本發(fā)明屬于環(huán)境工程廢渣利用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用糠醛渣制備固定化載酶材料的方法。本發(fā)明還涉及該糠醛渣固定化載酶材料固定化酶的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糠醛渣是玉米芯、稻殼等農(nóng)副產(chǎn)品加工剩余物中聚戊糖成分高溫水解生產(chǎn)呋喃甲醛后得到的固體廢渣，含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具有良好的再利用價值。據(jù)報道，每生產(chǎn)1t糠醛就會有10噸以上的糠醛濕渣產(chǎn)生，我國糠醛渣年排放量可達300萬t。由于糠醛渣鹽分含量高，呈酸性，長期露天堆積，不僅會產(chǎn)生占地問題，還會給大氣、土壤、河流等帶來污染，因此糠醛渣的資源化利用問題亟需解決?？啡┰黳h值約為2，自然風干呈黃褐色，質(zhì)地松軟，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及少量的氮元素、磷元素等，含有大量的羥基、羧基等官能團，具有很好的化學反應(yīng)活性。因此，利用糠醛渣固定果膠酶不僅可以實現(xiàn)資源化利用，又可為糠醛渣在固酶方面的實際應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于利用糠醛渣實現(xiàn)資源化利用，使用糠醛渣固定化酶的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題，

一種糠醛渣固定化載酶材料的制備方法，其步驟為，

(1)原料預(yù)處理，用水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質(zhì)和水溶物，之后80℃烘干24h，再在粉煤機上破碎，過篩，得40-100目顆粒；

(2)糠醛渣-殼聚糖復合材料的制備，將15-40ml的質(zhì)量分數(shù)為2-5％的殼聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50ml的小燒杯中，超聲20-40min并磁力攪拌12h，之后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，再輕微研磨成40-100目顆粒，制得糠醛渣-殼聚糖復合材料；

(3)糠醛渣-殼聚糖-戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)，將質(zhì)量分數(shù)為4-5％的戊二醛和1.0g糠醛渣-殼聚糖復合材料按質(zhì)量比0.1-0.5∶1加入小燒杯中，超聲20-40min并磁力攪拌交聯(lián)10-12h，之后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80-100℃烘干10-20h，即制得糠醛渣固定化載酶材料。

作為優(yōu)化，步驟(2)中所述殼聚糖溶液中還含有質(zhì)量分數(shù)為1-3％的醋酸。

本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是糠醛渣固定化載酶材料的應(yīng)用和固定化酶的方法。

糠醛渣固定化載酶材料的應(yīng)用，其特征在于，作為固定化酶的載體應(yīng)用。

作為優(yōu)化，所述固定化酶為固定化果膠酶。

糠醛渣固定化載酶材料固定化酶的方法，其步驟為，

(1)稱取0.05g糠醛渣固定化載酶材料，置于10ml離心管中，再加入10mg/ml的果膠酶2-6ml；

(2)在水溫為37℃的恒溫振蕩器上震蕩4h后取出離心，上清液保留；

(3)取離心后的濾渣先用蒸餾水洗滌離心一次，再用ph＝3.5緩沖溶液洗滌兩次，即制得糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶。

作為優(yōu)化，步驟(3)后，將步驟(2)中獲得的上清液與步驟(3)中所述糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶放置于4℃冰箱保存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，保存6天時糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶的相對酶活為88.76-90.08％；

作為優(yōu)化，步驟(3)后，將步驟(2)中獲得的上清液與步驟(3)中所述糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶放置于4℃冰箱保存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，保存15天時糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶的相對酶活為79.88-80.28％；

作為優(yōu)化，步驟(3)后，將步驟(2)中獲得的上清液與步驟(3)中所述糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶放置于4℃冰箱保存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，保存21天時糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶的相對酶活為74.32-75.52％；

作為優(yōu)化，步驟(3)后，將步驟(2)中獲得的上清液與步驟(3)中所述糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶放置于4℃冰箱保存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，保存32天時糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶的相對酶活為70.92-73.12％。

本發(fā)明由糠醛渣和殼聚糖復合而成，即將糠醛渣與殼聚糖進行水溶分散，通過靜電自組裝技術(shù)制備出優(yōu)于單一炭基吸附材料的復合型固定化酶材料，本發(fā)明結(jié)合了糠醛渣和殼聚糖的優(yōu)勢，具有更為豐富的官能團，同時與殼聚糖的靜電自組裝效果更加優(yōu)異，該方法所用原料廉價易得、制備方法簡單，產(chǎn)品性能穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了上述糠醛渣和殼聚糖在固定化酶中的應(yīng)用，該糠醛渣復合材料固定化酶后可重復循環(huán)使用，回收方便，對環(huán)境無污染，進行廢渣再次利用，符合綠色化學的要求。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例糠醛渣固定化載酶材料固定化酶的流程圖；

圖2為本發(fā)明實施例1制備的糠醛渣固定化載酶材料的紅外光譜圖；

圖3為本發(fā)明實施例1制備的糠醛渣固定化載酶材料的掃描電鏡圖；

圖4為本發(fā)明實施例1制備的糠醛渣固定化載酶材料的光電子能譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作詳細的說明。

實施例1

一種糠醛渣固定化載酶材料的制備方法，其步驟為，

(1)原料預(yù)處理，用水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質(zhì)和水溶物，之后80℃烘干24h，再在粉煤機上破碎，過篩，得60-80目顆粒；

(2)糠醛渣-殼聚糖復合材料的制備，將25ml質(zhì)量分數(shù)為2％的殼聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50ml的小燒杯中，超聲20min，磁力攪拌12h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，輕微研磨成60-80目顆粒，制得糠醛渣-殼聚糖復合材料；所述殼聚糖溶液中還含有質(zhì)量分數(shù)為1％的醋酸；

(3)糠醛渣-殼聚糖-戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)，將4％戊二醛和1.0g糠醛渣-殼聚糖復合材料按質(zhì)量比0.1∶1加入小燒杯中，超聲20min，磁力攪拌交聯(lián)10h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，即制得糠醛渣固定化載酶材料。

實施例2

一種糠醛渣固定化載酶材料的制備方法，其步驟為，

(1)原料預(yù)處理，用水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質(zhì)和水溶物，之后80℃烘干24h，再在粉煤機上破碎，過篩，得80-100目顆粒備用。

(2)糠醛渣-殼聚糖復合材料的制備，將40ml質(zhì)量分數(shù)為3％的殼聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50ml的小燒杯中，超聲40min，磁力攪拌12h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，輕微研磨成80-100目顆粒，制得糠醛渣-殼聚糖復合材料；所述殼聚糖溶液中還含有質(zhì)量分數(shù)為1％的醋酸；

(3)糠醛渣-殼聚糖-戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)，將5％戊二醛和1.0g糠醛渣-殼聚糖復合材料按質(zhì)量比0.3∶1加入小燒杯中，超聲40min，磁力攪拌交聯(lián)10h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，即制得糠醛渣固定化載酶材料。

實施例3

一種糠醛渣固定化載酶材料的制備方法，其步驟為，

(1)原料預(yù)處理，用水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質(zhì)和水溶物，之后80℃烘干24h，再在粉煤機上破碎，過篩，得40-60目顆粒備用。

(2)糠醛渣-殼聚糖復合材料的制備，將15ml質(zhì)量分數(shù)為5％的殼聚糖溶液和1.0g糠醛渣加入50ml的小燒杯中，超聲30min，磁力攪拌12h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，輕微研磨成40-60目顆粒，制得糠醛渣-殼聚糖復合材料；所述殼聚糖溶液中還含有質(zhì)量分數(shù)為1％的醋酸；

(3)糠醛渣-殼聚糖-戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)，將5％戊二醛和1.0g糠醛渣-殼聚糖復合材料按質(zhì)量比0.5∶1加入小燒杯中，超聲30min，磁力攪拌交聯(lián)10h后用蒸餾水反復離心洗滌多次，80℃烘干12h，即制得糠醛渣固定化載酶材料。

實施例4考察不同儲存期下固定化果膠酶的相對酶活

稱取實施例1-3制備的糠醛渣固定化載酶材料各1.3g，分別做固定化果膠酶實驗。

糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的方法，其步驟為，

(1)分別稱取0.05g實施例1-3制備的糠醛渣固定化載酶材料，置于三個10ml離心管中，在三個離心管中再分別加入10mg/ml的果膠酶溶液2ml、4ml、6ml；

(2)在水溫為37℃的恒溫振蕩器上震蕩4h后取出離心，上清液保留；

(3)取離心后的濾渣先用蒸餾水洗滌離心一次，再用ph＝3.5緩沖溶液洗滌兩次，即制得糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶；

(4)將步驟(2)中獲得的上清液與步驟(3)中所述糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶放置于4℃冰箱保存。

將實施例1制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶在4℃環(huán)境下儲存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，分別在存儲6天、15天、21天和32天時測定相對酶活，存儲6天時相對酶活為89.14％；存儲15天時相對酶活是80.28％；存儲21天時相對酶活是74.32％，存儲32天時相對酶活是72.02％。

將實施例2制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶在4℃環(huán)境下儲存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，分別在存儲6天、15天、21天和32天時測定相對酶活，存儲6天時相對酶活為90.08％；存儲15天時相對酶活是81.08％；存儲21天時相對酶活是75.52％，存儲32天時相對酶活是70.92％。

將實施例3制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶在4℃環(huán)境下儲存，以制備糠醛渣固定化載酶材料固定的果膠酶當日酶活為100％計，分別在存儲6天、15天、21天和32天時測定相對酶活，存儲6天時相對酶活為88.76％；存儲15天時相對酶活是79.88％；存儲21天時相對酶活是74.60％，存儲32天時相對酶活是73.12％。

實施例5考察糠醛渣固定化載酶材料的載酶量

將實施例4中三個離心管離心分離后所得三種上清液分別用紫外分光光度計測定其在540nm處的吸光度變化值k540，代入標準曲線方程式中計算出對應(yīng)條件下固載后的上清液中殘留的未固定酶的質(zhì)量，即：載體載酶量＝(總酶量-未固定的酶量)/載體的質(zhì)量，然后計算載酶量。

經(jīng)測試和計算，實施例1制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶載酶量為133.68mg/g；實施例2制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶載酶量為158.78mmg/g；實施例3制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶載酶量為197.20mg/g。

實施例6測定相對酶活的方法

3，5-二硝基水楊酸比色法(簡稱dns法)原理：3，5-二硝基水楊酸在堿性環(huán)境中能夠與還原性糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)，被還原成氨基化合物，沸水浴中共熱5min后，溶液可在540nm波長下有最大吸收峰。

本實施例實驗中，果膠經(jīng)酶解反應(yīng)后被分解為還原性糖d-半乳糖醛酸，與3，5-二硝基水楊酸共熱后形成棕紅色的氨基化合物，即發(fā)生了顯色反應(yīng)。

精確稱取d-(+)-半乳糖醛酸1.00g，加入ph＝3.5緩沖溶液溶解，轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶定容，制得1mg/ml的糖標準液作為標準樣，制作標準曲線。

測定相對酶活方法：取兩支25ml比色管，分別編號為1#和2#；向1#比色管中加入實施例4制備的任一糠醛渣復合材料固定化果膠酶0.05g；再分別向1#和2#比色管中加入2ml的ph＝3.5緩沖溶液；接著向1#比色管中加入10mg/ml的果膠1ml，2#比色管中不加入果膠，兩支比色管均迅速搖勻，在45℃水浴中反應(yīng)120min后，再向1#和2#兩支比色管中分別加入2mol/l的naoh溶液5ml和dns試劑1.5ml，接著繼續(xù)沸水煮沸5min，再用自來水冷卻，并用蒸餾水定容；從1#比色管中取2ml反應(yīng)液盛于標記為3#的容積為10ml比色管內(nèi)，從2#比色管中也取2ml反應(yīng)液盛于標記為4#的容積為10ml比色管內(nèi)，并將3#和4#比色管稀釋至刻度線，將4#比色管中溶液為背景參比，測兩支比色管的吸光度。3#比色管所測吸光度比值通過標準曲線計算酶活。

實施例7

取實施例3制備的糠醛渣固定化載酶材料按實施例4方法固定化果膠酶后，按實施例6所述方法進行果膠催化降解實驗，催化條件為：取50mg實施例3制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶在ph＝3.5、溫度為45℃條件下對初始濃度c0＝15mg/ml的果膠進行催化降解120min，再過濾取出所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶，測定濾液吸光度后，計算得到固定化果膠酶第一次催化降解時的相對酶活為95.52％。

按上述方法再重復使用所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶催化降解6次，測得重復使用1次后所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的相對酶活下降為92.66％，重復使用2次后所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的相對酶活下降為87.16％，重復使用3次后所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的相對酶活下降為86.37％，重復使用4次后所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的相對酶活下降為85.45％，重復使用5次后所述糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶的相對酶活下降為83.62％，重復使用6次后相對酶活下降為81.78％。

實施例8考察糠醛渣固定化載酶材料的負載情況

將實施例1中制備的糠醛渣固定化載酶材料做紅外光譜圖、掃描電鏡、光電子能譜圖，見圖2-4。

由圖2可知，由糠醛渣和糠醛渣固定化載酶材料的紅外光譜圖可得到以下結(jié)論：①在1683cm^-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，并且峰強度很大，是殼聚糖的氨基與戊二醛的醛基發(fā)生schiff反應(yīng)而形成的schiff堿鍵(c＝n)的吸收峰和戊二醛沒有參與反應(yīng)的另一個c＝0伸縮振動所產(chǎn)生的；②1020cm^-1處的吸收峰也明顯增強，是由n-h和n-c的彎曲振動；③殼聚糖中的0-h和n-h的伸縮振動使得3333cm^-1處的吸收峰明顯增強，2900cm^-1處的c-h的伸縮振動吸收峰也有一定程度的增強。

由圖3可知，預(yù)處理后的糠醛渣為層狀結(jié)構(gòu)，其表面較平整，比表面積較大。

由圖4可知，根據(jù)光電子能譜元素分析可知糠醛渣固定化載酶材料檢測出新的特征吸收峰n1s(400ev)，說明殼聚糖已包裹到糠醛渣表面符合所制備糠醛渣固定化載酶材料的表面組成特征。

對比例考察現(xiàn)有載酶材料固定化果膠酶情況

取寧夏汝箕溝礦太西煤作為吸附材料，其最大載酶量為56.5mg/g，且連續(xù)使用7次后相對酶活僅為32.3％。

取磁性氧化石墨烯作為載體固定化果膠酶，在連續(xù)使用7次后相對酶活為58％。

取環(huán)氧微球作為載體對果膠酶進行固定化，得到活力較高的固定化果膠酶，在連續(xù)使用7次后相對酶活為56.4％。

通過與對比例比較后發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的糠醛渣固定化果膠酶具有較好的操作穩(wěn)定性，本發(fā)明制備的糠醛渣固定化載酶材料固定化果膠酶在存儲32d后的相對酶活保持在70％以上，并且具有較高的操作穩(wěn)定性，在連續(xù)使用7次后，相對酶活還保持在80％以上。

上述結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式作了詳細說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以對其做出種種變化。