專利名稱：一種促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物活性肽制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵乳是利用乳酸菌(如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)對牛乳進(jìn)行發(fā)酵而成的產(chǎn)品。與牛奶相比，發(fā)酵乳可以緩解乳糖不耐癥，促進(jìn)乳蛋白的消化，提高鈣、磷利用率，促進(jìn)鐵和維生素D的吸收。從某種意義上說，發(fā)酵乳是乳品成分的預(yù)消化產(chǎn)物，如乳糖、蛋白質(zhì)和脂肪的降解，同時可溶性鈣和磷的含量提高，并合成一些B族維生素，因此其營養(yǎng)價值比普通乳制品高。
發(fā)酵奶中的乳酸菌是一種對人體有益的微生物，在發(fā)酵過程中，它能產(chǎn)生大量乳酸、醋酸和風(fēng)味物質(zhì)，這些產(chǎn)物直接或間接地對調(diào)整腸道菌群平衡、預(yù)防病菌感染和預(yù)防消化道疾病都起到重要的作用。另外，乳酸菌還能合成一些特殊的酶系和細(xì)胞表面物質(zhì)，能起到降低膽固醇，阻止致病菌對腸道入侵，增加免疫功能和抗癌的作用。因此，發(fā)酵乳中乳酸菌的數(shù)量對發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值、口感、質(zhì)量均有重要的影響。
由于液體菌種質(zhì)量穩(wěn)定性差、制作復(fù)雜、容易污染等諸多缺點(diǎn)，目前大部分企業(yè)為保證發(fā)酵乳質(zhì)量、口感和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，均采用直投式發(fā)酵劑，因直投式發(fā)酵劑比通過翻代的液體發(fā)酵劑具有更加穩(wěn)定的性能和更方便的使用方式。然而，采用直投式發(fā)酵劑用量大，生產(chǎn)成本昂貴，與液體菌種相比，直投式發(fā)酵劑的潛伏期要長得多，其發(fā)酵時間通常比使用傳統(tǒng)的通過翻代的液體發(fā)酵劑要延長1～3小時左右，對于大型乳品廠，這是一個不容忽視的不利因素。因此，添加能促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，減少發(fā)酵劑使用量、降低生產(chǎn)成本、縮短直投式菌種的發(fā)酵時間、提高設(shè)備利用率和生產(chǎn)效率，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。
張蓉真等報道了大豆水解蛋白對乳酸菌增殖的促進(jìn)作用，認(rèn)為添加1％的大豆水解蛋白，能夠使保加利亞乳桿菌的增殖速度提高，在國內(nèi)首次展示了大豆水解蛋白不僅作為強(qiáng)化營養(yǎng)添加劑而且作為提高生產(chǎn)效率的一個發(fā)酵促進(jìn)劑在發(fā)酵乳生產(chǎn)上的良好應(yīng)用前景。趙新淮等研究了大豆蛋白水解物的乳酸發(fā)酵促進(jìn)作用。他們利用自制的大豆蛋白水解物，通過對比研究了它在發(fā)酵乳中對乳酸發(fā)酵的作用情況。得出結(jié)論如下大豆蛋白水解物(SPH)對發(fā)酵乳的乳酸發(fā)酵存在著促進(jìn)作用，并在發(fā)酵的早、中期較明顯；SPH既可促進(jìn)酸度的增加，還可促進(jìn)乳酸菌的增殖。
然而在發(fā)酵過程中添加大量(1％)含有促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的水解物不僅成本較高，而且可能導(dǎo)致酸奶不良風(fēng)味，如低水解度的大豆水解蛋白大多有苦味以及不良的氣味。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，用此方法制備出來的生物活性肽可顯著促進(jìn)了乳酸菌的增殖，特別是嗜熱鏈球菌的增殖，縮短了發(fā)酵時間和凝乳時間，提高了產(chǎn)酸速度，而且對發(fā)酵乳的風(fēng)味無不良影響。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的步驟如下第一步對大豆蛋白或大豆粕進(jìn)行預(yù)處理，以破壞蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)；
第二步在55℃～65℃，pH7.5～8.5下先采用木瓜蛋白酶或堿性蛋白酶(AlcalaseTM)進(jìn)行限制性水解，水解度達(dá)到5～6％(pH-Stat法測定)后添加胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶進(jìn)行水解；第三步當(dāng)水解度在10～12％(pH-Stat法測定)時，滅活步驟二中所用的蛋白酶來達(dá)到終止水解，以控制水解液中多肽分子量的分布和避免水解物中的生物活性肽發(fā)生明顯的變性；第四步調(diào)整pH值至中性；第五步將水解液通過5000分子量的超濾膜除去大分子物質(zhì)，得到生物活性肽。
所述步驟一中的預(yù)處理是采用75～90℃，加熱10～20min，冷卻至50～60℃。
所述步驟三中滅活蛋白酶需要采用的條件為pH2～3.5，60～70℃，25～35min。
所述步驟三中控制水解液中多肽分子量的分布主要集中在500～2000。
采用以上技術(shù)方案獲得的生物活性肽以200～500ppm(w/w)的濃度添加到酸奶中進(jìn)行發(fā)酵，可顯著促進(jìn)了乳酸菌的增殖，特別是嗜熱鏈球菌的增殖，縮短發(fā)酵時間和凝乳時間，提高產(chǎn)酸速度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明所生產(chǎn)出來的生物活性肽在200～500ppm的濃度下具有顯著的促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的功效；(2)本發(fā)明制備的生物活性肽活性高，在有效添加濃度下對發(fā)酵乳的風(fēng)味無不良影響；
(3)本發(fā)明以大豆為原料制備生物活性肽，蛋白質(zhì)利用率高，生產(chǎn)成本低。


圖1為本方法制備的生物活性肽的不同添加量對發(fā)酵乳產(chǎn)酸速度的影響示意圖；圖2為本方法制備的生物活性肽的不同添加量對發(fā)酵乳發(fā)酵時間的影響示意圖。
具體實(shí)施例方式
為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。
實(shí)施例1將8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，90℃，加熱20min，冷卻至60℃；添加木瓜蛋白酶3000U/g蛋白，pH8.0，55℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至5％；添加胰蛋白酶2000U/g蛋白，pH8.0，55℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至10.2％；將酶解液的pH值調(diào)節(jié)至pH值為3，70℃保持30min，使蛋白酶失活；調(diào)整pH值至中性；將酶解液過5000分子量的超濾膜，除去大分子量多肽和蛋白質(zhì)，獲得富含促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
實(shí)施例2將8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，85℃，加熱15min，冷卻至60℃；添加木瓜蛋白酶2000U/g蛋白，pH8.0，55℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至5.6％；添加胰凝乳蛋白酶2500U/g蛋白，pH8.0，55℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至11.8％；將酶解液的pH值調(diào)節(jié)至pH值為2，68℃保持25min，使蛋白酶失活；調(diào)整pH值至中性；將酶解液過5000分子量的超濾膜，除去大分子量多肽和蛋白質(zhì)，獲得富含促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
實(shí)施例3將8％(w/v)的大豆蛋白分散在水中，80℃，加熱10min，冷卻至55℃；添加堿性蛋白酶(AlcalaseTM)2500U/g，pH8.5，60℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至5.5％；添加胰凝乳蛋白酶2500U/g蛋白，pH8.5，55℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至11.8％；將酶解液的pH值調(diào)節(jié)至pH值為2.5，60℃保持35min，使木瓜蛋白酶失活；調(diào)整pH值至中性；將酶解液過5000分子量的超濾膜，除去大分子量多肽和蛋白質(zhì)，獲得富含促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
實(shí)施例4將8％(w/v)的酪蛋白分散在水中，75℃，加熱14min，冷卻至50℃；添加堿性蛋白酶(AlcalaseTM)2000U/g蛋白，pH7.5，65℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至5.8％；添加胰蛋白酶2000U/g蛋白，pH7.5，65℃下進(jìn)行酶解反應(yīng)，采用pH-Stat法控制水解度至11.5％；將酶解液的pH值調(diào)節(jié)至pH值為3.5，70℃保持30min，使蛋白酶失活；調(diào)整pH值至中性；將酶解液過5000分子量的超濾膜，除去大分子量多肽和蛋白質(zhì)，獲得富含促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，分子量的分布主要集中在500～2000。
表1為低脂發(fā)酵乳空白樣在發(fā)酵過程中乳酸菌的生長情況表1


表2為低脂發(fā)酵乳添加本方法制備的生物活性肽(300ppm)后在發(fā)酵過程中乳酸菌的生長情況表2

從表1和表2可以看出添加300ppm生物活性肽后，發(fā)酵酸奶中球菌和桿菌總數(shù)是為添加樣的1.5倍。
圖1為本方法制備的生物活性肽的不同添加量對發(fā)酵乳產(chǎn)酸速度的影響示意圖；圖2為本方法制備的生物活性肽的不同添加量對發(fā)酵乳發(fā)酵時間的影響示意圖。從圖1和圖2可以看出隨著生物活性肽添加量增大，乳酸菌產(chǎn)酸的速度明顯增加，酸奶pH值降低到4.5所需的時間明顯縮短。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，其特征在于步驟如下第一步對大豆蛋白或大豆粕進(jìn)行預(yù)處理，以破壞蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)；第二步在55℃～65℃，pH7.5～8.5下先采用木瓜蛋白酶或堿性蛋白酶進(jìn)行限制性水解，水解度達(dá)到5～6％后添加胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶進(jìn)行水解；第三步當(dāng)水解度在10～12％時，滅活步驟二中所用的蛋白酶來達(dá)到終止水解，以控制水解液中多肽分子量的分布和避免水解物中的生物活性肽發(fā)生明顯的變性；第四步調(diào)整pH值至中性；第五步將水解液通過5000分子量的超濾膜除去大分子物質(zhì)，得到生物活性肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，其特征在于所述步驟一中的預(yù)處理是采用75～90℃，加熱10～20min，冷卻至50～60℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，其特征在于所述步驟三中滅活蛋白酶需要采用的條件為pH2～3.5，60～70℃，25～35min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，其特征在于所述步驟三中控制水解液中多肽分子量的分布主要集中在500～2000。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽的制備方法，該方法利用大豆蛋白或大豆粕等原料生產(chǎn)一種具有促進(jìn)乳酸菌增殖及發(fā)酵產(chǎn)酸的生物活性肽，主要包括利用兩種內(nèi)切蛋白酶對大豆蛋白或大豆粕進(jìn)行限制性水解，使水解度達(dá)到10～12％；采用溫和的滅酶方法以避免水解物中的生物活性肽發(fā)生明顯的變性；通過將水解液過5000分子量的超濾膜除去大分子量多肽和蛋白質(zhì)。本發(fā)明所獲得的生物活性肽在200～500ppm的添加量下能顯著促進(jìn)乳酸菌的增殖和產(chǎn)酸能力，縮短發(fā)酵時間。
文檔編號A23C9/12GK1858227SQ20061003438
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者趙謀明, 崔春, 趙強(qiáng)忠, 曾建新, 蔣文真 申請人:華南理工大學(xué), 廣州合誠實(shí)業(yè)有限公司