專利名稱：攜帶輪狀病毒抗原表位的重組嵌合蛋白及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組嵌合蛋白，尤其是一種攜帶輪狀病毒抗原表位的重組嵌合蛋白及其制備，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
輪狀病毒(Rotavirus，簡稱RV)是嬰幼兒腹瀉的主要病原體。世界范圍內(nèi)每年大約有60多萬例RV感染患者死亡，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家。RV屬呼腸病毒科(Meoviridae)，輪狀病毒屬iRotavirus\ RV基因組由11個片段的雙鏈RNA組成，分別編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4, VP6和VP7)和6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。 根據(jù)RV組(亞組)抗原蛋白VP6的抗原性的不同，可將至今已發(fā)現(xiàn)的輪狀病毒RV分為A G七個組，A組是嬰幼兒腹瀉的主要病原體。根據(jù)病毒蛋白編碼框(ORF)核苷酸序列同源性差異，可將A組輪狀病毒RV的12個蛋白(基因)分為不同的基因型。根據(jù)RV基因型分類標(biāo)準(zhǔn)，A組輪狀病毒RV的結(jié)構(gòu)蛋白VP6至少可分為16個基因型(11-116型)。VP6蛋白由第6基因片段編碼，含397個氨基酸，分子量約為44. 8KDa。VP6蛋白是輪狀病毒RV中含量最豐富的蛋白，約占病毒總蛋白量的51%。RV內(nèi)殼中間層由260個致密的VP6蛋白三聚體共780個蛋白分子構(gòu)成。VP6蛋白具有重要的生物學(xué)功能，是病毒基因組轉(zhuǎn)錄和病毒組裝不可缺少的成分。VP6蛋白也具有重要的免疫學(xué)性質(zhì)。近年進(jìn)行的VP6蛋白免疫學(xué)研究表明，一些抗VP6蛋白的IgA單克隆抗體諸如7D9所產(chǎn)生的IgA具有保護(hù)作用，在SCID鼠中可清除其慢性RV病毒感染。一些研究表明VP6蛋白的抗病毒作用可能是通過IgA的分泌途徑而阻礙了病毒的復(fù)制循環(huán)過程，或作為一種黏膜的分泌型IgAJf RV感染的上皮細(xì)胞排除，從而起到保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)VP6蛋白分子中至少存在兩個Th細(xì)胞抗原表位和一個交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位。有研究表明在使用麥芽糖結(jié)合VP6蛋白對小鼠進(jìn)行黏膜免疫后，IFN- y被認(rèn)為是⑶4+T細(xì)胞分泌的唯一有效的抗RV的細(xì)胞因子。眾多的實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)VP6蛋白免疫后，在動物體內(nèi)確實(shí)能引起抗RV感染的作用。抗VP6蛋白單克隆抗體具有抑制病毒轉(zhuǎn)錄活性和保護(hù)小鼠免受病毒感染的作用。用重組表達(dá)的VP6蛋白免疫小鼠，也可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。VP6蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。由于VLPs沒有感染性，在研究細(xì)胞相互作用，開發(fā)診斷制劑和疫苗方面，具有更好的安全性。與單一分子的重組抗原相比，VLPs具有更好的免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于VLPs具有高密度的呈遞抗原表位，可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，是許多疫苗研制中很有前景的材料。至今所有已用于人體的輪狀病毒RV疫苗都是減毒活疫苗。1997年始用于人體的多價減毒重組活疫苗Rotashield因后來發(fā)現(xiàn)與腸套疊有關(guān)聯(lián)而在使用一年后即停止使用。2006年和2008年分別獲準(zhǔn)在人群中使用的5價重組減毒活疫苗RotaTeq和單價重組減毒活疫苗Rotarix現(xiàn)也已發(fā)現(xiàn)有豬環(huán)狀病毒DNA污染。Rotarix已在美國人群中停止使用，RotaTeq在人群中尚可正常使用。由于上述用于人類的RV疫苗存在腸套疊和其他病毒核酸污染等風(fēng)險，且都存在只能降低RV感染引起的死亡率和重癥腹瀉，不能完全保護(hù)RV感染的不足，在Rotarix停用后，RV感染率似有所提高。在尚無理想的治療輪狀病毒RV感染的藥物，以及輪狀病毒RV疫苗尚不十分理想的今天，進(jìn)一步研制更安全有效的新型輪狀病毒RV疫苗具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會價值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶有輪狀病毒P[4] 223抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶有輪狀病毒P [4] 56抗原表位的重組蛋白及其制 備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的又在于提供一種攜帶有輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的還在于提供一種攜帶有輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的再在于提供一種攜帶有輪狀病毒P [8] 296抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的還在于提供一種攜帶有輪狀病毒G2 [87]抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶有輪狀病毒P [4] 223、P [4] 56,Gl [142]、G4 [208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重組蛋白及其制備，以用作聯(lián)合重組嵌合疫苗。本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒P[4]223抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He Val
Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 223抗原表位的氨基酸序列為
Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒P[4]56抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile He AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 56抗原表位的氨基酸序列為
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val lie Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln lie lie Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys
其中，Gl[142]的氨基酸序列為Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
其中G4[208]的氨基酸序列為Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala
Asp0本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒P[8]296抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val G ln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala I Ie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys
其中，P[8] 296的氨基酸序列為
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。
本發(fā)明提供的攜帶輪狀病毒G2[87]抗原表位重組蛋白的氨基酸序列為
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnIle He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，G2[87]的氨基酸序列為
Ala Glu Ala Lys Asn Glu lie Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0本發(fā)明提供的攜帶有輪狀病毒P[4] 223、P[4]56，Gl [142]，G4[208]，P[8] 296 和G2 [87]抗原表位重組蛋白的氣基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys0本發(fā)明提供的攜帶有輪狀病毒P[4]223抗原表位的重組蛋白，攜帶有輪狀病毒P [4] 56抗原表位的重組蛋白，攜帶有輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白，攜帶有輪狀病毒G4 [208]抗原表位的重組蛋白，攜帶有輪狀病毒P [8] 296抗原表位的重組蛋白，攜帶有輪狀病毒G2[87]抗原表位的重組蛋白均通過下列步驟制備
1A、根據(jù)抗原表位氨基酸序列，分別設(shè)計下列引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；Gl[142]F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142] R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；
P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ； G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
IB、將步驟IA的各引物分別進(jìn)行下列配對
將VP4抗原表位P [4] 223的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈P [4] 223F和負(fù)鏈P[4]223R 配成引物對P[4]223F/P[4]223R ；
將VP4抗原表位P [4] 56的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈P [4] 56F和負(fù)鏈P[4]56R配成引物對P[4]56F/P[4]56R ；
將VP7抗原表位Gl [142]的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈Gl [142]F和負(fù)鏈Gl [142]R 配成引物對G1[142]F/G1[142]R；
將VP7抗原表位G4 [208]的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈G4 [208] F和負(fù)鏈G4 [208]R 配成引物對G4[208]F/G4[208]R ；
將VP4抗原表位P8 [296]的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈P8 [296]F和負(fù)鏈P8 [296]R 配成引物對P8[296]F/P8[296]R ；
將VP7抗原表位G2 [87]的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈G2 [87]F和負(fù)鏈G2 [87] R配成引物對G2[87]F/ G2[87]R；
IC、將步驟IB的各引物對分別在下列條件下進(jìn)行退火，退火混合液中分別含有2yl的正向引物，2iU的反向引物，以及7iU的PCR緩沖液和59 ill的水；將退火混合液于65°C水浴反應(yīng)5分鐘后，再于37°C水浴反應(yīng)45分鐘，反應(yīng)體系中加入400 U I的TE，并與等體積異丙醇充分混勻，室溫放置10分鐘后，4°C，15，OOOrpm離心15min，沉淀用質(zhì)量濃度為75%的乙醇漂洗，干燥后，用IOiU的TE溶解；分別得到在5’端和3’端分別帶Sac I位點(diǎn)，或者BspT104 I位點(diǎn)，或者Kpn I位點(diǎn)，或者Bln I位點(diǎn)、或者Sac II位點(diǎn)，或者Xho I位點(diǎn)的下列六條互補(bǔ)雙鏈P[4]223互補(bǔ)雙鏈、P [4] 56互補(bǔ)雙鏈、Gl [142]互補(bǔ)雙鏈、G4 [208]互補(bǔ)雙鏈、P [8] 296互補(bǔ)雙鏈、G2 [87]互補(bǔ)雙鏈
ID、將攜帶有SacI位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn I位點(diǎn)、Bln I位點(diǎn)、Sac II位點(diǎn)及XhoI位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F，在下列條件下分別用Sac I，BspT104 I, Kpn I, Bln I, Sac II，Xho I 酶切酶切混合液分別含 3 的 Sac I, BspT104I, Kpn I, Bln I, Sac II 或 Xho I 內(nèi)切酶(15U)，以及 10 y I 的 pETP6F DNA, 7 U I 的 IOX緩沖液，50 Ul的水；將酶切混合液于37°C水浴反應(yīng)3小時，分別得六條下列酶切質(zhì)粒片段Sac I酶切質(zhì)粒片段、BspT104 I酶切質(zhì)粒片段、Kpn I酶切質(zhì)粒片段、Bln I酶切質(zhì)粒片段、Sac II酶切質(zhì)粒片段、Xho I酶切質(zhì)粒片段，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化所得六條帶有不同切口的酶切質(zhì)粒片段；
IE、將步驟ID所得六個酶切質(zhì)粒片段分別與步驟IC所得六個互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行如下相應(yīng)的配對Sac I酶切質(zhì)粒片段/P[4]223互補(bǔ)雙鏈；
BspT104 I酶切質(zhì)粒片段/P [4] 56互補(bǔ)雙鏈；
Kpn I酶切質(zhì)粒片段/Gl [142]互補(bǔ)雙鏈；
Bln I酶切質(zhì)粒片段/G4 [208]互補(bǔ)雙鏈；
Sac II酶切質(zhì)粒片段/P[8] 296互補(bǔ)雙鏈；
Xho I酶切質(zhì)粒片段/G2 [87]互補(bǔ)雙鏈；
將上述配對的各片段分別與T4 DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，分別 得到下列六個重組質(zhì)粒
在Sac I位點(diǎn)攜帶有P4[223]抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F174S/P [4] 223 ；
在BspT104 I位點(diǎn)攜帶有P [4] 56抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P [4] 56 ；
在Kpn I位點(diǎn)攜帶有Gl [142]抗原表位基因的重組質(zhì)粒PETP6F/G1 [142]；
在Bln I位點(diǎn)攜帶有G4 [208]抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/G4 [208]；
在Sac II位點(diǎn)攜帶有P[8]296抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P[8]296 ；
在Xho I位點(diǎn)攜帶有G2 [87]抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/G2[87]；
IF、將步驟IE得到的六個重組質(zhì)粒，在下列條件下分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞
10u I的步驟IE的對應(yīng)重組質(zhì)粒與100 u I BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30分鐘，42°C放置70秒鐘，加入500 u I LB培養(yǎng)液后，在37°C培養(yǎng)30分鐘，培養(yǎng)物涂在含200 u g/ml氨節(jié)青霉素的I. 5%瓊脂培養(yǎng)板,培養(yǎng)板于37°C培養(yǎng)14個小時,挑取單個菌落放入含200 u g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)和表達(dá)，分別得到
攜帶P4[223]抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[4]223 ；
攜帶P [4] 56抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[4]56 ；
攜帶Gl [142-152]抗原表位的重組蛋白rVP6F/Gl[142]；
攜帶G4[208-221]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G4[208]；
攜帶P[8] 296抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[8] 296 ；
攜帶/G2[87]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G2[87]。本發(fā)明提供的同時攜帶有 P [4] 223、P [4] 56,Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位的重組蛋白通過下列步驟制備
2A、同上述IA ；
2B、同上述IB ；
2C、同上述IC ；
2D、同上述ID ；
2E、同上述IE ；
2F、將步驟2E所得重組質(zhì)粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104 I酶切，并與步驟2C所得的在5’端和3’端分別帶BspT104 I位點(diǎn)的P[4]56互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4[223]和P [4] 56抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P[4]223/P[4]56 ；
2G、將步驟2F所得重組質(zhì)粒pETP6F/P[4]223/P[4]56用Kpn I酶切，并與步驟2C所得的在5’端和3’端分別帶Kpn I位點(diǎn)的Gl [142]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)和Kpn I位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4 [223]、P [4] 56和Gl [142]抗原表位基因的重組質(zhì)粒 pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142]；
211、將步驟26所得重組質(zhì)粒？￡了 6 / [4]223/ [4]56/61[142]用Bln I酶切，并與步驟2C所得的在5’端和3’端分別帶Bln I位點(diǎn)的G4[208]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac
I、BspT104 I, Kpn I 和 Bln I 位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的 P4[223]、P[4] 56、Gl [142]和 G4[208]抗原表位基因的重組質(zhì)粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/ G4[208]；
21、將步驟 2H 所得重組質(zhì)粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/G4[208]用 Sac II 酶切，并與步驟2C所得的在5’端和3’端分別帶Sac II位點(diǎn)的P[8]296互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在 Sac I、BspT104 I、Kpn I、Bln I 和 Sac II 位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的 P4[223]、P[4]56、Gl [142], G4 [208]和P [8] 296抗原表位基因的重組質(zhì)粒
PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296 ；
2J、將步驟 21 所得重組質(zhì)粒 pETP6F/P[4] 223/P[4] 56/G1 [142]/G4[208]/P[8] 296 用Xho I酶切，并與步驟2C所得的在5’端和3’端分別帶Xho I位點(diǎn)的G2[87]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I、BspT104 I,Kpn I,Bln I,Sac II和Xho I位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4[223]、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296、G2[87]抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142] /G4 [208] /P [8] 296/G2 [87];按常規(guī)將該重組質(zhì)粒經(jīng)菌體轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定；
2K、將步驟2J得到重組質(zhì)粒，在與IF相同的條件下轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞得到攜帶有不同抗原表位的下列重組蛋白
攜帶有 P[4] 223，P[4] 56，Gl [142]，G4[208], P[8] 296 和 G2[87]抗原表位的重組蛋白rVP ⑥ R。所述步驟ID或2D的攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn I位點(diǎn)、Bln I位點(diǎn)、Sac II位點(diǎn)及Xho I位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F通過下列步驟構(gòu)建
I)人工設(shè)計下列引物對
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；2)以輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白編碼基因?yàn)槟０?，以下列為引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具體是
在PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)混合液體積為100 ill，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR緩沖液 IOii I，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物對PETL5/P174R和 P174F/PVP6-3，其余用水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C變性40s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸反應(yīng)lmin，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;得到帶有NdeI和Sac I位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增片段6174F和帶有Sac I和BamH I位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增片段6174R ;用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該擴(kuò)增片段；將PCR擴(kuò)增片段6174F和6174R分別用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 雙酶切，即
A、6174F酶切片段制備酶切反應(yīng)體系為3iil的6174 片段，311的NdeI (15U)，3iU的Sac I (15U),8u I的IOX緩沖液，63 yl的水；將酶切混合液分別于37°C水浴反應(yīng)3小時后，得酶切片段，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I雙酶切外，6174R酶切片段制備與6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的連接將6174F和6174R酶切片段與T4DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)(gagctc)的VP6編碼基因
3)運(yùn)用步驟2)的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步驟2)獲得的攜帶有Sac I位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)的VP6編碼基因；
4 )用與步驟2 )相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步驟3)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)及Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)的VP6編碼基因;
5)用與步驟2)相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步驟4)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)及Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Bln I (cctagg)位點(diǎn)，得到攜帶有 Sac I 位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)及 Bln I (cctagg)位點(diǎn)的 VP6編碼基因；
6 )用與步驟2 )相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步驟5)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)及Bln I (cctagg)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)，得到攜帶有 Sac I 位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)、Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)及Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)的VP6編碼基因；7)、用與步驟2)相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步驟6)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)、Bln I (ccgcgg)位點(diǎn)及 Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Xho I (ctcgag)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、KpnI (ggtacc)位點(diǎn)、Bln I (ccgcgg)位點(diǎn)、Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)及 Xho I (ctcgag)位點(diǎn)的VP6載體蛋白編碼基因，該VP6F載體蛋白編碼基因由1146個核苷酸組成，前端為編碼蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2個終止密碼子(TGA TAA)組成，其核苷酸序列為
I atggatgttt tgtattcat t atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa 501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcRaacat acagcaattt 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg 701 atRRtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcRcagcact CRaRcatcat 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac 1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg 1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg 1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、將步驟7)得到的VP6載體蛋白編碼基因用常規(guī)的基因克隆和重組技術(shù)，連接到pET表達(dá)質(zhì)粒DNA的Nde I/BamH I位點(diǎn)，得到攜帶VP6F載體蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET6F。所述步驟2 )的輪狀病毒TB-Chen株為公知的病毒株。本發(fā)明具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案獲得的各個攜帶輪狀病毒不同抗原表位的重組嵌合蛋白，經(jīng)免疫學(xué)Western Blot檢測，所述各個重組嵌合蛋白均能與抗輪狀病毒全病毒，抗輪狀病毒的VP6和抗相應(yīng)輪狀病毒的VP4/VP7抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。說明上述各個重組表達(dá)的重組嵌合蛋白具有VP6載體蛋白和所插入的輪狀病毒抗原表位的良好的免疫反應(yīng)性，且不具有傳染性，沒有毒力返祖和腸套疊等副作用，對進(jìn)一步開發(fā)輪狀病毒RV重組嵌合疫苗，具有較高的應(yīng)用價值。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I
通過下列步驟構(gòu)建攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn I位點(diǎn)、Bln I位點(diǎn)、SacII位點(diǎn)及Xho I位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F
1)人工設(shè)計下列引物對
P174F CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG ；
P174R CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA ；
P197F GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT ；
P197R TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC ；
P244F GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA ；
P244R ； TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；
P275F GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；
P275R AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；
P298F AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA ；
P298R GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA ；
P308F GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA ；
P308R ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG ；
以及下列引物
PETL5 ATCATATGGAGGTTCTGTACTC ；
PVP6-3 TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT ；
2)以公知的輪狀病毒TB-Chen株VP6蛋白編碼基因?yàn)槟０?，以下列為引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PETL5/P174R 和 P174F/PVP6-3 ；
PETL5/P197R 和 P197F/PVP6-3 ；
PETL5/P244R 和 P244F/PVP6-3 ；
PETL5/P275R 和 P275F/PVP6-3 ；
PETL5/P298R 和 P298F/PVP6-3 ；
PETL5/P308R 和 P308F/PVP6-3 ；
具體是
在PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)混合液體積為100 ill，包含30ng模板DNA，I X IO5 pmol的dNTPs, IOX PCR緩沖液 IOii I，5U Taq DNA聚合酶，60pmol 的引物對PETL5/P174R和P174F/PVP6-3，其余用水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C變性40s，56°C復(fù)性30s，72°C延伸反應(yīng)lmin，共40個循環(huán)，最后72°C延伸10 min ;得到帶有NdeI和Sac I位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增片段6174F和帶有Sac I和BamH I位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增片段6174R ;用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該擴(kuò)增片段；將PCR擴(kuò)增片段6174F和6174R分別用Nde I/Sac I 和 Sac I/BamH I 雙酶切，即
A、6174F酶切片段制備酶切反應(yīng)體系為3iil的6174 片段，311的Nde I (15U)，3iU的Sac I (15U),8u I的IOX緩沖液，63 yl的水；將酶切混合液分別于37°C水浴反應(yīng)3小時后，得酶切片段，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化該酶切片段；
B、除使用SacI/BamH I雙酶切外，6174R酶切片段制備與6174F酶切片段相同；
C、酶切片段的連接將6174F和6174R酶切片段與T4DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)(gagctc)的VP6編碼基因
3)運(yùn)用步驟2)的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P197R和P197F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/BspT104 I和BspT104 I/BamH I，在步驟2)獲得的攜帶有Sac I位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入BspT104 I (ttcgaa)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)的VP6編碼基因；
4)用與步驟2 )相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P244R和P244F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Kpn I和Kpn I/BamH I，在步驟3)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)及Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)的VP6編碼基因;
5)用與步驟2)相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P275R和P275F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Bln I和Bin I/BamH I，在步驟4)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)及Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Bln I (cctagg)位點(diǎn)，得到攜帶有 Sac I 位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)及 Bln I (cctagg)位點(diǎn)的 VP6編碼基因；
6 )用與步驟2 )相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P298R和P298F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Sac II和Sac I I/BamH I，在步驟5)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)及Bln I (cctagg)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)，得到攜帶有 Sac I 位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)、SacII (ccgcgg)位點(diǎn)及Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)的VP6編碼基因；
7)、用與步驟2)相同的PCR擴(kuò)增、酶切和連接，使用對應(yīng)的PETL5/P308R和P308F/PVP6-3引物對及內(nèi)切酶Nde I/Xho I和Xho I/BamH I，在步驟6)所得攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (ggtacc)位點(diǎn)、Bln I (ccgcgg)位點(diǎn)及 Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)的VP6編碼基因上插入Xho I (ctcgag)位點(diǎn)，得到攜帶有Sac I位點(diǎn)、BspT104 I位點(diǎn)、Kpn
I(ggtacc)位點(diǎn)、Bln I (ccgcgg)位點(diǎn)、Sac II (ccgcgg)位點(diǎn)及 Xho I (ctcgag)位點(diǎn)的VP6載體蛋白編碼基因，該VP6F載體蛋白編碼基因由1146個核苷酸組成，前端為編碼蛋氨酸(M)的起始秘密子ATG，末端由2個終止密碼子(TGA TAA)組成，其核苷酸序列為
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa 51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa、501 tagatcacaa cctgcgcatg_agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcgcagcact cgagcatcat901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa
8)、將步驟7)得到的VP6載體蛋白編碼基因用常規(guī)的基因克隆和重組技術(shù)，連接到pET表達(dá)質(zhì)粒DNA的Nde I/BamH I位點(diǎn)，得到攜帶VP6F載體蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒pET6F。
實(shí)施例2
本發(fā)明提供的攜帶有P[4]223抗原表位的重組蛋白通過下列步驟制備
A、根據(jù)抗原表位氨基酸序列，設(shè)計下列引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
B、將步驟A的引物進(jìn)行下列配對
將VP4抗原表位P [4] 223的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈P [4] 223F和負(fù)鏈P[4]223R 配成引物對P[4]223F/ P[4]223R ；
C、將步驟B的引物對在下列條件下進(jìn)行退火，退火混合液中含有2iU的正向引物，
2Ul的反向引物，以及7 ill的PCR緩沖液和59 u I的水；將退火混合液于65°C水浴反應(yīng)5分鐘后，再于37°C水浴反應(yīng)45分鐘，反應(yīng)體系中加入400 ii I的TE，并與等體積異丙醇充分混勻，室溫放置10分鐘后，4°C，15，OOOrpm離心15min，沉淀用質(zhì)量濃度為75%的乙醇漂洗，干燥后，用10 Ul的TE溶解；得到在5’端和3’端分別帶Sac I位點(diǎn)的互補(bǔ)雙鏈P[4]223互補(bǔ)雙鏈；
D、將攜帶有SacI位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒pETP6F，在下列條件下用Sac I酶切酶切混合液含3 ill的Sac I內(nèi)切酶(15U)，以及10 的pETP6FDNA,7u I的IOX緩沖液，50iU的水；將酶切混合液于37°C水浴反應(yīng)3小時，得酶切質(zhì)粒片段Sac I酶切質(zhì)粒片段、用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離和純化所得酶切質(zhì)粒片段；
E、將步驟D所得酶切質(zhì)粒片段與步驟C所得互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行如下相應(yīng)的配對
Sac I酶切質(zhì)粒片段/P [4] 223互補(bǔ)雙鏈；
將配對的Sac I酶切質(zhì)粒片段/P[4]223互補(bǔ)雙鏈與T4 DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，得到在Sac I位點(diǎn)攜帶有P4[223] 抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F174S/P[4]223 ；
F、將步驟E得到的重組質(zhì)粒pETP6F174S/P[4]223，在下列條件下轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞=IOiIl的重組質(zhì)粒pETP6F174S/P[4]223與IOOiIl的BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30分鐘，42 °C放置70秒鐘，加入500 的LB培養(yǎng)液后，在37°C培養(yǎng)30分鐘，培養(yǎng)物涂含有200 u g/ml氨芐青霉素的I. 5%瓊脂培養(yǎng)板，于37°C培養(yǎng)14個小時，挑取單個菌落放入含200 u g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)和表達(dá)，得到攜帶有P [4] 223抗原表位的重組蛋白rVP6/P[4]223。實(shí)施例3 A、引物設(shè)計為
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；
B、引物配對為將￥ 4抗原表位？[4]56的兩條人工合成的寡核苷酸即正鏈P[4]56F和負(fù)鏈P[4]56R配成引物對P[4]56F/P[4]56R ；
C、同實(shí)施例2
D、將攜帶有BspT104I位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F，在與實(shí)施例2步驟D相同條件下用BspT104 I位點(diǎn)酶切，得酶切質(zhì)粒片段BspT104 I酶切質(zhì)粒片段；
E、將步驟D所得酶切質(zhì)粒片段與步驟C所得互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行如下相應(yīng)的配對
BspT104 I酶切質(zhì)粒片段/P [4] 56互補(bǔ)雙鏈；
將配對的BspT104 I酶切質(zhì)粒片段/P [4] 56互補(bǔ)雙鏈與T4 DNA連接酶及緩沖液混合后，在18°C連接反應(yīng)6h，得到在BspT104 I位點(diǎn)攜帶有P[4] 56抗原表位基因的重組質(zhì)粒PETP6F/P[4]56 ；
F、將步驟E得到的重組質(zhì)粒pETP6F/P[4]56在與實(shí)施例2步驟F相同的條件下轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到攜帶有P[4]56抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[4]56。實(shí)施例4 除引物為
Gl[142]F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142] R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
酶切時將攜帶有Kpn I (RRtacc)位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F，用Kpn I酶切外，其余均同實(shí)施例2，得到攜帶Gl [142]抗原表位的重組蛋白rVP6F/Gl[142]。實(shí)施例5 除引物為
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
酶切時將攜帶有Bin I (ccrcrr)位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F，用Bln I酶切外，其余均同實(shí)施例2，得到攜帶G4 [208]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G4[208]。實(shí)施例6 除引物為
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；
酶切時將攜帶有P [8] 296位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒pETP6F，用Sac II酶切外，其余均同實(shí)施例2，得到攜帶P[8] 296抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[8]296。實(shí)施例7
除引物為
G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ； G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
酶切時將攜帶有G2 [87]位點(diǎn)的重組輪狀病毒VP6載體蛋白編碼基因的質(zhì)粒PETP6F，用Xho I酶切外，其余均同實(shí)施例2，得到攜帶G2[87]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G2[87]。實(shí)施例8
攜帶有 P [4] 223、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位的重組蛋白通過下列步驟制備
A、同實(shí)施例2步驟A;
B、同實(shí)施例2步驟B;
C、同實(shí)施例2步驟C;
D、同實(shí)施例2步驟D;
E、同實(shí)施例2步驟E;
F、將步驟E所得重組質(zhì)粒pETP6F174S/P[4]223用BspT104I酶切，并與步驟C所得的在5’端和3’端分別帶BspT104 I位點(diǎn)的P [4] 56互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I位點(diǎn)和BspT104 I位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4[223]和P[4] 56抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P[4]223/P[4]56 ；
G、將步驟F所得重組質(zhì)粒pETP6F/P[4] 223/P [4] 56用Kpn I酶切，并與步驟C所得的在5’端和3’端分別帶Kpn I位點(diǎn)的Gl [142]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I位點(diǎn)、BspT104I位點(diǎn)和Kpn I位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4[223]、P [4] 56和Gl [142]抗原表位基因的重組質(zhì)粒PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]；
!1、將步驟6所得重組質(zhì)粒？￡了 6 / [4]223/ [4]56/61[142]用Bln I酶切，并與步驟C所得的在5’端和3’端分別帶Bln I位點(diǎn)的G4[208]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在Sac I、BspT104 I, Kpn I 和 Bln I 位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的 P4[223]、P[4]56、Gl [142]和 G4[208]抗原表位基因的重組質(zhì)粒 pETP6F/P[4]223/P[4]56/Gl[142]/ G4[208]；
1、將步驟!1所得重組質(zhì)粒？￡1 6 / [4]223/ [4]56/61[142]/64[208]用 Sac II 酶切，并與步驟C所得的在5’端和3’端分別帶Sac II位點(diǎn)的P[8]296互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在 Sac I、BspT104 I,Kpn I,Bln I 和 Sac II 位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的P4[223]、P[4] 56、G1 [142]、G4[208]和P [8] 296抗原表位基因的重組質(zhì)粒
PETP6F/P[4]223/P[4]56/G1[142]/G4[208]/P[8]296 ；
J、將步驟 I 所得重組質(zhì)?？凇? 6 / [4]223/ [4]56/61[142]/64[208]/ [8]296 用父110I酶切，并與步驟C所得的在5’端和3’端分別帶Xho I位點(diǎn)的G2[87]互補(bǔ)雙鏈進(jìn)行連接，得到在 Sac I、BspT104 I, Kpn I, Bln I, Sac II 和 Xho I 位點(diǎn)攜帶有對應(yīng)的 P4[223]、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296、G2[87]抗原表位基因的重組質(zhì)粒pETP6F/P [4] 223/P [4] 56/G1 [142] /G4 [208] /P [8] 296/G2 [87]；按常規(guī)將該重組質(zhì)粒經(jīng)菌體轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后，進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定；
K、將步驟J得到的重組質(zhì)粒，在與實(shí)施例2步驟F相同的條件下轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到攜帶有P [4] 223，P [4] 56，Gl [142]，G4 [208]，P [8] 296和G2 [87]抗原表位的重組蛋白rVP6F⑥R。本發(fā)明所得各個攜帶輪狀病毒不同抗原表位的重組嵌合蛋白，經(jīng)下列免疫學(xué)Western Blot 檢測
1)將攜帶有輪狀病毒P[4] 223抗原表位的重組蛋白rVP6/P [4] 223，攜帶有輪狀病毒P[4] 56抗原表位的重組蛋白1^ 6 外[4]56，攜帶有輪狀病毒61[142]抗原表位的重組蛋白rVP6F/Gl[142]，攜帶有輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G4 [208]，攜帶有輪狀病毒P [8] 296抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[8]296，攜帶有輪狀病毒G2[87]抗原表位的重組蛋白 rVP6F/G2[87]，和同時攜帶 P[4]223、P[4]56、Gl [142]、G4[208]、P[8]296 和G2[87]六個抗原表位的重組蛋白rVP6F⑥R，以及用作對照的重組輪狀病毒NSP2蛋白和用作對照的牛血清白蛋白，各取g分別溶于20iU水，分別加入5iU 5X變性緩沖液，混勻后，在100。。變性5min ；
2)將上述I)的變性蛋白樣品分別用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%SDS-PAGE)分離，并在電壓15V、電流50mA的條件下，電泳轉(zhuǎn)印25 min,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；將膜置于含5%脫脂奶粉的PBS/T液中于4° C封閉過夜；
3)用PBS/T洗膜5次，分別加入抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體(5%脫脂奶粉1:400稀釋)，或抗重組輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，或抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，或抗重組輪狀病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，或抗重組輪狀病毒VP7蛋白豚鼠免疫血清抗體(1%脫脂奶粉1:400稀釋)，于37°C孵育I. 5 h ;用PBS/T液洗膜5次，每次
5min ；
4)加入HRP標(biāo)記的羊抗豚鼠IgG(1:2，000如上稀釋)，于371孵育I h ;用PBS/T漂洗5次，DAB顯色；顯色后，用蒸餾水漂洗膜，終止顯色，觀察并分析結(jié)果如下
攜帶有輪狀病毒P [4] 223抗原表位的重組蛋白rVP6/P [4] 223，攜帶有輪狀病毒P [4] 56抗原表位的重組蛋白1^ 6 外[4]56，攜帶有輪狀病毒61[142]抗原表位的重組蛋白rVP6F/Gl [142]，攜帶有輪狀病毒G4 [208]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G4 [208]，攜帶有輪狀病毒P[8]296抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[8]296，攜帶有輪狀病毒G2[87]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G2 [87]，均能與抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，均能與抗輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，不能與抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。攜帶有輪狀病毒P[4]223抗原表位的重組蛋白rVP6/P[4]223，攜帶有輪狀病毒P [4] 56抗原表位的重組蛋白rVP6F/P [4] 56，和攜帶有輪狀病毒P [8] 296抗原表位的重組蛋白rVP6F/P[8]296，均能與輪狀病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。攜帶有輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白rVP6F/Gl[142]，攜帶有輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G4[208]，攜帶有輪狀病毒G2[87]抗原表位的重組蛋白rVP6F/G2[87]，均能與輪狀病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。、
同時攜帶P [4] 223、P [4] 56、Gl [142]、G4 [208]、P [8] 296 和 G2 [87]六個抗原表位的重組蛋白rVP6F⑥R，能與抗輪狀病毒全病毒豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，能與抗輪狀病毒VP6蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，能與輪狀病毒VP4蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，能與輪狀病毒VP7蛋白免疫豚鼠血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，不能與抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠免疫血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。用作陰性對照的重組輪狀病毒NSP2蛋白只能 與抗重組輪狀病毒NSP2蛋白豚鼠血清抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。用作陰性對照的牛血清白蛋白，不能與上述所有檢測抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。結(jié)論上述所有的重組嵌合蛋白均具有載體蛋白和所攜帶的抗原表位特異的抗原反應(yīng)性。序列表
攜帶輪狀病毒P[4]223抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val LysP [4] 223抗原表位的氨基酸序列
Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
攜帶輪狀病毒P [4] 56抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn lie Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln lie lie AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys
P [4] 56抗原表位的氨基酸序列
Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。攜帶輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val LysGl [142]的氨基酸序列Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。攜帶輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
G4[208]的氨基酸序列Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val Ala Asp0攜帶輪狀病毒P [8] 296抗原表位的重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu ValLys
P [8] 296的氨基酸序列
Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala。攜帶輪狀病毒G2 [87]抗原表位重組蛋白的氨基酸序列 Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnIle He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys
G2[87]的氨基酸序列
Ala Glu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0攜帶有輪狀病毒P [4] 223、P [4] 56，Gl [142]，G4 [208]，P [8] 296 和 G2 [87]抗原表位重組蛋白的氨基酸序列
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro lie GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His lie Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys0
引物
P[4]223F CCCACCAATTCAAAATACTAGAAATGTAGTTCCAGAGCT ；
P[4]223R CTGGAACTACATTTCTAGTATTTTGAATTGGTGGGAGCT ；
P[4]56F CGAATGATTCAACTACAGTGGAACCAGTTTTAGATGGTCCTTATCAACCTT ；
P[4]56R CGAAGGTTGATAAGGACCATCTAAAACTGGTTCCACTGTAGTTGAATCATT ；
Gl[142] F CATGAAATATGACCAAAGTCTTAAATTAGATATGGGTAC ；
Gl[142]R CCATATCTAATTTAAGACTTTGGTCATATTTCATGGTAC ；
G4[208]F CTAGGCAAACGACAAATACAGCTACTTTTGAAACAGTTGCTGATC ；
G4[208]R CTAGGATCAGCAACTGTTTCAAAAGTAGCTGTATTTGTCGTTTGC ；
P[8] 296F GGAAGGCAGCAAATTATCAATATAATTACTTACGTGACGGTGAACAAGTAACCGCACCGC ；
P[8] 296R GGTGCGGTTACTTGTTCACCGTCACGTAAGTAATTATATTGATAATTTGCTGCCTTCCGC ；G2[87]F TCGAGGCAGAAGCTAAAAATGAGATTTCAGATGATGAATGGGAAAATACTC ；
G2[87]R TCGAGAGTATTTTCCCATTCATCATCTGAAATCTCATTTTTAGCTTCTGCC ；
攜帶有 Sac I 位點(diǎn)、BspT104 I 位點(diǎn)、Kpn I (RRtacc)位點(diǎn)、Bin I (ccrcrr)位點(diǎn)、Sac
II(ccrcrr)位點(diǎn)及Xho I (ctcRaR)位點(diǎn)的VP6載體蛋白編碼基因的核苷酸序列:
I atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg301gttagagaatcacaaagaaacggaattgcaccgcagtcagaatcacttag
351aaaactatcagggattaagtttaaaagaataaattttgacaattcgtcgg
401aatacatagaaaactggaacttgcaaaatagaagacaaagaactggtttt
451acatttcataaaccaaacatctttccatattcagcttcatttacgttaaa
501tagatcacaacctgcgcatg_agctcatgggtacaatgtggttgaatgcag
551gttcagagattcaagttgctggatttgattattcgaacatacagcaattt
601gagcatatagttcagctccgtagggtgttaacgacggctacaataactct
651tttaccagatgctgaaaggtttagtttccctagagtaattaattcagctg
701atggtaccacatggtattttaatccagtaatacttagaccgaataatgtc
751gaagtagaatttctattgaatggacagataataaatacttatcaggcacc
801taggtttggtacaattgtagctagaaattttgatactattagattatcat
851ttcaattgatgagaccgcggaccccatcagtcgcagcactcgagcatcat
901gctactgtaggactaacattacgcattgaatctgcaatttgtgagtcagt
951gcttgctgatgctagtgaaacaatgttagctaatgtaacatctgttagac
1001aagaatatgcaataccagttgggccagtttttccaccaggtatgaattgg
1051actgatttgattactaactactcaccatctagagaggataatttacaacg
1101tgtgtttacagtagcttccattagaagcatgcttgttaaatgataa。
權(quán)利要求
1.一種攜帶輪狀病毒P[4]223抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為 Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln LeuArg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser PhePro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P[4] 223抗原表位的氨基酸序列為Leu Pro Pro He Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro。
2.一種攜帶輪狀病毒P[4]56抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser ThrThr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu HisHe Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala GluArg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn ProVal He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He AsnThr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg LeuSer Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala lie Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，P [4] 56抗原表位的氨基酸序列為Asn Asp Ser Th r Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro。
3.一種攜帶輪狀病毒Gl [142]抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys TyrAsp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu ArgPro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln AlaPro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln LeuMet Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu ThrLeu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met LeuAla Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He Pro Val Gly Pro Val Phe Pro ProGly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu GlnArg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu Val Lys 其中，Gl[142]的氨基酸序列為Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met。
4.一種攜帶輪狀病毒G4[208]抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val lie Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr ValAla Asp Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie Arg Leu Ser PheGln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys 其中G4[208]的氨基酸序列為Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Thr Val AlaAsp。
5.一種攜帶輪狀病毒P[8]296抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn He Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr He Val Ala Arg Asn Phe Asp ThrHe Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn TyrLeu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu HisHis Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu AlaAsp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala He ProVal Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser ProSer Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser He Arg Ser Met Leu ValLys 其中，P[8] 296的氨基酸序列為Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala0
6.一種攜帶輪狀病毒G2[87]抗原表位的重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列為Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu lie Gln Gln Phe Asn Gln Met lie lieThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly lie Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr lie Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn lie Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr MetTrp Leu Asn Ala Gly Ser Glu He Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn lie Gln GlnPhe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr lie Thr Leu Leu ProAsp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val He Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp TyrPhe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly GlnHe He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr He Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu AlaGlu Ala Lys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala ThrVal Gly Leu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala SerGlu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly ProVal Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu lie Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg GluAsp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys其中，G2[87]的氨基酸序列為Ala Glu Ala Lys Asn Glu lie Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr0
7. 一種同時攜帶有輪狀病毒 P[4]223、P[4]56，Gl [142], G4[208]，P[8]296 和 G2[87]抗原表位重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys He ValGlu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu He Gln Gln Phe Asn Gln Met He IleThr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly He Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn TrpSer Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val GluThr Ala Arg Asn Thr He Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp GluMet Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly He Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys LeuSer Gly He Lys Phe Lys Arg He Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr He Glu Asn TrpAsn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn He Phe ProTyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Pro Pro He GlnAsn Thr Arg Asn Val Val Pro Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser GluHe Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu AspGly Pro Tyr Gln Pro Ser Asn He Gln Gln Phe Glu His He Val Gln Leu Arg Arg ValLeu Thr Thr Ala Thr He Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg ValHe Asn Ser Ala Asp Gly Thr Met Lys Tyr Asp Gln Ser Leu Lys Leu Asp Met Gly ThrThr Trp Tyr Phe Asn Pro Val He Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu LeuAsn Gly Gln He He Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Gln Thr Thr Asn Thr Ala Thr PheGlu Thr Val Ala Asp Pro Arg Phe Gly Thr lie Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr lie ArgLeu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr Leu ArgAsp Gly Glu Gln Val Thr Ala Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu Ala Glu AlaLys Asn Glu He Ser Asp Asp Glu Trp Glu Asn Thr Leu Glu His His Ala Thr Val GlyLeu Thr Leu Arg He Glu Ser Ala He Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu ThrMet Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala lie Pro Val Gly Pro Val PhePro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu He Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp AsnLeu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser lie Arg Ser Met Leu Val Lys0全文摘要
本發(fā)明提供一種攜帶輪狀病毒抗原表位的重組嵌合蛋白及其制備，分別是攜帶有輪狀病毒P[4]223，P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296、G2[87]抗原表位的六個重組蛋白，以及同時同時攜帶有P[4]223、P[4]56、G1[142]、G4[208]、P[8]296和G2[87]抗原表位的重組蛋白，經(jīng)免疫學(xué)WesternBlot檢測，所述各個重組嵌合蛋白均能與抗輪狀病毒全病毒，抗輪狀病毒的VP6和抗相應(yīng)輪狀病毒的VP4/VP7抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。說明上述各個重組表達(dá)的重組嵌合蛋白具有VP6載體蛋白和所插入的輪狀病毒抗原表位的良好的免疫反應(yīng)性，且不具有傳染性，沒有毒力返祖和腸套疊等副作用，對進(jìn)一步開發(fā)輪狀病毒RV重組嵌合疫苗，具有較高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/70GK102643348SQ20121011259
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者陳元鼎 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所