專利名稱：：豬星狀病毒的熒光定量pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測方法，具體是一種豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
：星狀病毒屬于一個新的病毒家族即星狀病毒科，星狀病毒屬。該病毒于1975年首先由ApPleton和Hgigins用電鏡檢測急性胃腸炎患兒糞便時發(fā)現(xiàn)。病毒顆粒直徑28nm，因電鏡下可觀察到約10%的病毒顆粒表面有56個星狀突起，故而得名。星狀病毒廣泛分布于世界各地，并報道與豬、犬、鹿、水貂、鼠、貓、羊等多種動物腹瀉性疾病有關(guān)。豬星狀病毒(PAstV)首次由Bridger(1980)在3周齡的小豬腹瀉糞樣中電鏡觀察到，隨后在日本和南非有報道在小豬腹瀉糞樣中檢測到星狀病毒。有學(xué)者認為星狀病毒是引起豬腹瀉的原因之一。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，StanislavIndik等在《VeterinaryMicrobiology》(獸醫(yī)微生物)2006年第117期276283頁發(fā)表了題為《Isolationandpartialcharacterizationofanovelporcineastrovirus》(一株新型豬星狀病毒的分離和部分基因結(jié)構(gòu)分析)一文，文中評述，目前的檢測豬星狀病毒含量的方法主要是聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、病毒分離(VI)。但是這些方法耗時長，而且存在容易交叉污染和操作過程繁瑣的缺點，檢測速度慢。T即man實時熒光定量RTPCR將PCR與熒光檢測相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)PCR費時、易污染、擴增后需電泳檢測和每次檢測的樣品數(shù)量少等缺點，可以對樣品中病毒含量進行準(zhǔn)確的定量檢測，具有簡單、易操作、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為病原體檢驗的重要方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法。本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明的方法包括如下步驟步驟一，以豬星狀病毒基因的保守片段SEQIDNO:1為靶目標(biāo)，設(shè)計引物和探針，擴增基因片段；步驟二，利用步驟一所得基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒；步驟三，提取樣品的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA;步驟四，按照常規(guī)熒光定量PCR檢測方法檢測樣品中的豬星狀病毒的含量。步驟一和步驟四中，擴增時所使用的引物為上游引物5，-TCCTTTTGTGGCTTTACTGTGAATG_3，，下游引物5'-ATGAAGGCAGAAAGCAACTGATAAC-3'。步驟一和步驟四中，擴增時使用的探針為5'-(FAM)TGTACCAACCCAGCCAGAGAAGCT(TAMRA)-3'。3步驟二中，所述重組載體使用的質(zhì)粒是pMD18-T。步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，PCR單個循環(huán)為95t:預(yù)變性3min;95。C變性10s，55。C退火40s，72。C延伸40s。步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，共40個PCR單個循環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果與RT-PCR相比，本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點；本發(fā)明的方法可以同時進行大量樣品的檢測，具有高通量性；與常規(guī)PCR相比，本發(fā)明的方法無需擴增后電泳分析，避免了PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險；本熒光定量PCR檢測方法具有檢測范圍廣的特點，在10°107拷貝范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢測范圍可以達到8個數(shù)量級。圖1為實施例中豬星狀病毒絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖；圖2為實施例中熒光定量PCR敏感性檢測的熒光信號圖；圖3為實施例中熒光定量PCR特異性檢測的熒光信號圖。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，設(shè)計引物和T叫man探針從基因數(shù)據(jù)庫中檢索獲得豬星狀病毒的基因組序列(GENBANK登錄號為AB037272和Y15938)，通過DNAstar軟件進行序列比對，得到豬星狀病毒基因組的特異性保守序列(SEQIDNO:1);通過primerexpress引物設(shè)計軟件和Primerprimer5.0軟件對該保守序列進行引物設(shè)計，得到一對引物特異性引物和一條T叫man探針，探針5'端熒光報告基團是FAM，3'端的熒光淬滅基團為TAMRA。引物和探針位于0RF2區(qū)域，目的擴增片段為155bp。上游引物5，-TCCTTTTGTGGCTTTACTGTGAATG-3';(SEQIDNO:2)下游引物5，-ATGAAGGCAGAAAGCAACTGATAAC-3，；(SEQIDNO:3)探針5'_(FAM)TGTACCAACCCAGCCAGAGAAGCT(TAMRA)-3，；(SEQIDNO:4)。步驟二，定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與制備定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建以提取的豬星狀病毒RNA為模板，應(yīng)用特異性下游引物(SEQIDNO:3)在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA，反應(yīng)條件為37°C5min，42。C延伸lh，86。C2min。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用上游引物(SEQIDNO:2)和下游引物(SEQIDNO:3)進行PCR反應(yīng)擴增含有靶序列(SEQIDN0:1)的基因片段，PCR反應(yīng)體系為2XPCRTaqMix25iU、上游引物(50iimol/L)0.5iU、下游引物(50ymol/L)0.5yl、cDNA模板4iU、無菌雙蒸水20iU，總反應(yīng)體系為50ii1。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性5min，94。C變性40s，55。C退火40s，72"延伸2min，34個循環(huán)，72t:延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取20iUPCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，通過膠回收純化目的片段，然后將目的片段與pMD18-T載體連接，將其轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，進行測序驗證。定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備定量重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用堿裂解法進行提純，根據(jù)紫外分光光度計測定0D260和0D280值計算質(zhì)粒濃度，并換算為質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)粒濃度(ug/ul)=0D260X稀釋倍數(shù)X50/1000;質(zhì)?？截悢?shù)=質(zhì)粒濃度X6.02X1023mol/1000M，M:代表質(zhì)粒分子量；步驟三，病毒的提取取3g待檢豬的糞便樣品加入無菌的1.5ml的EP管中，加入500y1PBS充分振蕩混勻，制成糞便懸液1.5ml，4t:，7500g離心10min后取上清；200iiL糞便懸液上清中加入lmlTrizol，充分混勻裂解，靜止10min;加入200iiL氯仿，劇烈振蕩30s，靜止3min;4°C，12000g離心10min后取上清，加入等體積的異丙醇，室溫靜止3min;4°C，12000g離心10min后棄上清，加入lml75%的乙醇洗滌沉淀一次；4°C，7500g離心5min后棄上清，沉淀室溫干燥；加入40iiLDEPC水，充分溶解沉淀后，放入-7(TC保存?zhèn)溆?；步驟四，樣品RNA的逆轉(zhuǎn)錄20iiL反應(yīng)體系提取的樣品RNA5iiL，5Xbuffer4iiL，下游引物(SEQIDNO:3)(50uM)0.5iiL，dNTP(10mM)2iiL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(100U/iiL)1iiL，RNaseinhibitor(40U/iiU1PL，DEPC水6.5iiL;反應(yīng)條件為37。C孵育5min，42。C延伸40min，86。C酶滅活10s;將獲得的cDNA產(chǎn)物用于熒光定量PCR檢測。步驟五，熒光定量PCR方法的建立和優(yōu)化(1)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對反應(yīng)體系中不同的Mg"、引物濃度、T叫man探針濃度、dNTP濃度等試驗結(jié)果進行比較，選擇反應(yīng)靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型S型擴增熒光信號曲線、擴增效率接近于1的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系采用三步法，95t:預(yù)變性3min;95。C變性10s，55t:退火40s，72。C延伸40s，40個循環(huán)。經(jīng)優(yōu)化后確定的25iiL最佳反應(yīng)體系為<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用無菌雙蒸水將定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋至8.7X107、8.7X106、8.7X105、8.7X104、8.7X103、8.7X102、8.7X101、8.7X10°copies/yL，用最佳體系進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性3min;94。C變性10s，55。C退火40s，72。C延伸40s，40個循環(huán)，檢測結(jié)束后熒光PCR儀自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。本檢測方法靈敏度可達到8.7個拷貝，在8.7X1008.7X1(fcopies/reaction范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其檢測范圍可達到8個數(shù)量級(圖2)。(3)特異性分析設(shè)定可能有潛在交叉反應(yīng)的病毒CDNA(人星狀病毒，輪狀病毒)為模板，按25iiL最佳反應(yīng)體系進行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系采用三步法，95t:預(yù)變性3min;95。C變性10s，55t:退火40s，72t:延伸40s，40個循環(huán)。結(jié)果顯示該檢測體系特異性良好，非目標(biāo)病毒核酸沒有擴增曲線而豬星狀病毒有良好的擴增曲線(圖3)。(4)穩(wěn)定性分析選取4個不同濃度的定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，分別進行批間重復(fù)檢測和批內(nèi)重復(fù)檢測，通過檢測其CT值的變異系數(shù)進行穩(wěn)定性的評價，變異系數(shù)在1%范圍內(nèi)認為是可靠的，那么從下表中可以看出批內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，所以可以判斷本檢測方法穩(wěn)定性良好。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(5)結(jié)果判定及病毒的定量進行熒光定量PCR時設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照為定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，陰性對照為滅菌水，若CT值小于30.O，且出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，則判定為陽性結(jié)果，表明檢測樣品中含有豬星狀病毒；若CT值大于35.0或無擴增信號，則判定為陰性結(jié)果，表明檢測樣品中沒有豬星狀病毒；若CT值在30.035.0之間，則判定為可疑結(jié)果，重復(fù)檢測一次，若仍在此范圍內(nèi)，則判定為陰性。陽性的樣品病毒定量，根據(jù)建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其病毒含量。計算公式為Y=10(-°36版+123";Y:樣品中病毒cDNA拷貝數(shù)X:樣品擴增CT值。通過計算公式可以得出待檢糞便樣品樣品中病毒cDNA含量為5.8Xl(f個拷貝。序列表〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法〈160>4〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>155〈212>DNA〈213〉豬星狀病毒〈400>1tccttttgtggctttectgtgaatgaaaatctegagcctgteccaacccagccagagaag60ctcatggccgccttgctcaaaccttecaaagtectecctgatttggaatcactccatggg120aaactcctgtgttetcagttgctttctgccttcat155〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tccttttgtggctttectgtgaatg25〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3atg朋ggC3g3朋gc朋ctgat朋c25〈210>4〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tgtaccaacccagccagagaagct2權(quán)利要求一種豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，以豬星狀病毒基因的保守片段SEQIDNO1為靶目標(biāo)，設(shè)計引物和探針，擴增基因片段；步驟二，利用步驟一所得基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒；步驟三，提取樣品的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；步驟四，按照常規(guī)熒光定量PCR檢測方法檢測樣品中的豬星狀病毒的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征是，步驟一和步驟四中，擴增時所使用的引物為上游引物5，-TCCTTTTGTGGCTTTACTGTGAATG-3，，下游引物5'-ATGAAGGCAGAAAGCAACTGATAAC-3'。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征是，步驟一和步驟四中，擴增時使用的探針為5'-(FAM)TGTACCAACCCAGCCAGAGAAGCT(TAMRA)-3'。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征是，步驟二中，所述重組載體使用的質(zhì)粒是pMD18-T。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征是，步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，PCR單個循環(huán)為95t:預(yù)變性3min;95。C變性10s，55。C退火40s，72。C延伸40s。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，其特征是，步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，共40個PCR單個循環(huán)。全文摘要一種檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
的豬星狀病毒的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟步驟一，以豬星狀病毒基因的保守片段SEQIDNO1為靶目標(biāo)，設(shè)計引物和探針，擴增基因片段；步驟二，利用步驟一所得基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒；步驟三，提取樣品的RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；步驟四，按照常規(guī)熒光定量PCR檢測方法檢測樣品中的豬星狀病毒的含量。本發(fā)明的方法具有靈敏性高、穩(wěn)定性高、可以定量，特異性好，假陽性低等特點。文檔編號C12Q1/70GK101705310SQ20091031022公開日2010年5月12日申請日期2009年11月23日優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日發(fā)明者華修國,單同領(lǐng),商曉桂,崔立,郭偉申請人:上海交通大學(xué)