一種檢測(cè)豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)、診斷領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測(cè)豬早孕因子的膠體金試紙卡及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]運(yùn)用早期妊娠診斷方法對(duì)提高母豬繁殖效率和養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)效益的十分有幫助，母豬配種后，如果能夠盡早的進(jìn)行妊娠確診，就能夠減少母豬的空懷期或非繁殖天數(shù)，增加母豬的平均年產(chǎn)仔窩數(shù)，同時(shí)有利于對(duì)繁殖障礙母豬的及早治療處理。而現(xiàn)在普遍采用的早期妊娠診斷方法中有的診斷準(zhǔn)確率不穩(wěn)定、有的操作方法步驟繁瑣、有的使用儀器昂貴、有的對(duì)操作人員經(jīng)驗(yàn)要求高，在眾多檢測(cè)方法中快速試紙檢測(cè)能夠具備操作簡(jiǎn)單、靈敏性高、特異性好、價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)而具備推廣應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，快速檢測(cè)母豬早孕因子，用于母豬早期妊娠的臨床診斷。本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)在于利用基因克隆技術(shù)，人工合成具有天然早孕因子活性的豬早孕因子蛋白，在此基礎(chǔ)上得到敏感性高、特性好的鼠源豬早孕因子單克隆抗體，經(jīng)過(guò)試紙卡組裝得到豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。
[0004]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0005]1、豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，其特征在于:
[0006]所述的豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡由膠體金試紙條和扣板式卡槽組成；扣板式卡槽具有一個(gè)容置膠體金試紙條的內(nèi)置空腔，且扣板式卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜(硝酸纖維素膜)、金標(biāo)單克隆抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；
[0007]所述的NC膜設(shè)置在支持板的中部，NC膜一側(cè)的支持板上依次粘貼有含有金標(biāo)單克隆抗體墊和樣品墊，NC膜另一側(cè)的支持板上粘貼有吸收墊；
[0008]所述NC膜的中部有一條含有豬早孕因子多克隆抗體的檢測(cè)線和一條含有羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；
[0009]膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的內(nèi)置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的樣品墊；
[0010]所述載樣墊中金標(biāo)單克隆抗體為鼠源豬早孕因子單克隆抗體；所述NC膜中豬早孕因子抗體為兔抗豬早孕因子多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0011]2、上述的豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0012](I)制備 NC 膜
[0013]兔抗豬早孕因子多克隆抗體的制備:采用原核表達(dá)并純化的豬早孕因子蛋白作為免疫原，提取IgG抗體，制備多克隆抗體；
[0014]檢測(cè)線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為45?50dotS/mL/Cm，用包被緩沖液稀釋兔抗豬早孕因子多克隆抗體，濃度為45?50 μ g/mL，在NC膜中適當(dāng)位置劃線，即為檢測(cè)線，晾干備用；所述的包被緩沖液為經(jīng)過(guò)0.40?0.45 μ L濾膜過(guò)濾的0.05?0.07Μ、ρΗ9.6的CBS緩沖液(碳酸鹽緩沖液);
[0015]質(zhì)控線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為45?48dotS/ml/cm，用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，濃度為lmg/ml，在NC膜上與檢測(cè)線平行的位置劃線，與檢測(cè)線間隔4?5mm，即為質(zhì)控線；
[0016]NC膜組裝制備:晾干檢測(cè)線和質(zhì)控線，得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的NC膜；用封閉工作液將制備的NC膜于室溫72h晾干，封存?zhèn)溆茫凰龅姆忾]工作液為含質(zhì)量百分比的
2.5% BSA,2.5?3.0%脫脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS緩沖液混合后用0.45?0.48ul濾膜過(guò)濾得到的封閉工作液。
[0017](2)制備涂覆金標(biāo)單克隆抗體墊
[0018]用20mM含質(zhì)量百分比為1.5% BSA,0.1% NaNjP 3%四硼酸鈉稀釋緩沖液(水溶液)將金標(biāo)單克隆抗體稀釋至終濃度0.05mg/ml ;裁取規(guī)格為300 X 7_的玻璃纖維棉，將金標(biāo)單克隆抗體溶液用單向噴點(diǎn)儀，以5 μ L/cm的速度(大約20ng/條)，均勻噴灑于玻璃纖維棉上，56°C干燥lh，加入干燥劑真空密封后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0019](3)組裝豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡
[0020]將涂有檢測(cè)線和質(zhì)控線的NC膜粘貼在支持板的中部，在NC膜的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)單克隆抗體的玻璃纖維膜和樣品墊，在NC膜的另一側(cè)粘貼吸收墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。
[0021](4)豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡使用及判定
[0022]豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡在診斷豬早期妊娠中應(yīng)用，分離血清，將所得的血清滴加在本試紙卡的樣品墊中，樣品順吸水墊上移，當(dāng)遇到金標(biāo)單克隆抗體時(shí)豬早孕因子與金標(biāo)鼠抗豬早孕因子單克隆抗體結(jié)合，抗原-抗體-金復(fù)合物向檢測(cè)線和質(zhì)控線移動(dòng)，豬早孕因子與檢測(cè)線上的兔抗豬早孕因子多克隆抗體結(jié)合，形成一條紅色的檢測(cè)線，陰性血清中無(wú)豬早孕因子不能結(jié)合金標(biāo)鼠抗豬早孕因子單克隆抗體，所以無(wú)肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)線出現(xiàn)；質(zhì)控線永遠(yuǎn)呈紅色，如果無(wú)色的，表示試紙條失效。
[0023]進(jìn)一步地，步驟(I)中檢測(cè)線和質(zhì)控線的線寬為1mm，兩線相距4mm，位于膜的中間，距NC膜的邊距6?7_。
[0024]有益效果:
[0025]本發(fā)明所述的膠體金試紙卡利用最新抗原表位篩選技術(shù)，人工合成具有天然早孕因子活性的豬早孕因子蛋白，在此基礎(chǔ)上得到敏感性高、特性好的豬早孕因子單克隆抗體。然后根據(jù)現(xiàn)代國(guó)際最先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，優(yōu)化試紙卡組裝條件，通過(guò)試紙卡中NC膜上分別噴涂含兔抗豬早孕因子多克隆抗體的檢測(cè)線和含羊抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線，能夠臨床檢測(cè)豬早孕因子，為養(yǎng)豬企業(yè)提供一種臨床診斷母豬早期妊娠的試紙卡。該試紙卡具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)方便快速的優(yōu)點(diǎn)，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中不需要使用專業(yè)儀器設(shè)備，多操作人員要求低，而且試紙卡成本低廉，操作方便，能廣泛應(yīng)用于豬早期妊娠的診斷，為了解母豬孕情和對(duì)母豬假孕進(jìn)行診斷奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是本發(fā)明的膠體金試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加樣孔4、樣品墊5、金標(biāo)抗體墊6、NC膜7、觀察區(qū)8、吸收墊
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1
[0029]豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡由膠體金試紙條和扣板式卡槽組成；扣板式卡槽具有一個(gè)容置膠體金試紙條的內(nèi)置空腔，且扣板式卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜、金標(biāo)單克隆抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；所述的NC膜設(shè)置在支持板的中部，NC膜一側(cè)的支持板上依次粘貼有含有金標(biāo)單克隆抗體墊和樣品墊，NC膜另一側(cè)的支持板上粘貼有吸收墊；所述NC膜的中部有一條含有豬早孕因子多克隆抗體的檢測(cè)線和一條含有羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的內(nèi)置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的樣品墊；所述載樣墊中金標(biāo)單克隆抗體為鼠源豬早孕因子單克隆抗體；所述NC膜中豬早孕因子抗體為兔抗豬早孕因子多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0030]實(shí)施例2
[0031]豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，包括以下步驟:
[0032](I)制備 NC 膜
[0033]兔抗豬早孕因子多克隆抗體的制備:采用原核表達(dá)并純化的豬早孕因子蛋白作為免疫原，提取IgG抗體，制備多克隆抗體；
[0034]檢測(cè)線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為45?50dotS/mL/Cm，用包被緩沖液稀釋兔抗豬早孕因子多克隆抗體，濃度為45?50 μ g/mL，在NC膜中適當(dāng)位置劃線，即為檢測(cè)線，晾干備用；所述的包被緩沖液為經(jīng)過(guò)0.40?0.45 μ L濾膜過(guò)濾的0.05?0.07Μ、ρΗ9.6的CBS緩沖液；
[0035]質(zhì)控線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為45?48dotS/ml/cm，用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，濃度為lmg/ml，在NC膜上與檢測(cè)線平行的位置劃線，與檢測(cè)線間隔4?5mm，即為質(zhì)控線；
[0036]NC膜組裝制備:晾干檢測(cè)線和質(zhì)控線，得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的NC膜；用封閉工作液將制備的NC膜于室溫72h晾干，封存?zhèn)溆?；所述的封閉工作液為含質(zhì)量百分比的
2.5% BSA,2.5?3.0%脫脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS緩沖液混合后用0.45?0.48ul濾膜過(guò)濾得到的封閉工作液。
[0037](2)制備涂覆金標(biāo)單克隆抗體墊
[0038]用20mM含質(zhì)量百分比為1.5% BSA,0.1% NaNjP 3%四硼酸鈉稀釋緩沖液將金標(biāo)單克隆抗體稀釋至終濃度0.05mg/ml ;裁取規(guī)格為300X 7mm的玻璃纖維棉，將金標(biāo)單克隆抗體溶液用單向噴點(diǎn)儀，以5 μ L/cm的速度(大約20ng/條)，均勻噴灑于玻璃纖維棉上，56°C干燥lh，加入干燥劑真空密封后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0039](3)組裝豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡
[0040]將涂有檢測(cè)線和質(zhì)控線的NC膜粘貼在支持板的中部，在NC膜的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)單克隆抗體的玻璃纖維膜和樣品墊，在NC膜的另一側(cè)粘貼吸收墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。
[0041](4)豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡使用及判定
[0042]豬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡在診斷豬早期妊娠中應(yīng)用，分離血清，將所得的血清滴加在本試紙卡的樣品墊中，樣品順吸水墊上移，當(dāng)遇到金標(biāo)單克隆抗體時(shí)豬早孕因子與金標(biāo)鼠抗豬早孕因子單克隆抗體結(jié)合，抗原-抗體-金復(fù)合物向檢測(cè)線和質(zhì)控線移動(dòng)，豬早孕因子與檢測(cè)線上的兔抗豬早孕因子多克隆抗體結(jié)合，形成一條紅色的檢測(cè)線，陰性血清中無(wú)豬早孕因子不能結(jié)合金標(biāo)鼠抗豬早孕因子單克隆抗體，所以無(wú)肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)線出現(xiàn)；質(zhì)控線永遠(yuǎn)呈紅色，如果無(wú)色的，表示試紙條失效。
[0043]其中，步驟(I)中檢測(cè)線和質(zhì)控線的線寬為1mm，兩線相距4mm，位于膜的中間，距NC膜的邊距6?7_。
[0044]實(shí)施例3
[0045]I制備鼠抗豬早孕因子單克隆抗體、兔抗豬早孕因子多克隆抗體
[0046]1.1鼠抗豬早孕因子基因單克隆抗體的制備
[0047]根據(jù)GenBank中豬EPF(豬早孕因子)基因核苷酸序列以及國(guó)際最新研宄EPF的空間構(gòu)象及表位預(yù)測(cè)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)出EPF上游引物5’ -CGGGATCCATGGCAGGACAAGCTTTTAG-3’下游引物 5’ -CCG CTCGAGGGATCCTCTTGGAACCAAGTCGACGTACTTTCCAAGA-3’。以豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為材料，利用經(jīng)典TRIzol法提取總RNA，RT-PCR獲得DNA。利用設(shè)計(jì)好引物PCR方法得到大小為341bp的EPF基因片段。獲得基因片段送去上海生工測(cè)序結(jié)果顯示與豬EPF同源性為99.9%未發(fā)生變異。
[0048]1.2 PET-28 a -EPF/BL21表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)
[0049]以PMD-19T-EPF為底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，膠回收后Xh