一種快速檢測腎衰的三聯試劑盒及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，具體設及一種用于腎臟衰竭的早期預警、治療過 程和愈后監(jiān)控的=聯試劑盒，并進一步公開了其制備方法和應用。
【背景技術】
[000引急性腎損傷（AKI)是急性腎衰竭的連續(xù)性過程，AKI廣泛發(fā)生于糖尿病人、交通事 故傷害、重癥患者、大手術后患者，它按FIFLE標準分為風險、損傷、衰竭、腎功能喪失和終 末期腎病。急性腎損傷盡早診斷有助于對病人實施保護性治療，降低死亡率。
[0003] 現有技術中，臨床急性腎損傷診斷的生物標志物是肌酢、尿素氮和尿量。肌酢是 骨骼肌中肌酸到磯酸肌酸，并在肝臟中轉化形成，并從腎小球濾過，其中少部分肌酢分泌入 尿，肌酢不能在腎小管重吸收或在腎臟代謝。血清肌酢作為急性腎損傷的標志物的局限性 主要體現在；第一，肌酢產生因年齡、性別、飲食、肌肉情況、藥物及激烈運動差異明顯，影響 了其診斷的準確性；第二，肌酢分泌約占肌酢清除的10-40%，該將導致GFR的假性降低； 第S，血清肌酢試驗精確性可因假象而降低；第四，肌酢出現異常時，GFR減少大都已超過 50%，并且需超過24小時才能檢測到血肌酢濃度。該些因素都會導致W肌酢作為急性腎損 傷的早期診斷標志存在嚴重的局限性。
[0004] 尿素氮是水溶性的、低分子量的蛋白質代謝產物。它的血濃度與GFR相反，部分因 素可影響它的產生和清除，該就限制了它評估GFR的可靠性。尿素氮的產生是多變的，它的 值可因循環(huán)血量、蛋白質攝入、胃腸道出血等的變化而改變。腎臟尿素氮清除率也是變化 的；40-50%濾過的尿素氮在腎小管重吸收。所從尿素氮是不太適合評估GFR的，因為濃度 升高需時間累積，不能及時反映GFR變化而耽擱診斷。
[0005] 更重要的是，由于很多AKI病人并沒有出現少尿，或者很多手術及ICU病人僅出現 了少尿，但并沒有出現急性腎損傷。因此，該些依賴傳統(tǒng)的生物標志物（肌酢，尿素氮，尿 量）來診斷AKI，多在損傷后幾小時才出現異常（肌酢，尿素氮），同時也缺乏特異性（尿 量），該些均會造成治療上耽擱，該也是臨床AKI治療效果不佳的重要原因之一。
[0006] 鑒于現有臨床上面臨的該些問題，新的早期急性腎損傷的生物標志物已被逐步 開發(fā)出來。包括人中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL)，半脫氨酸蛋白酶抑制劑 C(切C)，C反應蛋白（CRP)，均已在AKI的診斷中發(fā)揮重要作用。
[0007] 中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白（NGAL)是一種小分子量分泌型蛋白，由 Kjeldse化等人于1993年發(fā)現，是Lipocalin家族的新成員。生理條件下，NCAL少量合成 于骨髓中性粒細胞和腎小管等多個系統(tǒng)的上皮細胞，炎癥反應和惡性腫瘤可誘使其在多組 織（如子宮、前列腺、唾液腺、肺、腎、氣道及消化道上皮等）中大量生成，幾個小時內就可W 達到峰值，產生速度明顯快于其它相關生物標記物。NGAL在急性腎小管損傷早期就已經表 達，反映腎小管功能素亂，它濃度的升高提示腎小管損傷發(fā)生，而傳統(tǒng)指標血肌酢升高則需 24小時W上。NGAL也是目前新型AKI診斷的首選指標物。
[000引脫抑素C也稱半脫氨酸蛋白酶抑制劑C，切sC分子量為13KD，由120個氨基酸組 成，它編碼的基因是存在于機體所有有核細胞中的一種管家基因，因此人體幾乎所有的有 核細胞均可W產生切sC，且產生率恒定。生理條件下，切sC抑制內源性半脫氨酸蛋白酶的 活性，切sC是一種低分子量蛋白質，能經腎小球濾過而被清除，在腎小球近曲小管重吸收并 被完全分解代謝，且腎臟是唯一清除切sC的器官，機體產生切sC的速率也相當恒定。研究 證明，切sC是一種比較接近理想的反映腎小球濾過功能的內源性標志物。當腎小球出現輕 微損傷時，切sC在血液中的濃度會迅速升高。切sC能靈敏的檢測到腎小球濾過功能的改 變，對腎功能早期損壞進行診斷。
[0009] C反應蛋白（C-reactiveprotein,CRP)是由肝細胞所合成，具有激活補體和促進 粒細胞及吞瞻細胞的吞瞻作用。CRP是第一個被認為是急性時相反應蛋白，正常情況下含量 極微量，在AKI、急性創(chuàng)傷和感染時其血濃度急劇升高。CRP濃度升高可反映體內炎癥處于 急性活動期，如急性炎癥、組織損傷和AKI等疾病，說明有進行性組織壞死或并發(fā)感染的存 在，CRP是臨床上AKI最常用的急性時相反應指標。
[0010] 現有技術中已經開發(fā)出了諸如WNGAL、切sC或者CRP為單一指標的膠體金試紙條 或免疫巧光試紙條，意在通過檢測NGAL、切sC或者CRP的指標變化對腎衰的發(fā)生、發(fā)展進行 監(jiān)測。但是臨床實踐證明，上述單一指標的檢測試劑，由于臨床各種難于預測的情況而存在 著準確性欠佳的問題，依然難于保證腎衰的快速及準確的檢測，不能全面地、特異性地預警 急性腎衰的發(fā)生、發(fā)展過程。而且目前WNGAL、切sC、CRP為目標物產品均W不同形式在臨 床上應用，制作原理及操作程序各不相同，兼容性比較差，很難在短時間內同時、快速地檢 測出=者的結果，極大地影響了對急性腎衰患者的準確診斷，從而造成很多病人因延誤救 治而病情惡化或導致死亡。
[0011] 因此，目前臨床上急需開發(fā)一種可全面、快速、簡便的診斷、監(jiān)測腎衰的發(fā)生、發(fā)展 的試劑，可隨時監(jiān)控發(fā)生腎衰的風險，避免因病情的延誤而發(fā)生嚴重的后果。

【發(fā)明內容】

[0012] 為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于現有技術中用于檢測腎衰竭的試劑由于檢 測指標單一而導致檢測結果不穩(wěn)定的問題，進而提供一種可全面、快速、簡便的診斷、監(jiān)測 腎衰的發(fā)生、發(fā)展的試劑盒，并進一步公開其制備方法及應用。
[0013] 為解決上述技術問題，本發(fā)明所述的快速檢測腎衰的S聯試劑卡，所述試劑卡W 血清半脫氨酸蛋白酶抑制劑（切sC)、中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白（NAGL)及C反 應蛋白（CR巧為檢測標志物。
[0014] 進一步的，所述試劑卡包括樣品區(qū)、抗體結合區(qū)，檢測控制區(qū)及吸水區(qū)；所述抗體 結合區(qū)含有切sC、NGAL、CRP的特異性抗體，所述檢測控制區(qū)含有分別與切sC、NGAL、CRP相 對應的單克隆抗體、多克隆抗體，或相應的抗原。
[0015] 更優(yōu)的，所述試劑卡包括：
[0016] 底板W及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結合墊、抗 體承載膜和吸樣墊，且所述樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸樣墊之間，依次與且僅與相鄰 部位相接觸且部分重疊；
[0017] 所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上順次設置有第一檢測線、第二 檢測線、第=檢測線和質控線，所述第一檢測線靠近所述結合墊，所述質控線靠近所述吸樣 墊；
[001引所述結合墊上噴涂有切sC、NGAL、CRPS種特異性抗體；
[0019] 所述第一檢測線、第二檢測線、第S檢測線分別彼此獨立的由與切sC、NGAL、CRP 相對應的單克隆抗體、多克隆抗體或相應的抗原涂層形成，且彼此不同。
[0020] 所述第一檢測線、第二檢測線及第=檢測線相間隔平行設置，或者彼此不重疊的 并列設置。
[0021] 所述質控線由抗鼠IgG抗體涂層形成。
[0022] 制備所述結合墊的載體包括膠體金納米顆粒、巧光膠乳、磁珠、量子點或稀±元 素。
[0023] 所述結合墊為膠體金墊，由標記有切sC、NAGL、CRP抗體的膠體金納米顆粒噴涂于 玻璃纖維素膜或無紡布上制成；或者，
[0024] 所述結合墊為免疫巧光墊，由免疫巧光物質標記的乳膠微球噴涂于玻璃纖維素膜 或無紡布上制成。
[0025] 所述結合墊上，所述切sC、NGAL、CRPS種特異性抗體分別與不同顏色的量子點相 結合。
[0026] 本發(fā)明還公開了一種制備上述快速檢測腎衰的=聯試劑卡的方法，包括如下步 驟：
[0027] (1)結合墊的制備；按照現有技術常規(guī)方法將標記有切sC、NAGL、CRP特異性抗體 的載體顆粒噴涂于玻璃纖維素膜或無紡布上，烘干備用；
[002引 似抗體承載膜的制備；將與切sC、NGAL、CRP相對應的單克隆抗體、多克隆抗體或 相應的抗原稀釋，劃線噴涂于抗體承載膜，形成所述第一檢測線、第二檢測線、第=檢測線， 并將抗鼠IgG抗體稀釋并劃線噴涂形成所述質控線，烘干備用；
[0029] (3)組裝；在底板上順次粘結樣品墊、結合墊、抗體承載膜和吸樣墊，各部分依次 與且僅與相鄰