩個相同單體序列的二聚體，其中 所述相同的單體序列選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4形成 的組。
7.按照權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其是包括兩個不同單體序列的二聚體，所述 單體序列選自由 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4 形成的組。
8.按照權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其另外包括連接序列。
9.按照權(quán)利要求8的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其是序列SEQID No. 13。
10.按照權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述融合蛋白包括選自由SEQID No. 9, SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12形成的組的氨基酸序列。
11.按照權(quán)利要求5的結(jié)構(gòu)域，其特征在于，其結(jié)合在A組RV中存在的VP6抗原的線性 表位。
12.輪狀病毒免疫檢測方法，其特征在于，其包括a)使得含有RV的樣品與選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No，11，SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列相接觸，和b)顯色。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所述方法選自由基于免疫捕獲的檢測 ELISA，ELISP0T，競爭性ELISA，磁珠和pen-side形成的組。
14.設(shè)計用于賦予哺乳動物被動免疫性的組合物，其特征在于，其包括選自由SEQID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11， SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列；賦形劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
15.按照權(quán)利要求14的組合物，其特征在于，其采用選自由固體、液體和凝膠形式組成 的組的形式。
16.由RV引起的感染的預(yù)防方法，其特征在于，其包括給需要其的哺乳動物施用有效 量的選自由下列各項形成的組的氨基酸序列=SEQ IDNo. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ IDNo. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12 以及它們的組合。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述施用包括選自由通過口服、胃內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑形成的組的途徑。
18.按照權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述哺乳動物選自由人、牛、山羊、綿羊、豬和馬形成的組。
19.由RV引起的感染的治療方法，其特征在于，其包括給需要其的哺乳動物施用有效 量的選自由下列各項形成的組的氨基酸序列:SEQ IDNo. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ IDNo. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12 以及它們的組合。
20.按照權(quán)利要求19的方法，其特征在于，所述施用包括選自由通過口服、、胃內(nèi)、靜脈 內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑形成的組的途徑。
21.按照權(quán)利要求19的方法，其特征在于，所述哺乳動物選自由人、牛、山羊、綿羊、豬 和馬形成的組。
22.質(zhì)粒pFBMelVHH，其特征在于包括編碼(codify)權(quán)利要求1_11的任一單體或二聚 體結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。
23.按照權(quán)利要求22的質(zhì)粒pFBMelVHH，其中所述編碼的結(jié)構(gòu)域是以SEQID NO 4表 征的3B2。
24.有效用于轉(zhuǎn)化植物或動物細(xì)胞包括人細(xì)胞的重組表達(dá)載體，其特征在于包括權(quán)利 要求22或23的質(zhì)粒。
25.按照權(quán)利要求24的重組表達(dá)載體，其特征在于所述載體是病毒，特別是桿狀病毒 (Baculovirus) 0
26.轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染了權(quán)利要求24或25的載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于它們表達(dá) 權(quán)利要求22或23的質(zhì)粒中所包含的DNA。
27.生產(chǎn)權(quán)利要求1-11的結(jié)構(gòu)域的方法，其包括下述步驟a)用權(quán)利要求24或25的重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細(xì)胞，b)保持所述細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下生長，c)分離和純化所述結(jié)構(gòu)域。
28.按照權(quán)利要求27的方法，其特征在于，在分離和純化所述結(jié)構(gòu)域之前，將步驟b)中 生長的宿主細(xì)胞保持冷凍。
29.按照權(quán)利要求27的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞時幼蟲或昆蟲細(xì)胞。
30.抗體，其特征在于包括權(quán)利要求1-11的任一結(jié)構(gòu)域。
31.用于被動免疫的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求30的抗體接種至哺乳動物。
32.用于免疫檢測RV的試劑盒，其包括選自由SEQID No. 1，SEQ IDNo. 2, SEQ ID No. 3， SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ IDNo. 11，SEQ ID No. 12，以及它們的組合 形成的組的氨基酸序列。
33.選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列，其用于預(yù) 防由RV引起的感染的方法。
34.選自由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2，SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12，以及它們的組合形成的組的氨基酸序列，其用于治 療由RV引起的感染的方法。
全文摘要
來源于抗-VP6駱駝科動物抗體的單體VHH結(jié)構(gòu)域、二聚體結(jié)構(gòu)域、免疫方法、輪狀病毒檢測方法、疫苗組合物、用于輪狀病毒感染的預(yù)防和治療方法，其中所述結(jié)構(gòu)域可以是SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3或SEQ ID No.4中所示的任一種氨基酸序列，且其中所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合A組輪狀病毒的蛋白VP6。
文檔編號C07K16/10GK101878227SQ200880108604
公開日2010年11月3日 申請日期2008年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者何塞·安赫爾·馬丁內(nèi)斯·埃斯克里瓦諾, 吉塞拉·阿里亞娜·馬爾科皮多, 奧雷利安·奧利西翁, 安德烈斯·威格多羅維茲, 托馬斯·薩里, 格拉迪絲·比維安娜·帕雷尼奧, 洛雷納·勞里亞·加賴科亞查, 西爾維亞·戈麥斯·塞巴斯蒂安 申請人:交替基因表達(dá)有限公司(艾爾基尼克斯);國家農(nóng)業(yè)技術(shù)研究院(Inta)