本發(fā)明屬于遺傳學(xué)與生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為番茄果實(shí)干汁性狀特異性序列及其分子標(biāo)記物與鑒定方法。

背景技術(shù)：

番茄具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是重要的鮮食產(chǎn)品和加工原料，已成為繼玉米、水稻、小麥與馬鈴薯等之后的世界第七大作物，全球年工業(yè)產(chǎn)值可達(dá)500億美元。番茄果實(shí)不僅含有對(duì)人體有益的碳水化合物、纖維素和礦質(zhì)元素等，并且含有多種維生素，以及決定果實(shí)風(fēng)味的多種糖、有機(jī)酸和揮發(fā)性有機(jī)化合物。番茄因其重要的農(nóng)業(yè)價(jià)值、豐富的營養(yǎng)價(jià)值、優(yōu)越的植物學(xué)特性和基礎(chǔ)研究?jī)?yōu)勢(shì)，成為研究肉質(zhì)果特別是肉質(zhì)漿果及其發(fā)育的模式植物，解釋了眾多果實(shí)的生理、發(fā)育和代謝等機(jī)理，如關(guān)于肉質(zhì)果實(shí)的器官發(fā)生、發(fā)育和成熟，以及感官品質(zhì)和營養(yǎng)的分子基礎(chǔ)等。

利用不斷發(fā)展的理論和技術(shù)，培育滿足生產(chǎn)和市場(chǎng)需求的優(yōu)良品種，是番茄育種的根本目的。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記的得到廣泛應(yīng)用和推廣，分為形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記等表現(xiàn)型標(biāo)記和dna片段標(biāo)記等基因型標(biāo)記。dna片段標(biāo)記能夠直接反映生物個(gè)體或種群間基因組的某種差異，具有不受環(huán)境和基因表達(dá)的影響，而且具有數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。從20世紀(jì)80年代后期開始，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和基因工程技術(shù)為核心的生物育種技術(shù)得到了快速的發(fā)展。常用的分子標(biāo)記有基于southern雜交的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(rflp)，基于pcr技術(shù)的dna擴(kuò)增方法的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna標(biāo)記(rapd)，特定序列擴(kuò)增標(biāo)記(scar)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(ssr)，以及基于pcr與酶切相結(jié)合的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(aflp)、切割擴(kuò)增的多態(tài)性序列標(biāo)記(caps)和單核苷酸多態(tài)性(snp)等。pcr是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文縮寫(polymerasechainreaction)，pcr反應(yīng)可以擴(kuò)增一個(gè)dna片段。pcr技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科。

心室膠狀物是番茄等肉質(zhì)漿果的典型特征，在果實(shí)的形成、發(fā)育、風(fēng)味組成與質(zhì)地變化等均發(fā)揮著重要作用。普通番茄成熟后，果實(shí)心室組織發(fā)育成凝膠狀的心室膠狀物(loculargel)。心室膠狀物作為番茄果實(shí)中除果皮外的第二大豐富組織，是風(fēng)味品質(zhì)的重要構(gòu)成因素。干汁番茄材料(allflesh，alf)果實(shí)不形成心室膠狀物，果實(shí)仍能正常發(fā)育成熟，干汁番茄果實(shí)干物質(zhì)含量高，可提高果實(shí)的耐貯運(yùn)性，減緩番茄切片的降解速度，用于制干番茄及漢堡夾心等。干汁番茄材料的研究可為深入理解番茄風(fēng)味品質(zhì)的形成及遺傳改良提供理論依據(jù)，并可為解析番茄果實(shí)心室膠狀物的形成和發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。然而，現(xiàn)有技術(shù)中采用分子標(biāo)記技術(shù)直接鑒定番茄是否為干汁番茄卻鮮有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中上述問題，本發(fā)明提供了番茄果實(shí)干汁性狀的特異性序列及其分子標(biāo)記物與鑒定方法，實(shí)現(xiàn)的目的為，提供一種在番茄苗期快速篩選和鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的方法和檢測(cè)技術(shù)，可于植株早期快速穩(wěn)定地篩選和鑒定番茄果實(shí)的干汁性狀。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開的技術(shù)方案為：本發(fā)明提供了一種番茄果實(shí)干汁性狀的特異性序列，該序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明還公開了鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的分子標(biāo)記物，該分子標(biāo)記物包括上游引物、下游引物，上游引物的的核苷酸序列如seqidno：2所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno：3。

鑒別番茄果實(shí)干汁性狀的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待鑒定番茄的基因組dna中是否含有seqidno：1的dna片段。

如果所述待鑒定番茄的基因組dna中含有seqidno：1的dna片段，所述待鑒定番茄為普通有汁番茄；

如果所述待鑒定番茄的基因組dna中不含有seqidno：1的dna片段，所述待鑒定番茄為干汁番茄。

采用上述特異性基因序列與分子物，鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的方法，包括如下步驟：(1)以待鑒定番茄的基因組dna為模板，用所述分子標(biāo)記物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到其擴(kuò)增產(chǎn)物；

(2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果所述待鑒定番茄的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物含有如seqidno：1所示的dna片段，則即可鑒定出該待鑒定番茄為有汁番茄；反之則為干汁番茄。

所述步驟(1)中pcr反應(yīng)溫度程序是：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。

所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)程序是：將引物對(duì)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，goldview染色，緩沖液為0.5×tbe，4v·cm-1恒壓下電泳40min，bio-rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

所述步驟(2)中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條帶僅顯示358bp條帶，則待鑒定番茄為干汁番茄。

所述步驟(2)中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳條帶顯示497bp條帶或顯示497bp與358bp兩個(gè)條帶，則待鑒定番茄為有汁番茄。

所述步驟(1)中擴(kuò)增試劑盒包括：

所述待鑒定番茄的基因組dna模板的質(zhì)量濃度為25ng/μl，上游引物的質(zhì)量濃度為50ng/μl，下游引物的質(zhì)量濃度為50ng/μl，dntps混合物的濃度摩爾質(zhì)量濃度為10mm，mgc12溶液的摩爾質(zhì)量濃度為25mm，taqdna聚合酶的質(zhì)量濃度為5u/μl，以上組成試劑盒的各成分質(zhì)量濃度、摩爾濃度均為各成分溶解于相對(duì)應(yīng)溶劑的質(zhì)量濃度、摩爾濃度。

本發(fā)明的有益效果是：采用本發(fā)明成套引物對(duì)番茄育種群體進(jìn)行輔助選擇得到了干汁番茄株系，這表明本發(fā)明所述分子標(biāo)記物用于番茄干汁性狀的分子標(biāo)記輔助選擇是切實(shí)有效的，利用本發(fā)明進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇可提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。

用此方法鑒別番茄果實(shí)否具有干汁性狀，只需通過簡(jiǎn)單的dna提取、pcr特異性擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)即可完成對(duì)樣品的鑒別。本方法不需要限制性內(nèi)切酶酶切，具有經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明鑒定番茄果實(shí)干汁性狀分子引物對(duì)的pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果，其中，

m為100bpdnaladder，p1為母本il7-5，p2為父本06790，f1為il7-5×06-790的f1，其余為il7-5×06-790的f2株系編號(hào)。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例一：本發(fā)明提供的一種番茄果實(shí)干汁性狀的特異性序列，該序列如seqidno：1所示，鑒定該性狀的分子標(biāo)記物，包括上游引物、下游引物，上游引物的的核苷酸序列如seqidno：2所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno：3所示。

本發(fā)明通過干汁番茄基因組重測(cè)序，獲得了一批與干汁性狀連鎖的snp位點(diǎn)和插入缺失序列，通過將這些位點(diǎn)和序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行遺傳連鎖分析與驗(yàn)證，從中篩選出一系列與干汁性狀相連鎖的分子標(biāo)記，包括caps、dcaps與pcr標(biāo)記等。由于干汁番茄為隱性性狀，所以選擇共顯性標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，其中包括caps-1、caps-2與dcaps-1等。

caps-1：

正向引物：5’-taggcaaactctattcatcaagg-3’(caps1no.1)

反向引物：5’-ctatgctgtggtaggtagacttgc-3’(caps1no.2)

pcr擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶mboi進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，干汁番茄不能夠被酶切，顯示一個(gè)480bp條帶。普通有汁番茄能夠酶切或部分酶切，顯示120bp和360bp兩個(gè)條帶，或顯示120bp、360bp和480bp三個(gè)條帶。

caps-2：

正向引物：5’-tgagaaaaataagaatagccgatg-3’(caps2no.1)

反向引物：5’-cacacatcaacctccagactcc-3’(caps2no.2)

pcr擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶taqi進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行瓊脂糖電泳，干汁番茄能夠完全酶切，顯示290bp和340bp兩個(gè)條帶。普通番茄不能夠被酶切或不能夠被完全酶切，顯示一個(gè)630bp條帶，或顯示290bp、340bp和630bp三個(gè)條帶。

dcaps-1：

正向引物：5’-ttatgaaaacattcggtggtgc-3’(dcaps1no.1)

反向引物：5’-ataatttgatgtttaatttagccat-3’(dcaps1no.2)

pcr擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶bcci進(jìn)行酶切，需要聚丙烯酰胺凝膠電泳，干汁番茄不能夠被酶切，僅顯示一個(gè)180bp條帶。普通有汁番茄能夠被酶切，由于20bp片段較小，多會(huì)電泳到凝膠外，不能夠顯示，因此顯示160bp一個(gè)條帶，或160bp和180bp兩個(gè)條帶。

dcaps-2：

正向引物：5’-gagatgtacatcatatacttacatg-3’(dcaps2no.1)

反向引物：5’-ttgttcgtgtattcaaacgcttat-3’(dcaps2no.2)

pcr擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶afliii進(jìn)行酶切，需要聚丙烯酰胺凝膠電泳，干汁番茄能夠被完全酶切，僅顯示一個(gè)150bp條帶。普通有汁番茄不能夠被酶切或不能夠被完全酶切，顯示170bp一個(gè)條帶，或150bp和170bp兩個(gè)條帶。

由于caps與dcaps等引物pcr之后需要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，耗時(shí)長(zhǎng)，并且限制性內(nèi)切酶價(jià)格較為昂貴，并由于酶切時(shí)間和溫度等原因，可能造成酶切不夠徹底，影響電泳條帶判斷的準(zhǔn)確性，影響干汁性狀選擇和鑒定的準(zhǔn)確性。

因此本發(fā)明選擇不需要進(jìn)行酶切的引物標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，而且本發(fā)明所公開的番茄果實(shí)干汁性狀的特異性核苷酸序列、分子引物為鑒定番茄干汁性狀最為準(zhǔn)確，方法最為簡(jiǎn)便的核苷酸序列。

實(shí)施例二：本發(fā)明除了公開上述番茄果汁干汁性狀的特異性序列、引物，還公開了鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的方法，包括如下步驟：

(1)以待鑒定番茄的基因組dna為模板，用所述分子標(biāo)記物進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到其擴(kuò)增產(chǎn)物；

(2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果待鑒定番茄的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物含有如seqidno：1所示的dna片段，則即可鑒定出該待鑒定番茄為有汁番茄，反之則為干汁番茄。

所述步驟(1)中pcr反應(yīng)溫度程序是：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min。

所述步驟(2)中瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)程序是：將引物對(duì)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，goldview染色，緩沖液為0.5×tbe，4v·cm-1恒壓下電泳40min，bio-rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

所述步驟(2)中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳顯示條帶僅顯示358bp條帶，則待鑒定番茄為干汁番茄。

所述步驟(2)中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳顯示條帶顯示497bp條帶或顯示497bp與358bp兩個(gè)條帶，則待鑒定番茄為有汁番茄。

所述步驟(1)中擴(kuò)增試劑盒包括：

以上組成試劑盒的各成分質(zhì)量濃度、摩爾濃度均為各成分溶解于相對(duì)應(yīng)溶劑的質(zhì)量濃度、摩爾濃度，各成分溶解于現(xiàn)有技術(shù)常用溶劑形成溶液后檢測(cè)使用。

以下試驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的特異性核苷酸序列、設(shè)計(jì)的引物、鑒定方法為鑒定番茄干汁性狀最為準(zhǔn)確、有效、便捷，il7-5×06790的f2株系是按照如下方法獲得：il7-5(作為母本)和06790(作為父本)雜交，得到f1，f1自交收獲f1植株所結(jié)的種子獲得f2的種子。隨機(jī)取f2的種子進(jìn)行種植，得到f2植株，取編號(hào)分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45。

(一)田間正常栽培管理，待番茄果實(shí)轉(zhuǎn)色后，鑒定每株系的果實(shí)干汁性狀，每株系調(diào)查10個(gè)果實(shí)，以確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。田間鑒定結(jié)果如表1所示，表明株系編號(hào)為15、35、36、42為干汁番茄；株系編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、37、38、39、40、41、43、44、45為普通有汁番茄。

(二)利用本發(fā)明方法鑒定番茄的干汁性狀，在步驟(一)編號(hào)為1-45的株系、il7-5(株系編號(hào)為p1)和06790(株系編號(hào)為p2)的番茄幼苗期分別采集番茄葉片提取其基因組dna，分別以提取的各個(gè)株系的基因組dna為模板，利用引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

(三)田間成株期果實(shí)干汁性狀鑒定

pcr反應(yīng)完成后，將引物對(duì)的pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，goldview染色，緩沖液為0.5×tbe，在4v·cm-1恒壓下電泳40min，bio-rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。其中，10×tbe(1l)的配制方法如下：tris108g，硼酸55g，edta7.44g，用ddh2o定容至1l，使用前用蒸餾水配制成0.5×工作液，常溫保存。引物對(duì)的pcr產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，il7-5(株系編號(hào)為p1)、06790(株系編號(hào)為p2)和編號(hào)為1-45的株系的pcr產(chǎn)物均得到特異條帶。見表一所示。

表一

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所

<120>番茄果汁干汁性狀的特異性序列及其分子標(biāo)記物與鑒定方法

<130>

<160>1

<170>patentlnversion3.3

<210>1

<211>139

<212>番茄果實(shí)干汁性狀的特異性核苷酸序列

<213>

<220>

<223>

<400>1

agggtccacctttttcgtactcgctgttacggaggctgacaccgtcagtttcaacaaagc60

tgcaggaatagtctataccttttttcttaacgtcgttagggtttgattttggctttgaca120

tggcagagtagaaaaggat139

<210>2

<211>

<212>鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的上游引物

<213>

<220>

<223>

<400>2

5’-cctacaagaatacaaagcct-3’

<210>3

<211>

<212>鑒定番茄果實(shí)干汁性狀的下游引物

<213>

<220>

<223>

<400>3

5’-ggatggctctaatgacaatg-3’