本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種重組間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法。
背景技術(shù):
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,mscs)是一種中胚層來(lái)源的具有多分化潛能的成體干細(xì)胞,存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,mscs來(lái)源廣泛,可從骨髓、脂肪、臍帶(血)、牙齦、骨骼肌等組織中獲得,其中以骨髓組織中的含量最為豐富。mscs具有干細(xì)胞所特有的無(wú)限增殖及自我更新能力,在體外傳代培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇后仍能保持其“干性”;具有多向分化潛能,在合適的體內(nèi)外環(huán)境下,可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型;具有低免疫原性,通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制t細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng),異體移植排異較輕,配型要求不嚴(yán)格??傊?,mscs具有增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制,易于產(chǎn)業(yè)化制備、體內(nèi)植入后不良反應(yīng)較弱等優(yōu)點(diǎn)。因此,mscs備受關(guān)注,有望成為繼造血干細(xì)胞之后最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。
現(xiàn)有技術(shù)中,mscs可用于血液系統(tǒng)疾病、心血管疾病(如心肌梗死)、肝硬化、軟骨與骨損傷修復(fù)等多種疾病替代性治療的應(yīng)用研究中。同時(shí),mscs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓損傷修復(fù)以及神經(jīng)退行性疾病如腦萎縮、帕金森病、阿爾茨海默綜合征等頑癥的治療方面具有重要的應(yīng)用前景。mscs還可作為基因載體,應(yīng)用于基因缺陷引起的遺傳性疾病的治療,并用于解決某些自身免疫性疾病方面的問(wèn)題。此外,mscs與生物材料相結(jié)合,能夠修復(fù)骨、軟骨、肌腱等各種組織的缺損,這是組織工程中的新興領(lǐng)域。
近年來(lái)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然起始移植的mscs細(xì)胞數(shù)量很多,然而最終遷移到損傷區(qū)域能夠存活下來(lái),并進(jìn)一步分裂分化的細(xì)胞數(shù)量非常少。例如有文獻(xiàn)報(bào)道脊髓損傷手術(shù)26天后,在損傷局部可檢測(cè)到的存活的移植細(xì)胞還不到1%,嚴(yán)重影響了干細(xì)胞修復(fù)局部損傷組織的效果。而無(wú)論mscs發(fā)揮治療作用的方式是分化為損傷組織的細(xì)胞類型以修復(fù)受損組織,還是著重于改善微環(huán)境,提高損傷區(qū)移植細(xì)胞的數(shù)量與質(zhì)量都是至關(guān)重要的,這也是目前干細(xì)胞移植治療領(lǐng)域的一個(gè)瓶頸。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明的目的是提供一種重組間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法,本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細(xì)胞,其遷移能力和增殖能力均得到提高,從而提高mscs細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的療效。
本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細(xì)胞,重組間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入有mir-124和mir-21。
進(jìn)一步地,mir-124的核苷酸序列如seqidno.1所示。
進(jìn)一步地,mir-21的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本發(fā)明還提供了上述重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法,包括以下步驟:
通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式,將mir-124和mir-21轉(zhuǎn)染進(jìn)入間充質(zhì)干細(xì)胞,篩選出表達(dá)水平上調(diào)的細(xì)胞,得到重組間充質(zhì)干細(xì)胞。
進(jìn)一步地,在轉(zhuǎn)染之前,還包括將間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、原代及傳代培養(yǎng)的步驟。
進(jìn)一步地,間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于骨髓、肌肉和神經(jīng)中的一種或幾種。
進(jìn)一步地,重組間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力和增殖能力得到提高。
進(jìn)一步地,在篩選后,還包括采用mirna定量檢測(cè)技術(shù),定量分析細(xì)胞并驗(yàn)證其表達(dá)水平的步驟。
進(jìn)一步地,將重組間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后,可進(jìn)行體外驗(yàn)證,檢測(cè)其定向遷移能力、增殖能力及神經(jīng)方向分化能力。
進(jìn)一步地,可構(gòu)建脊髓損傷模型,將重組間充質(zhì)干細(xì)胞移植入模型中,進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證,檢測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的定向遷移能力、增殖能力及神經(jīng)方向分化能力。
借由上述方案,本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明提供了一種具有高遷移能力和高增殖能力的重組間充質(zhì)干細(xì)胞,該干細(xì)胞具有上調(diào)的mir-124和mir-21,細(xì)胞的遷移、增殖與分化等生物學(xué)行為得到調(diào)控,顯著提高了mscs的遷移速度與距離,該重組間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞劃痕的愈合,mscs的增殖能力得到提高,有效增加細(xì)胞的數(shù)量,相比mscs,本發(fā)明的重組間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化潛能得到明顯增強(qiáng)。
本發(fā)明還提供了一種全新的、更加有效的高遷移能力重組mscs的制備方法,上調(diào)有效調(diào)控mscs趨化性遷移行為的關(guān)鍵mirnas分子:mir-124,以及調(diào)控mscs增殖能力的關(guān)鍵mirna分子:mir-21。證明了通過(guò)調(diào)控mir-124可以在體外、體內(nèi)得到高定向遷移能力的mscs細(xì)胞群體;通過(guò)調(diào)控mir-21可以在體外得到高增殖能力的mscs細(xì)胞群體,并且具有高神經(jīng)分化方向潛能。從而進(jìn)一步提高mscs細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等頑癥的療效,本發(fā)明對(duì)于提高干細(xì)胞如mscs在臨床上治療各種疾病的細(xì)胞移植治療效果具有重要價(jià)值。
上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段,并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施,以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明重組間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)結(jié)果;
圖2是實(shí)施例1中細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中各細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果;
圖3是實(shí)施例1中細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,不同物質(zhì)與劃痕愈合面積關(guān)系測(cè)試結(jié)果;
圖4是實(shí)施例1中edu檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中各細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果;
圖5是實(shí)施例1中edu檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,各細(xì)胞增殖情況的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;
圖6是實(shí)施例1中,間充質(zhì)干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中,不同物質(zhì)與細(xì)胞分化免疫熒光結(jié)果;
圖7是脊髓損傷模型中重組間充質(zhì)干細(xì)胞的熒光檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例中,間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于sd大鼠骨髓組織。
實(shí)施例1重組間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和驗(yàn)證
(1)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、原代及傳代培養(yǎng),具體方法如下:
將大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取原代細(xì)胞,使用含有10%血清的低糖(l-dmem)培養(yǎng)基,放置于含有5%二氧化碳的37℃培養(yǎng)箱中。
(2)干細(xì)胞構(gòu)建:
通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式,將mir-124或mir-21轉(zhuǎn)染進(jìn)入間充質(zhì)干細(xì)胞干細(xì)胞,從而構(gòu)建成高表達(dá)mir-124或mir-21的重組間充質(zhì)干細(xì)胞,具體操作如下:
1.將mscs以5×104/ml密度接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合后開始轉(zhuǎn)染。保證轉(zhuǎn)染終濃度為50nmmirna促進(jìn)劑。
2.5ul預(yù)先配置好的mimics溶液加入245μll-dmem,輕輕混合,室溫靜置5min。
3.5μl脂質(zhì)體2000與245μll-dmem(不含血清的培養(yǎng)基)輕輕混合,室溫靜置5min。
4.將以上稀釋好的脂質(zhì)體2000與mirnamimic輕輕混勻,室溫靜置30min。
5.吸掉mscs中的原培養(yǎng)基,無(wú)血清的l-dmem洗1-2次,然后加入1500μl不含血清的l-dmem培養(yǎng)基,最后加入混合好的轉(zhuǎn)染液,輕輕搖勻,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.6h后去除轉(zhuǎn)染液,加入mscs生長(zhǎng)培養(yǎng)基(l-dmem+10%fbs),48h后提取rna。
(3)表達(dá)水平驗(yàn)證:通過(guò)“莖環(huán)法”實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的mirna組,并驗(yàn)證其表達(dá)水平,進(jìn)一步篩選得到置信度高的表達(dá)水平顯著上調(diào)的目標(biāo)mirna組。
驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示,圖1中,nc代表空白對(duì)照組,mc代表轉(zhuǎn)染mimicscontrol組,m代表轉(zhuǎn)染mimics組,圖中*代表轉(zhuǎn)染micro-rna124mimics組分別與轉(zhuǎn)染mimicscontrol組、未轉(zhuǎn)染組之間用pcr檢測(cè)micro-rna124表達(dá)量之間的關(guān)系,*表示p<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明,采用以上方法成功構(gòu)建了高表達(dá)mir-124重組間充質(zhì)干細(xì)胞。
(4)重組間充質(zhì)干細(xì)胞的體外驗(yàn)證:傳代培養(yǎng)步驟(2)構(gòu)建的重組間充質(zhì)干細(xì)胞,并檢驗(yàn)其定向遷移能力、增殖能力及神經(jīng)方向分化能力。
通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)重組間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力,檢測(cè)0h、6h、12h、24h的細(xì)胞分布情況,結(jié)果如圖2-3所示。圖2中,bmscnc組表示空白對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)同一視野下劃痕的變化情況,bmscmc組表示轉(zhuǎn)染mimicscontrol后的bmsc細(xì)胞組不同時(shí)間點(diǎn)同一視野下劃痕的變化情況,bmscm-21組表示轉(zhuǎn)染microrna-21mimics后的bmsc細(xì)胞組不同時(shí)間點(diǎn)同一視野下劃痕的變化情況,bmscm-124組表示轉(zhuǎn)染microrna-124mimics后的bmsc細(xì)胞組不同時(shí)間點(diǎn)同一視野下劃痕的變化情況,從圖中可看出,bmscm-124組細(xì)胞劃痕愈合速率較其他組更快。從圖3中可看出,統(tǒng)計(jì)不同處理組不同時(shí)間細(xì)胞劃痕愈合面積之間的關(guān)系可以看出,24h-nc組與24h-mir-124組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.05。
通過(guò)edu檢測(cè)方法檢測(cè)圖2中各組細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果如圖4和5所示。圖4中edu(+)下方的圖表示edu標(biāo)記的增殖的細(xì)胞,各組細(xì)胞帶有綠色熒光,hoechst33342(+)下方的圖表示視野內(nèi)所有具有細(xì)胞核的細(xì)胞,各組細(xì)胞帶有藍(lán)色熒光,merge下方圖表示以上兩組帶綠色和藍(lán)色細(xì)胞疊加后的結(jié)果。對(duì)于不用實(shí)驗(yàn)處理分組之間用edu檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖5),m-21組與nc組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01.
采用經(jīng)典的bfgf及bha誘導(dǎo)分化方式檢驗(yàn)圖2中各組細(xì)胞的神經(jīng)方向分化能力,結(jié)果如圖6所示。圖6中,neun(+)下方的圖表示細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元特異抗體存在,細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,各組細(xì)胞帶有綠色熒光,hoechst33342(+)下方的圖表示視野內(nèi)所有具有細(xì)胞核的細(xì)胞,各組細(xì)胞帶有藍(lán)色熒光,merge下方圖表示以上兩組帶綠色和藍(lán)色細(xì)胞疊加后的結(jié)果。
(5)重組間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)驗(yàn)證:使用鉗夾法構(gòu)建動(dòng)物脊髓損傷模型,通過(guò)腰椎穿刺方法移植cm-dil標(biāo)記的重組mscs細(xì)胞,然后冰凍切片免疫熒光染色,檢驗(yàn)重組mscs細(xì)胞移植進(jìn)入體內(nèi)以后的遷移、增殖、分化能力,結(jié)果如圖7所示。圖7中,bmscnc代表空白對(duì)照組細(xì)胞,cm-dil(+)代表體外活細(xì)胞染料cm-dil標(biāo)記的bmsc細(xì)胞,細(xì)胞帶有紅色熒光,gfap(+)代表脊髓組織細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗體表達(dá)陽(yáng)性的區(qū)域組織細(xì)胞,細(xì)胞帶有綠色熒光,hoechst33342(+)代表視野內(nèi)所有具有細(xì)胞核的細(xì)胞,細(xì)胞帶有藍(lán)色熒光,merge為以上三幅圖疊加后的結(jié)果。圖7表明,體外用活細(xì)胞染料cm-dil標(biāo)記bmsc,移植進(jìn)入脊髓損傷的sd大鼠體內(nèi),細(xì)胞不但可以存活且遷移至脊髓損傷部位,還可以分化為神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)細(xì)胞。
通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可知,采用本發(fā)明的方法,通過(guò)在間充質(zhì)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mir-124和mir-21,所得到的重組間充質(zhì)干細(xì)胞具有高遷移能力和高增殖能力,該重組間充質(zhì)干細(xì)胞可用于脊髓損傷的修復(fù)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,并不用于限制本發(fā)明,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和變型,這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
<110>蘇州大學(xué)
<120>重組間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>20
<212>rna
<213>核苷酸序列
<400>1
uaaggcacgcggugaaugcc20
<210>2
<211>22
<212>rna
<213>核苷酸序列
<400>2
uagcuuaucagacugauguuga22