專利名稱：水稻稻瘟病菌無毒基因Avr－Pii及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的分離克隆與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，而且該菌還能夠侵染麥類、谷類等50多種禾本科植物。稻瘟病菌菌株能否在特定品種上生長(zhǎng)是由該病原菌菌株的無毒基因的產(chǎn)物和寄主抗病基因產(chǎn)物之間的互作決定的。因此，無毒基因產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分析與研究，是了解病原菌小種和寄主品種專化性互作的生化基礎(chǔ)，對(duì)于植物病害的預(yù)防和控制也具有重要的指導(dǎo)意義。
稻瘟病菌與水稻的相互關(guān)系是符合“基因?qū)颉奔僬f的(Flor，1947；Silueet al.，2000；Bryan et al.，2000；Orbach et al.2000)，也就是說，抗病品種的感病化是由于原來與抗病品種所持的抗病基因?qū)?yīng)的、稻瘟病菌所具有的無毒基因向致病性方向發(fā)生了突變而導(dǎo)致的(Kiyosawa 1966；Joosten et al.，1994；Zeigler et al.，1994；Bryan et al.，2000；Orbach et al.2000)。因此，要想從根本上解決抗病品種的感病化問題，就必須把焦點(diǎn)集中在抗病基因和無毒基因上，以分子生物學(xué)手段為先導(dǎo)，結(jié)合植物遺傳育種學(xué)、植物病理學(xué)、以及微生物學(xué)的基礎(chǔ)理論與技術(shù)來深入研究它們各自的作用機(jī)制，以及兩者之間的相互作用。毋庸質(zhì)疑，這些研究一旦獲得突破將使人們深刻地了解植物與病原菌之間存在的基因?qū)蜿P(guān)系的實(shí)質(zhì)，繼而為其防治提供全新的理論與途徑(de Wit，1992；Bryan et al.，2000；Orbachet al.2000)。
迄今，已克隆的5個(gè)稻瘟病菌無毒基因根據(jù)其功能可以分為兩類。
第一類無毒基因編碼種間特異性的激發(fā)子。這一類包括了對(duì)彎葉畫眉草表現(xiàn)非致病特異性的PWL(pathogenicity on weeping lovegrass)基因家族。在這個(gè)基因家族中，PWL2首先通過染色體步移的方法被克隆到，該基因起著阻止稻瘟病菌株侵染彎葉畫眉草(Eragrostis curvula)的作用(Sweigard et al.，1995)。用PWL2轉(zhuǎn)化對(duì)彎葉畫眉草有致病性的野生型菌株，轉(zhuǎn)化子失去對(duì)彎葉畫眉草的致病性，卻完全保留了對(duì)其它寄主的致病性。這說明PWL2盡管是一個(gè)決定寄主范圍的基因，但其功能與經(jīng)典定義的無毒基因是一樣的。PWL2編碼富含甘氨酸的親水性蛋白，內(nèi)含一個(gè)信號(hào)肽。研究還發(fā)現(xiàn)PWL2等位基因在遺傳上不穩(wěn)定，經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生對(duì)彎葉畫眉草有致病性的自發(fā)突變體，而且PWL2位點(diǎn)在不同地理來源的水稻菌株中有高度的多態(tài)性，這也從基因水平上證明了稻瘟菌無毒基因的變異性。Kang等(1995)進(jìn)一步研究了PWL基因家族PWL1、PWL3和PWL4的結(jié)構(gòu)和功能。它們與PWL2在氨基酸水平上分別有75％、51％和57％的同源性，但是不在同一位點(diǎn)上。PWL1是從龍爪稷菌株上分離的，與PWL2功能同源，阻止病菌對(duì)彎葉畫眉草的致病性；PWL3和PWL4在自然情況下是無功能的，但將PWL4置于PWL1或PWL2的啟動(dòng)子之后，就變?yōu)橛泄δ埽砻鱌WL是一個(gè)快速進(jìn)化的基因家族。
稻瘟菌中第二類無毒基因?yàn)橥ǔＲ饬x上的無毒基因，即編碼品種特異性(專化性)的激發(fā)子。這一類基因包括AVR-Pita(以前稱AVR2-YAMO)，ACE1和AVR1-CO39。AVR-Pita是與水稻抗病基因Pita特異互作的無毒基因。AVR-Pita編碼一個(gè)金屬蛋白酶，盡管尚無直接的生化依據(jù)，但改變?cè)摻饘俚鞍酌附Y(jié)構(gòu)域中的一個(gè)氨基酸，它就不能與抗病基因Pita互作(Jia et al.，2000)。功能分析表明，AVR-Pita176直接與水稻細(xì)胞內(nèi)的Pita蛋白的富亮氨酸區(qū)域(Leucine-rich-domain，LRD)結(jié)合，激發(fā)Pita調(diào)控的防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致水稻的抗病反應(yīng)(Jia et al.，2000)。這是第二個(gè)無毒基因與抗病基因編碼的產(chǎn)物直接互作的例子，也是第一次從分子水平上證實(shí)了稻瘟病菌無毒基因和水稻抗病基因之間符合基因?qū)虻募僬f。不同于AVR-Pita，對(duì)應(yīng)于抗病基因Pi33的無毒基因ACE1編碼一個(gè)大分子量的聚酮化合物合成酶(Polyketide synthase，PKS)和非核糖體多肽合成酶(non-ribosomalpeptide synthase，NRPS)復(fù)合體(Berruyer et al.，2003；Bohnert at al.，2004)。利用Ace1-GFP融合蛋白研究發(fā)現(xiàn)，Ace1定位于附著胞的細(xì)胞質(zhì)中，表明Ace1不是通過泌出胞外并被植物細(xì)胞識(shí)別。通過對(duì)Ace1的B-聚酮合成酶區(qū)域的點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變導(dǎo)致Ace1p的蛋白產(chǎn)物活性喪失而不再表現(xiàn)無毒，表明ACE1的存在是水稻抗病品種識(shí)別真菌信號(hào)的必要條件。與已報(bào)道的真菌無毒基因不同，ACE1編碼的蛋白酶并不直接與水稻作用，而是Ace1的代謝產(chǎn)物被水稻識(shí)別(Fudal et al.，2002)。另一個(gè)無毒基因AVR1-CO39雖已被克隆，但是其功能目前尚未確定(Farman和Leong，1998)，在此不贅。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(無性態(tài)Pyricularia grisea Sacc.)引起的稻瘟病是世界水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，每年都造成10-30％的水稻產(chǎn)量損失(Baker et al.，1997)。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的觀點(diǎn)來看，使用抗病品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效和對(duì)環(huán)境安全的措施。但是，由于稻瘟病菌群體的多樣性及易變性，使得抗病品種的抗性不穩(wěn)定。以致抗病品種的感病化問題一直沒有得到解決。從病原菌無毒基因著手，可望闡釋稻瘟病菌與水稻的互作關(guān)系，以及病原菌的致病機(jī)理，從而，為稻瘟病抗病育種打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，目前，至少有40多個(gè)稻瘟病菌無毒基因已經(jīng)被分子定位。其中，PWL1，PWL2，Avr1-CO39，Avr-Pita and ACE1已經(jīng)被克隆(Bhnert et al.2004；Farman and Leong 1998；Kang et al.1995；Orbach et al.2000；Sweigard et al.1995)。本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)岢鲋斑€沒有稻瘟病菌第6染色體上稻瘟病菌無毒基因被克隆的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離克隆稻瘟病菌菌株CHL346中攜帶的一個(gè)稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii和包含調(diào)控這個(gè)基因的啟動(dòng)子的DNA片段。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述稻瘟病菌無毒基因所編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述含有上述無毒基因的載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述基因在設(shè)計(jì)農(nóng)藥分子靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述基因培育抗病植物的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述基因在建立分子檢測(cè)體系，監(jiān)測(cè)植物稻瘟病發(fā)病情況中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含基因Avr-Pii的DNA片段，該片段賦予稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)對(duì)水稻產(chǎn)生特異性(?；?的非致病性反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段，結(jié)構(gòu)如圖4所示。該DNA序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或該序列替換、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。本發(fā)明所示的DNA片段在稻瘟病菌菌絲體中呈組成型表達(dá)。所分離、克隆的Avr-Pii無毒基因編碼的蛋白與稻瘟病菌端粒解旋酶基因的部分序列同源。對(duì)Avr-Pii基因進(jìn)行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。對(duì)該基因的編碼區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)突變，可能會(huì)導(dǎo)致基因無毒性的喪失或改變。
本發(fā)明同樣包括將包含該基因的片段和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子連接，該啟動(dòng)子可以在任何條件下和侵入植株的不同時(shí)期表達(dá)。這種組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子等。另一方面，也可以將該基因和一個(gè)組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子或精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接，這些啟動(dòng)子稱之為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這樣，環(huán)境的改變，侵入植株的不同時(shí)期都可以改變?cè)摶虻谋磉_(dá)。其中環(huán)境條件包含植株的生長(zhǎng)狀況，溫度，濕度等，侵入植株的不同時(shí)期包括孢子萌發(fā)、附著胞形成、侵染釘分化和侵染菌絲擴(kuò)展等。
根據(jù)本發(fā)明提供的Avr-Pii基因序列信息(SEQ ID NO1)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過以下方法容易地獲得與Avr-Pii等同的基因(1)通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得；(2)以Avr-Pii基因片段為探針篩選稻瘟病菌或其它病原菌的基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)獲得；(3)根據(jù)Avr-Pii基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從稻瘟病菌或其它病原菌的基因組、mRNA和cDNA中獲??；(4)在Avr-Pii基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得該基因。
本發(fā)明提供的稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能來設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)。
應(yīng)用之二是將所述的Avr-Pii基因序列連接到任何一種轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將Avr-Pii無毒基因和相應(yīng)的抗病基因Pii共價(jià)導(dǎo)入水稻或其他植物細(xì)胞。也就是說，將無毒基因置于病原菌侵入誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，而將相應(yīng)的抗病基因置于組成型表達(dá)的啟動(dòng)子下，一起導(dǎo)入寄主植物中，當(dāng)寄主受到病原菌侵染時(shí)，無毒基因便被誘導(dǎo)表達(dá)無毒蛋白，然后無毒蛋白作為激發(fā)子，激發(fā)其特異的抗病基因表達(dá)，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的受體蛋白，它們之間相互識(shí)別，導(dǎo)致寄主產(chǎn)生過敏性反應(yīng)，以阻止入侵病原菌的定殖和擴(kuò)展。由于這種工程植物是基于寄主抗病反應(yīng)后各種防衛(wèi)反應(yīng)的綜合表達(dá)和作用，因此，這種新型的抗性是穩(wěn)定而持久的。
本發(fā)明提供的無毒基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP(限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài))、CAP(切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用這些標(biāo)記可監(jiān)測(cè)田間稻瘟病菌群體的生理小種及其遺傳結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，以及該無毒基因在田間自然群體中的分布情況；有助于水稻品種的抗病性鑒定和稻瘟病菌小種的鑒定；也有助于抗病品種的合理布局和輪換，以更有效地控制稻瘟病的發(fā)生。
本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的無毒性的轉(zhuǎn)基因菌株，以及用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的菌株。也可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他的菌株。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過對(duì)稻瘟病菌無毒基因的克隆及其功能分析，有助于揭示稻瘟病菌小種與水稻品種間特異性互作及其進(jìn)化的分子機(jī)理。在實(shí)踐上可以根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；可以將該基因和相應(yīng)的抗病基因共價(jià)導(dǎo)入水稻等寄主植物培育持久抗病品種；有助于建立稻瘟病菌自然群體致病性變異的分子檢測(cè)體系，研究稻瘟病菌無毒基因在田間自然群體中的分布情況，揭示稻瘟病菌群體中小種的組成和變異特點(diǎn)；也有助于水稻品種的抗病性鑒定及其合理布局和輪換，以便更有效地控制稻瘟病的發(fā)生。


圖1為水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的圖位克隆示意圖；圖2為水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的高解析度遺傳圖譜和電子物理圖譜；圖3為水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的部分抗性轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記潮霉素基因的PCR(3a)和Southern(3b)檢測(cè)結(jié)果圖；圖4為水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的基因結(jié)構(gòu)圖；圖5為水稻稻瘟病無毒基因Avr-Pii表達(dá)特性的RT-PCR檢測(cè)圖；圖6為分子標(biāo)記MS6-1鑒定親本及其后代個(gè)體的Avr-Pii位點(diǎn)基因型結(jié)果圖；其中，圖2中A為Avr-Pii位點(diǎn)的高解析度遺傳圖譜。水平線表示染色體區(qū)域，上方為SSR標(biāo)記，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為各標(biāo)記位點(diǎn)的重組體數(shù)，下方數(shù)字為標(biāo)記間的遺傳距離(cM)；B為Avr-Pii位點(diǎn)區(qū)域的電子物理圖譜。長(zhǎng)的水平線表示染色體區(qū)域，短的水平線表示BAC克隆，垂直線表示連鎖標(biāo)記的著陸位置；C為Avr-Pii位點(diǎn)端粒區(qū)域的電子物理圖譜；水平線表示基因組區(qū)域，黑色的箭頭所示為2個(gè)候選無毒基因。
圖3a中泳道1-5為無毒基因Avr-Pii的轉(zhuǎn)化菌株的潮霉素抗性基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6為受體菌株CHL42的非轉(zhuǎn)化體；泳道7為載體pBHt1質(zhì)粒的潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物；M為分子量標(biāo)記DL2000。圖3b中泳道1-4為無毒基因Avr-Pii的轉(zhuǎn)化菌株的潮霉素抗性基因的Southern雜交帶；泳道5為受體菌株CHL42的非轉(zhuǎn)化體；泳道6為載體pBHt1質(zhì)粒的潮霉素抗性基因的Southern雜交帶；M為分子量標(biāo)記DL2000。
圖4中綠色方盒表示無毒基因AvrPii的外顯子，帶斜線的方盒分別為5’和3’非翻譯區(qū)，直線則表示內(nèi)含子。
圖5為無毒菌株CHL346以及健康水稻，接種后24h、128h的無毒基因表達(dá)情況；tubullin為內(nèi)參照。
圖6中P1為無毒親本CHL346；P2為有毒親本CHL42，A為無毒的子囊孢子后代個(gè)體，V為有毒的子囊孢子后代個(gè)體；M分子量標(biāo)記DL2000。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的遺傳分析及初步定位本發(fā)明利用圖位克隆法克隆了無毒基因Avr-Pii。首先，為了發(fā)掘和鑒定稻瘟病菌新無毒基因，利用由CHL346(MAT1-1)and CHL42(MAT1-2)雜交得到的242個(gè)后代子囊孢子菌株接種水稻品種Fujisaka 5(藤坂5號(hào)，含有抗病基因Pii)，結(jié)果表明，這個(gè)作圖群體中非致病菌株與致病菌株的分離比符合1∶1。由此推斷，CHL346所表現(xiàn)的對(duì)水稻品種Fujisaka 5的非致病性是由一對(duì)顯性基因控制的。
為了快速地確定無毒基因的染色體位置，利用參考菌株75-10的參考序列(reference sequence)，開發(fā)并構(gòu)建了由121個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR，simple sequencerepeat)組成的遺傳圖譜。然后，通過混合群體分離分析法(bulked-segregantanalysis，BSA)，篩選了全部121個(gè)SSR標(biāo)記，得到了7個(gè)與無毒基因連鎖的位于第6染色體上的SSR標(biāo)記，進(jìn)一步用242個(gè)后代菌株進(jìn)行了連鎖分析。結(jié)果表明，該無毒基因位點(diǎn)被定位在第6染色體的端粒11。為了精細(xì)定位該無毒基因，利用參考菌株70-15的第6染色體的末端序列以及端粒特異的重復(fù)序列(TTAGGG)n設(shè)計(jì)引物，通過LR-PCR(long-range PCR)技術(shù)獲得了端粒序列。
實(shí)施例2稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的精細(xì)定位及電子物理作圖為了精細(xì)地確定Avr-Pii位點(diǎn)的位置，我們利用獲得的端粒序列開發(fā)了2個(gè)候選無毒基因標(biāo)記(candidate avirulence gene，CAG)，結(jié)果表明其中一個(gè)CAG標(biāo)記CAG6-1與目的基因完全共分離，因此，Avr-Pii位點(diǎn)被精細(xì)定位在端粒11。為了構(gòu)建該位點(diǎn)的物理圖譜，我們利用參考菌株70-15的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)以及本研究獲得的端粒序列，通過生物信息學(xué)分析(bioinformatics analysis，BIA)，構(gòu)建了該位點(diǎn)的電子物理圖譜。結(jié)果表明，Avr-Pii位點(diǎn)被物理定位在大約8.0kb的區(qū)域內(nèi)(圖2)。
實(shí)施例3稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii候選基因的預(yù)測(cè)注釋及序列分析為了確定Avr-Pii的候選基因，我們利用菌株70-15的參考序列，通過基因預(yù)測(cè)軟件Softberry的FGENESH(http//www.softberry.com)對(duì)目的基因區(qū)域進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)及注釋分析，初步確定了Avr-Pii的候選無毒基因?yàn)锳vr-Pii-L1和Avr-Pii-L2，因此，通過以下的基因功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其功能。
實(shí)施例4稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化菌株的無毒性鑒定利用LR-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增了2個(gè)候選基因的1.9kb和2.0kb的片段并將其克隆至雙元載體轉(zhuǎn)化體系pBHt1，然后導(dǎo)入了農(nóng)桿菌菌株AGL1。把含有目的基因轉(zhuǎn)化載體的AGL1在基本培養(yǎng)基(minimal medium，MM)中28℃培養(yǎng)2天；收集細(xì)菌細(xì)胞并用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(induction medium，IM)洗兩次，然后這些菌體用含200μM乙酰丁香酮(AS)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM+AS)重新懸浮，28℃下培養(yǎng)6h；將上述懸浮液與等體積的稻瘟病菌的分生孢子懸浮液(1×106個(gè)孢子/ml)混合。取200μl的混合液涂在加入AS(200μM)的共培養(yǎng)基(co-cultivationmedium，CM)的硝酸纖維素濾膜上，25℃下共培養(yǎng)48h；用MM液體培養(yǎng)基來收集硝酸纖維素濾膜上的真菌和細(xì)菌細(xì)胞，然后取200μl收集到的共培養(yǎng)菌液涂布于含有潮霉素B(300μg/ml)，頭孢噻肟鈉(200μg/ml)和羧芐青霉素(250μg/ml)的篩選培養(yǎng)基(screening medium，SM)上，25℃下培養(yǎng)7-10d；將單菌落再次轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選；25℃下生長(zhǎng)3-4周后，將存活下來的菌落轉(zhuǎn)入PDA試管斜面培養(yǎng)基中。待菌絲長(zhǎng)滿斜面，將滅菌的稻稈放置于菌蓋上；2周后取出稻稈，擦掉稻稈上的菌絲；36h后，挑取稻桿上的單個(gè)分生孢子即為轉(zhuǎn)化子菌株。
在對(duì)100個(gè)Avr-Pii-L1轉(zhuǎn)化菌株和150個(gè)Avr-Pii-L2轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行了致病性鑒定。結(jié)果表明，只有30個(gè)Avr-Pii-L2轉(zhuǎn)化菌株在毒性菌株CHL42的遺傳背景下，表現(xiàn)了與無毒基因供體菌株CHL346相同的無毒性。由此說明，候選基因Avr-Pii-L2就是無毒基因Avr-Pii。
對(duì)實(shí)現(xiàn)了功能互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行了潮霉素基因的PCR和Southern blot鑒定，結(jié)果表明目的基因片段已經(jīng)導(dǎo)入這些轉(zhuǎn)化體(部分個(gè)體見圖3)。由此說明轉(zhuǎn)化菌株的無毒性是由無毒基因Avr-Pii的表達(dá)而產(chǎn)生的。以上結(jié)果說明，無毒基因Avr-Pii已經(jīng)被成功地克隆了。
實(shí)施例5Avr-Pii基因的結(jié)構(gòu)采用移步法對(duì)Avr-Pii的DNA序列進(jìn)行了測(cè)定。利用5’和3’RACE反應(yīng)，獲得了Avr-Pii的全長(zhǎng)cDNA并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序。序列表中的SEQ ID NO1是Avr-Pii的DNA序列。Avr-Pii基因DNA長(zhǎng)度為1938bp，其全長(zhǎng)cDNA為750bp，含有一個(gè)174bp的開放讀碼框，5’和3’非翻譯區(qū)分別為136bp和441bp。通過比較基因組DNA和cDNA，發(fā)現(xiàn)該基因的開放讀碼框只有1個(gè)外顯子，而3’非翻譯區(qū)含有2個(gè)內(nèi)含子(圖4)。
實(shí)施例6Avr-Pii無毒蛋白的結(jié)構(gòu)Avr-Pii基因編碼的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。無毒基因Avr-Pii編碼1個(gè)由57個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白多肽。數(shù)據(jù)庫(kù)比較發(fā)現(xiàn)該無毒基因與端粒解旋酶基因的部分序列同源。
實(shí)施例7定點(diǎn)突變Avr-Pii基因的序列如SEQ ID NO1所示，經(jīng)過序列分析比較，發(fā)現(xiàn)無毒菌株CHL346的DNA序列的第251個(gè)堿基為T，而有毒菌株CHL42則是C，最終導(dǎo)致該位點(diǎn)氨基酸由亮氨酸(Leu)變?yōu)樯彼?Ser)。因此，根據(jù)無毒菌株該位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)的引物，將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物上，通過重疊延伸法兩次PCR擴(kuò)增，利用PCR擴(kuò)增的堿基錯(cuò)配，將毒性菌株的C突變?yōu)闊o毒菌株的T，最后將獲得的含有突變位點(diǎn)的片段克隆到pBHt1載體上，并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化及功能互補(bǔ)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毒性菌株在進(jìn)行定點(diǎn)突變后，表型恢復(fù)為無毒性。
實(shí)施例8Avr-Pii基因的表達(dá)特性分析利用RT-PCR技術(shù)對(duì)Avr-Pii基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。從無毒菌株CHL346和用無毒菌株CHL346接種的水稻葉片中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptTMReverse TranscriptaseIII進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA第一條鏈的合成。RT-PCR引物為For5’atcgaagttggtccagggc3’；Rev5’ttatacgggttccgggg 3’；PCR反應(yīng)為94℃預(yù)變性4min；接下來是35個(gè)循環(huán)，循環(huán)程序如下94℃變性30sec，56℃退火45sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸7min，溫度降到4℃即完成擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無毒菌株CHL346和用它接種后的葉片組織的RNA反轉(zhuǎn)錄模板均能擴(kuò)增出特異的片段，說明Avr-Pii是組成型表達(dá)的基因(圖5)。
實(shí)施例9Avr-Pii基因的應(yīng)用利用本發(fā)明提供的Avr-Pii基因的序列信息，根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；將該基因和相應(yīng)的抗病基因共價(jià)導(dǎo)入水稻等寄主植物培育抗病品種；根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記在田間稻瘟病菌群體監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用(圖6)；以及根據(jù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果指導(dǎo)抗病品種合理布局中的應(yīng)用。
水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii及其應(yīng)用序列表SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻稻瘟病菌無毒基因AvrPii及其應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1938<212>DNA<213>稻梨孢屬稻瘟病菌(Magnaporthe grisea Barr.(無性態(tài)Pyricularia grisea Sacc.))<220>
<221>5’UTR<222>(1)..(135)<220>
<221>CDS<222>(136)..(306)<220>
<221>exon<222>(136)..(309)<220>
<221>gene<222>(136)..(309)<220>
<221>3’UTR<222>(310)..(873)<400>1ggacggtggg tagaggtggc aggggacgag ggacagttcc ggttgcgaac gggggcggat60tgcgacaaaa aaagggtgtt gtttgaggtg gttgcaggat ttcaaaacca ggcgccggag120ttgttccggg aggaa atg aaa acg agg atg ggg gat agg cat tgg gat gga 171Met Lys Thr Arg Met Gly Asp Arg His Trp Asp Gly1 5 10aaa ttc gaa ggg agg gag gcg tgg aaa cgg atg gga aag cgg gtt aaa 219Lys Phe Glu Gly Arg Glu Ala Trp Lys Arg Met Gly Lys Arg Val Lys15 20 25tgg gga agg atg gaa acg aac gag ttg tgt ata tta ttt ttt cga tta 267Trp Gly Arg Met Glu Thr Asn Glu Leu Cys Ile Leu Phe Phe Arg Leu30 35 40gtt gaa att tgg agc agg gag atg gag ggc ggt ggg att taa309Val Glu Ile Trp Ser Arg Glu Met Glu Gly Gly Gly Ile45 50 55atgcgtaagt attaacaatt tgtaaatgga tatatataaa taaaataaac gcagataaaa369taaaagtaat tagcaaaaaa ggcaaataaa attaaaatcg aagttggtcc agggccgtga429atataaaatt agcaaacacg aatattaaaa tgataaatat gttttaaaag cgcagaaaga489cgaaaaatag tgattataag ggtaaagggc cgggaaggtt agggttagaa gtggttgtgg549ttaaagaaat gcaaagcgtc cccgtaaccc gtttaatggc gcggagcgcc catgtccggt609ggcgtggagg ccggaaggtt agggttaaaa ataattatgg tttaaaaaag cgcggagcgc669ccccggaacc cgtataatgg cggcggagcg cccatgtccg gcggcgtgga ggccggaagg729ttagggttaa aagtgattgt ggtttaaaaa aacacggagc gtcccatgtt cggcggcgtt789
水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii及其應(yīng)用序列表gaggccggaa ggttagggtt atatggaggc gggagggtga gggttatata agatgcgttg849ggattaaaat agtggaagta taacgaaaat agtgcagaaa agttgaaatt gaaataaagg909ggaaaatata ataaatcaaa taatagaaaa aagttgaggg gattaaaaaa acatatggaa969aaataaattt gaagttgtta taaattatga ttgggcgaaa tgaaatgcgg tcaaattggg1029aaagcaaaag gagttaaaat ataaaagcaa attacaaaca agtattatac cagtaaggga1089aaatgttgaa atatgacaaa ataaaagaga aatataaaaa caatcgaaaa agaatatttt1149ttaatatgtg gtgtgaaaag ataataaaac ataaaatagg tataaaataa tatttaataa1209tacgtatata aaataaatgt tatatggatg gaatataaac caaatataac caaaagaaaa1269gaaaatataa aatagcgcaa ttacggtaat ataaaccgtt taatggttat atataaaaac1329ggttaaatag gggttaatta ttaaggaaat taagcgtaaa agcggttaaa attattagaa1389ataaaatggt aagaagtatt gaaagttgca ataagtccgg gttatatata acgcaaaaaa1449ataaacgaaa aaaataaaaa aggaaagggt atgaattatt ttgtaaaaaa gtaaaaatat1509aaaaaaacgt taaaaataaa attgtaaaaa atggcgttat aaggcccggg cgcgaagcgc1569gtaaccaatc gagcagggcg gcaaaggtaa aaagagagtt aaaataatcc gtgggcgcga1629agcgcggcca attatattcc aaaaagccag ccgcaaatgg cacgcgtttt atatatttga1689tttaatggtt aaaaaaagtg gaaggaagga aatagcatgg ttaaaaaccc gatacggttt1749acggatttga cgaaataaag cacggaaaaa gaaaaaagac gttggcggat aaaacggcgt1809attggtttaa aattgcaatt aaagcaaata ttggacgaaa aaacggagtt ttgcggagtg1869taaaacccgg cgttataaat aattatacag agaaccagcc cggtaataat ggtagtaggt1929acgagtggc1938<210>2<211>57<212>PRT<213>稻梨孢屬稻瘟病菌(Magnaporthe grisea Barr.(無性態(tài)Pyricularia grisea Sacc.))<400>2Met Lys Thr Arg Met Gly Asp Arg His Trp Asp Gly Lys Phe Glu Gly1 5 10 15Arg Glu Ala Trp Lys Arg Met Gly Lys Arg Val Lys Trp Gly Arg Met20 25 30Glu Thr Asn Glu Leu Cys Ile Leu Phe Phe Arg Leu Val Glu Ile Trp35 40 45Ser Arg Glu Met Glu Gly Gly Gly Ile50 5權(quán)利要求
1.水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ IDNO2所示，或該序列替換、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的水稻稻瘟病菌無毒基因Avr-Pii，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的載體。
6.權(quán)利要求3或4所述基因在設(shè)計(jì)農(nóng)藥分子靶點(diǎn)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求5所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
8.利用權(quán)利要求3或4所述基因培育抗病植物的方法。
9.權(quán)利要求3或4所述基因在建立分子檢測(cè)體系，監(jiān)測(cè)植物稻瘟病發(fā)病情況中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了水稻稻瘟病菌無毒基因Avr－Pii及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)新無毒基因Avr－Pii的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列，該基因是一個(gè)組成型表達(dá)的基因。本發(fā)明還涉及了根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)及其功能設(shè)計(jì)新型農(nóng)藥的分子靶點(diǎn)；將該基因和相應(yīng)的抗病基因共價(jià)導(dǎo)入水稻等寄主植物培育抗病品種；根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標(biāo)記在田間稻瘟病菌群體監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用；以及根據(jù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果指導(dǎo)抗病品種合理布局中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1831008SQ20061003433
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月16日
發(fā)明者潘慶華, 王玲, 林菲, 馬俊紅 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)