一種天然橡膠顆粒觀測方法及其在橡膠植物品系篩查中的應(yīng)用
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及利用標(biāo)記免疫學(xué)識別技術(shù)的篩查橡膠植物品系的方法，特別是利用標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)篩查蒲公英、刺萵苣、無花果、銀膠菊等橡膠植物品系(特別是橡膠草品系)的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]橡膠植物的橡膠乳液中包含橡膠顆粒，天然橡膠分子即在橡膠顆粒的表面合成。小橡膠顆粒蛋白(SRPP)是橡膠顆粒表面的一種跟天然橡膠合成緊密相關(guān)的膜蛋白，其與橡膠植物的產(chǎn)膠能力成正相關(guān)關(guān)系(參見Oh，S.K.；Kang, H.；Shin, D.H.；Yang, J.；Chow, K.S.；Yeang, Η.Y.；Wagner, B.；Breiteneder, H.；Han, K.H.J.B1l.Chem.1999，274，17132 - 17138.)。因此通過觀測一種橡膠植物乳液中的SRPP即可預(yù)測該種橡膠植物的產(chǎn)膠能力。
[0003]橡膠草是多年生草本植物，包括菊科蒲公英等。橡膠草含有天然橡膠乳液，能制造天然橡膠。我國面積廣大，從溫帶到亞熱帶種都可種植橡膠草。因此，中國研宄機構(gòu)已開始研宄從橡膠草上采集天然膠乳，以制備天然橡膠。但是，橡膠草中含膠量普遍較低。需要從野生的橡膠草中篩選出天然乳膠含量高的橡膠草品系和株，進行人工培育，以大規(guī)模推廣種植。因此尋找一種橡膠草品系的篩查或篩選的方法，無論從經(jīng)濟意義還是我國的橡膠安全的角度來說具有重大意義。
[0004]普通的電子顯微鏡可以實現(xiàn)高放大率和高解析度的顆粒物形態(tài)分析，例如，使用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡，可以清晰地表征納米顆粒物的大小、形態(tài)及其分布特征，從而為相關(guān)領(lǐng)域的重要研宄和應(yīng)用奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。
[0005]普通的電子顯微術(shù)是通過將橡膠植物乳液樣品作噴金或于金屬網(wǎng)上固定處理而進行后續(xù)的電鏡觀察，在良好的工作條件下，普通的電子顯微術(shù)可獲得較為清晰的顆粒物電鏡圖片。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，應(yīng)用普通的電子顯微術(shù)可以直接觀察到橡膠植物乳液中的顆粒物。但是，由于橡膠植物乳液中可能同時含有多類蛋白、樹脂、橡膠分子以及其他顆粒，在普通電子顯微鏡下這些顆粒顯示出類似的圖像，所以普通電子顯微鏡無法區(qū)分橡膠植物乳液中的橡膠顆粒，即普通的電子顯微術(shù)不具有特異性，無法確證所觀察到的顆粒物是否為天然橡膠顆粒。
[0007]標(biāo)記免疫技術(shù)是使用放射性核素、熒光素、酶、納米金顆粒、量子點等標(biāo)記物質(zhì)，結(jié)合特異性的抗原-抗體反應(yīng)，而進行的特異性分子識別手段。
[0008]標(biāo)記免疫技術(shù)中，標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)是將抗原-抗體特異性分子識別反應(yīng)與高放大倍率和高解析度的電子顯微術(shù)相結(jié)合，標(biāo)記免疫電子顯微技術(shù)在臨床診斷、疾病治療及生理病理研宄等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用，近年來，隨著標(biāo)記技術(shù)的進步和電子顯微相關(guān)設(shè)備的不斷更新，標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)的研宄領(lǐng)域不斷拓展，應(yīng)用領(lǐng)域也日趨廣泛?！?br/>【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009]【發(fā)明所要解決的課題】
[0010]本發(fā)明所要解決的問題是普通的電子顯微鏡無法區(qū)分橡膠植物乳液中的橡膠顆粒，即普通的電子顯微術(shù)不具有特異性，無法確證所觀察到的顆粒物是否是所期望的目標(biāo)天然橡膠顆粒，無法判斷橡膠植物的產(chǎn)膠能力。
[0011]【解決課題的手段】
[0012]本發(fā)明基于橡膠顆粒表面的小橡膠顆粒蛋白，利用標(biāo)記免疫識別技術(shù)，特異性地識別橡膠植物乳液中的橡膠顆粒，判斷橡膠植物乳液中的橡膠顆粒含量高低，并通過觀察橡膠蛋白標(biāo)記物的密度分布，快速預(yù)測和判斷橡膠植物的產(chǎn)膠能力高低，解決產(chǎn)膠橡膠草品系篩查的關(guān)鍵性技術(shù)問題。
[0013]具體地說，本發(fā)明解決課題的手段如下:
[0014]1.一種觀測橡膠顆粒的方法，其特征在于，所述方法利用標(biāo)記免疫學(xué)識別技術(shù)進行觀測和識別。
[0015]2.如項目I所述的方法，其特征在于，所述橡膠顆粒來自橡膠植物乳液。
[0016]3、如項目I或2所述的方法，其特征在于，所述橡膠植物為橡膠樹或者橡膠草，例如，選自由巴西橡膠樹、蒲公英、刺萵苣、無花果和銀膠菊組成的組中的任意一種。
[0017]4.如項目I至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記免疫學(xué)識別技術(shù)為免疫電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法、熒光顯微鏡方法、放射性免疫標(biāo)記技術(shù)、蛋白或基因芯片法或者基于側(cè)流免疫原理的試紙條法。
[0018]5.如項目I至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述免疫學(xué)識別技術(shù)為免疫電鏡技術(shù)。
[0019]6、如項目I至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0020](I)以取自橡膠植物的橡膠乳液作為待測樣品，使其中的小橡膠顆粒蛋白(SRPP)與第一抗體充分接觸，使兩者結(jié)合；
[0021](2)使標(biāo)記物標(biāo)記過的第二抗體與已標(biāo)記第一抗體的待測樣品充分接觸，使兩者結(jié)合，得到抗體標(biāo)記樣品；
[0022](3)對抗體標(biāo)記樣品進行觀測和識別。
[0023]7、如項目I至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述第一抗體為源自于小橡膠粒子蛋白的抗體，優(yōu)選為鼠源小橡膠粒子蛋白抗體，所述第二抗體為第一抗體的抗體。
[0024]8、如項目I至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述第二抗體為金標(biāo)記抗體。
[0025]9、如項目I至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0026](I)使四氧化鋨與采集自橡膠植物的橡膠乳液于室溫下固定I小時，得到經(jīng)四氧化鋨固定的橡膠乳液，然后滴一小滴將該所述經(jīng)四氧化鋨固定的橡膠乳液至聚乙烯醇縮甲醛化的鎳網(wǎng)上并風(fēng)干；
[0027](2)在樣品與第一抗體結(jié)合之前，將經(jīng)風(fēng)干的鎳網(wǎng)依次浸泡在去離子水、PBS緩沖液和含有牛血清蛋白(BSA)、TritonlOO的PBS緩沖液中；
[0028](3)使所述鎳網(wǎng)與第一抗體在37°C充分結(jié)合120分鐘；
[0029](4)取出所述鎳網(wǎng)，依次滴加含有脫脂奶粉和Tween 20的PBS緩沖液、PBS緩沖液；
[0030](5)使所述鎳網(wǎng)與第二抗體在室溫下充分結(jié)合2小時；
[0031](6)將鎳網(wǎng)依次用TBS-Tween 20、TBS洗滌，最后用去離子水洗滌4次；
[0032](7)將鎳網(wǎng)風(fēng)干后使用透射電鏡進行觀測。
[0033]10、如項目I至9中任一項所述的方法在橡膠植物尤其是橡膠草上針對橡膠產(chǎn)量進行的品系篩查中的應(yīng)用。
[0034]11、項目10所述的應(yīng)用，其中，所述品系篩查是定性篩查和/或定量篩查。
[0035]【發(fā)明的效果】
[0036]本發(fā)明利用標(biāo)記免疫識別技術(shù)，特異性地識別橡膠植物乳液中的橡膠顆粒，并通過觀察橡膠蛋白標(biāo)記物的密度分布，實現(xiàn)了快速定量判斷橡膠植物乳液中的橡膠顆粒含量高低及快速判斷橡膠植物產(chǎn)膠能力高低，解決了產(chǎn)膠橡膠草品系篩查的關(guān)鍵性技術(shù)問題。
【【附圖說明】】
[0037]圖1是實施例1(有第一抗體)的透射電鏡照片。
[0038]圖2是圖1的放大圖。
[0039]圖3是比較例I (無第一抗體)的透射電鏡照片。
[0040]圖4是實施例2(有第一抗體)的透射電鏡照片。
[0041 ]圖5是比較例2 (無第一抗體)的透射電鏡照片。
[0042]圖6是膠體金免疫電鏡原理示意圖。
【【具體實施方式】】
[0043]本發(fā)明的利用標(biāo)記免疫技術(shù)特異性地識別橡膠植物乳液中的橡膠顆粒的方法可以適用于橡膠樹、蒲公英、刺萵苣、無花果或者銀膠菊。本發(fā)明的方法更適用于橡膠草，特別適用于蒲公英。
[0044]本發(fā)明的方法包括如下步驟:
[0045](I)以提取出的橡膠乳液作為待測樣品，使其中的SRPP與第一抗體充分接觸，使兩者結(jié)合；
[0046](2)使標(biāo)記物標(biāo)記的第二抗體與待測樣品充分接觸，使兩者結(jié)合；
[0047](3)使用識別技術(shù)觀察、識別天然橡膠顆粒。
[0048]更具體地說，本發(fā)明的方法包括如下步驟:
[0049](I)將利用上述過膜法采集和純化的橡膠植物乳液使用I質(zhì)量％四氧化鋨溶液(四氧化鋨溶于50mM 二甲胂酸鈉緩沖液中)，置于室溫下I小時固定，滴一小滴四氧化鋨溶液至聚乙烯醇縮甲醛化的鎳網(wǎng)上風(fēng)干；
[0050](2)在第一抗體結(jié)合之前(即，第一抗體與樣品(帶有橡膠顆粒的鎳網(wǎng))結(jié)合之前)，將鎳網(wǎng)依次浸泡在去離子水、PBS緩沖液和含有I質(zhì)量％牛血清蛋白(BSA)、0.5體積％ TritonlOO的PBS緩沖液中(在各液體中分別浸泡5min)
[0051](3)將SRPP抗體(鼠源)(第一抗體)1:200稀釋，得到稀釋液，將鎳網(wǎng)在37°C下充分接觸120min所述稀釋液，使載在镲網(wǎng)上的樣品與第一抗體結(jié)合；
[0052](4)取出載有樣品的鎳網(wǎng)，用移液器依次滴加含有2質(zhì)量％脫脂奶粉和0.5體積％Tween 20的PBS緩沖液(50 μ L)、PBS緩沖液(50 μ L)，鎳網(wǎng)為多孔網(wǎng)，直徑大約有4_5mm，滴加后樣品覆蓋在鎳網(wǎng)的整個表面。
[0053](5)將金標(biāo)記的第二抗體(以第一抗體為抗原得到的羊源抗體)1:20(體積比)稀釋，得到稀釋液，將載有樣品的鎳網(wǎng)與含有第二抗體的所述稀釋液在室溫下接觸2小時，使已經(jīng)結(jié)合在樣品上的第一抗體與第二抗體結(jié)合；
[0054](6)將第(5)步驟得到的吸附有樣品的鎳網(wǎng)依次用TBS-Tween 20 (用量50 μ L)，TBS(用量50 μ L)洗滌，最后用去離子水洗滌(用量50yL)4次；
[0055](7)將鎳網(wǎng)上的樣品風(fēng)干，將鎳網(wǎng)裝上樣品桿使用透射電子顯微鏡(TEM)在60/80kV的加速電壓下觀察橡膠顆粒。
[0056]所述第一抗體可以是，例如，抗SRPP抗體(小橡膠粒子蛋白抗體，鼠源)。所述第二抗體是第二抗體為第一抗體的抗體，例如，以第一抗體