發(fā)明領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本申請(qǐng)涉及對(duì)樣品中的目標(biāo)核酸片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的方法、試劑盒、系統(tǒng)及其應(yīng)用。

發(fā)明背景

基因突變，特別是點(diǎn)突變，是生物學(xué)領(lǐng)域中生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下的常見現(xiàn)象。因此，對(duì)于基因突變的檢測(cè)在很多領(lǐng)域中具有重要意義。

目前，對(duì)于檢測(cè)基因突變，公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)是sanger測(cè)序法。但是，該方法要求樣品中突變基因的豐度比較高，通常在20％以上才能夠進(jìn)行檢測(cè)。因此，對(duì)于某些低頻突變而言，直接應(yīng)用測(cè)序法存在較大困難或難以實(shí)現(xiàn)。

因此，基因突變檢測(cè)方法，特別是對(duì)于低頻突變的檢測(cè)方法亟需改進(jìn)。本申請(qǐng)針對(duì)該需求提供了新的用于對(duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段(特別是樣品中的低頻突變)進(jìn)行偏向擴(kuò)增的方法、試劑盒以及系統(tǒng)，從而為基因突變檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明概述

第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的方法，目標(biāo)片段相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變，所述方法包括以下步驟：

(1)提供與所述目標(biāo)核酸序列的野生型形式的至少一部分的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列，其中所述封閉序列中包含一處或多處鎖核酸置換；

(2)提供包含所述樣品、封閉序列和根據(jù)所述目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的正向和反向引物的pcr反應(yīng)體系并進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，其中變性步驟包括：

升溫至足夠高的溫度，使所述封閉序列與所述樣品中的核酸接 觸，隨后降溫至第一溫度使所述封閉序列與所述目標(biāo)核酸序列以及目標(biāo)序列的野生型形式形成雙鏈體，其中所述第一溫度高于所述引物與模板的退火溫度，

隨后升溫至第二溫度(即關(guān)鍵變性溫度tc)，所述第二溫度比所述封閉序列與所述目標(biāo)序列的野生型形式形成的雙鏈體的熔解溫度(tm)低約1-5℃，并且高于目標(biāo)序列的野生型形式雙鏈體的tm。

在一些實(shí)施方案中，方法還包括分離和純化步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)片段包含約40-250個(gè)堿基。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列包含約10％至約100％的鎖核酸置換。

在一些實(shí)施方案中，鎖核酸置換在封閉序列中為基本上均勻地分布。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列的長(zhǎng)度比目標(biāo)片段短約20-40個(gè)堿基，且封閉序列的兩端與步驟(3)使用的正向和反向引物分別有大約3-5個(gè)堿基的重疊。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列在3’端包含防止所述封閉序列在pcr反應(yīng)中進(jìn)行延伸的化學(xué)修飾，例如磷酸化修飾、c3-間隔子修飾、c6-間隔子修飾。

第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的試劑盒，目標(biāo)片段相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變，所述試劑盒包含與目標(biāo)片段的野生型形式的至少一部分的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列，其中封閉序列中包含一處或多處鎖核酸置換。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含根據(jù)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)的正向和反向引物。

在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)片段包含約40-250個(gè)堿基。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列包含約10％至約100％的鎖核酸置換。

在一些實(shí)施方案中，鎖核酸置換在封閉序列中為基本上均勻地分布。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列的長(zhǎng)度比目標(biāo)片段短約20-40個(gè)堿基，且封閉序列的兩端與步驟(3)使用的正向和反向引物分別有大約3-5個(gè)堿基的重疊。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列在3’端包含防止所述封閉序列在pcr反應(yīng)中進(jìn)行延伸的化學(xué)修飾，例如磷酸化修飾、c3-間隔子修飾、c6-間 隔子修飾。

第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括合成第一方面所述的封閉序列的裝置以及實(shí)施第一方面所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)的可控溫?cái)U(kuò)增裝置。

第四方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜跈z測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)片段中的突變的方法，所述方法包括鑒定根據(jù)第一方面所述的方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中的突變。

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1顯示tp53-第8外顯子克隆用載體puc57。

圖2顯示四條封閉序列的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

圖3顯示3％瓊脂糖電泳驗(yàn)證退火結(jié)果，其中泳道1-5為bs60-1、bs60-2、bs60-3、bs60-4以及rs60與rs60rc退火后的產(chǎn)物，泳道6為相應(yīng)pcr產(chǎn)物pcr-60，泳道7-12分別為單鏈bs60-1、bs60-2、bs60-3、bs60-4、rs60以及rs60rc；泳道m(xù)為dnamarkerdl2000。

圖4顯示熔解曲線圖，其中bs60-1、bs60-2、bs60-3、bs60-4、rs60分別表示四條封閉序列以及參考序列rs60分別它們的反向互補(bǔ)序列rs60rc退火所形成產(chǎn)物的熔解曲線；pcr-60則表示擴(kuò)增得到的相應(yīng)pcr產(chǎn)物pcr-60的熔解曲線。

圖5顯示不同突變體突變位點(diǎn)在不同封閉序列中對(duì)應(yīng)的位置，圖中有下劃線的字母表示相應(yīng)鎖核酸單體。

圖6顯示不同單堿基錯(cuò)配對(duì)4條封閉序列及參考序列rs60tm值的影響。

圖7顯示偏向擴(kuò)增的示意性流程圖，圖中封閉序列上的“*”代表鎖核酸單體，3’端的“●”表示化學(xué)修飾。

圖8顯示不同tc值下偏向擴(kuò)增對(duì)純野生型和純突變型的擴(kuò)增情況。

圖9顯示偏向擴(kuò)增的擴(kuò)增情況效果。

圖10顯示不同濃度封閉序列存在以及不同tc值下，偏向擴(kuò)增對(duì)同一樣本(含有5％g818a突變)的富集情況。

圖11顯示不同tc值下，偏向擴(kuò)增對(duì)同一樣本(含有3％c847t突變) 的富集情況。

序列簡(jiǎn)要說明

seqidno:1為包含tp53基因第8外顯子區(qū)的野生型序列的載體克隆序列。

seqidno:2和3分別為將野生型以及4個(gè)突變型tp53第8外顯子克隆進(jìn)大腸桿菌克隆載體puc57中所用的正向和反向引物。

seqidno:4和5分別為實(shí)施例4中用于擴(kuò)增87bp擴(kuò)增子的正向和反向引物。

seqidno:6和7分別為實(shí)施例3中用于擴(kuò)增60bp擴(kuò)增子的正向和反向引物。

seqidno:8-12分別顯示了rs60、bs60-1、bs60-2、bs60-3以及bs60-4的序列結(jié)構(gòu)。

發(fā)明的詳細(xì)描述

本申請(qǐng)的發(fā)明人考慮到本領(lǐng)域中低頻基因突變檢測(cè)難的問題，經(jīng)過大量研究，開發(fā)出了一系列發(fā)明，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)包含低頻突變的核酸分子進(jìn)行偏向擴(kuò)增，經(jīng)過偏向擴(kuò)增的核酸分子可用于后續(xù)多種檢測(cè)方法，從而對(duì)低頻基因突變進(jìn)行鑒定。

為了進(jìn)一步地展示本申請(qǐng)的特征和優(yōu)勢(shì)，以下對(duì)一些具體實(shí)施方案進(jìn)行描述。應(yīng)當(dāng)理解，以下描述僅出于說明的目的，而并不是以任何方式加以限制。還應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合某一實(shí)施方案描述的技術(shù)特征也適用于其他實(shí)施方案，并且可以與結(jié)合其他實(shí)施方案描述的技術(shù)特征組合在一起，除非另作說明或者從上下文能夠作出其他判斷。

除非另外說明，本申請(qǐng)中的術(shù)語的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。

本文中給出的具體數(shù)值不僅可作為單獨(dú)的數(shù)值理解，還應(yīng)當(dāng)認(rèn)為提供了某一范圍的端點(diǎn)值，并且可以相互組合提供其他范圍。例如，當(dāng)公開了比例為1％或5％時(shí)，也相應(yīng)地公開了比例可以為1-5％。

本文所用的術(shù)語“約”(例如，在組分含量和反應(yīng)參數(shù)中)以本領(lǐng)域技 術(shù)人員通常能夠理解的含義來解釋。一般情況下，術(shù)語“約”可以理解為給定數(shù)值的正負(fù)5％范圍內(nèi)的任意數(shù)值，例如，約x可以代表95％x至105％x的范圍中的任意數(shù)值。

第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的方法，目標(biāo)片段相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變，所述方法包括以下步驟：

(1)提供與所述目標(biāo)核酸序列的野生型形式的至少一部分的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列，其中所述封閉序列中包含一處或多處鎖核酸置換；

(2)提供包含所述樣品、封閉序列和根據(jù)所述目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的正向和反向引物的pcr反應(yīng)體系并進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，其中變性步驟包括：

升溫至足夠高的溫度，使所述封閉序列與所述樣品中的核酸接觸，隨后降溫至第一溫度使所述封閉序列與所述目標(biāo)核酸序列以及目標(biāo)序列的野生型形式形成雙鏈體，其中所述第一溫度高于所述引物與模板的退火溫度，

隨后升溫至第二溫度(即關(guān)鍵變性溫度tc)，所述第二溫度比所述封閉序列與所述目標(biāo)序列的野生型形式形成的雙鏈體的熔解溫度(tm)低約1-5℃，并且高于目標(biāo)序列的野生型形式雙鏈體的tm。

本文所用的術(shù)語“核酸樣品”指核酸分子的混合樣品，包括，但不限于，從組織或細(xì)胞中提出的基因組核酸樣品或cdna核酸樣品。

本文所用的術(shù)語“目標(biāo)片段”是相對(duì)于“非目標(biāo)片段”而言，目標(biāo)片段指相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變的核酸片段。例如，目標(biāo)片段可以為基因編碼區(qū)的片段以及其他功能區(qū)的片段，例如，啟動(dòng)子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子等。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，非目標(biāo)片段可以包含未發(fā)生突變的目標(biāo)片段，即，野生型形式。如上文所述，本申請(qǐng)的各項(xiàng)發(fā)明特別適合于“目標(biāo)片段”在樣品中比例(即，目標(biāo)片段/(目標(biāo)片段+目標(biāo)片段野生型形式))較低的情況下。

在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)片段在樣品中的比例為約1-5％，例如約1％、2％、3％、4％或5％等。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本申請(qǐng)的各項(xiàng)發(fā)明同樣適合于目標(biāo)片段占核酸樣品中全部核酸分子的比例更低于或高于上述 范圍或數(shù)值的情況。

本文所用的術(shù)語“偏向擴(kuò)增”也可理解為“富集擴(kuò)增”，指對(duì)于目標(biāo)片段的擴(kuò)增程度高于對(duì)非目標(biāo)片段(例如，野生型目標(biāo)片段)的擴(kuò)增程度，從而將目標(biāo)片段突出地展示于核酸樣品中。例如，在某個(gè)核酸樣品中，目標(biāo)片段的原始比例為1％，非目標(biāo)片段的原始比例為99％；經(jīng)過“偏向擴(kuò)增”后，目標(biāo)片段的比例變?yōu)?0％，而非目標(biāo)片段的原始比例為80％，那么目標(biāo)片段則得到了20倍的富集。

本文所用的術(shù)語“野生型”指某一核酸分子在天然情況下最常見的形式。通常，“野生型核酸”指未發(fā)生任何突變的核酸分子。

在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)片段包含約40-250個(gè)堿基，例如約40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250個(gè)堿基等，或上述值組成的任意范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠理解，目標(biāo)片段也可以包含約更多或更少的堿基。

在步驟(1)中，提供與目標(biāo)片段的野生型形式的至少一部分的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列，其中封閉序列中包含一處或多處鎖核酸置換。目標(biāo)片段的野生型序列通常是能夠獲得的，因此，與其正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列的序列也是能夠獲得的。同時(shí)，在合成某一序列中引入鎖核酸置換的技術(shù)也是已知的。

本文所用的術(shù)語“鎖核酸置換”指用鎖核酸單體替換原有的天然核苷酸單體。例如，對(duì)于序列“acgg”而言，對(duì)第二位進(jìn)行“鎖核酸置換”指用鎖核酸單體c^*替換原始的c，置換后序列為“ac^*gg”。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列包含約10％至約100％的鎖核酸置換。換言之，目標(biāo)片段的野生型形式中約10％至100％堿基被替換為鎖核酸單體。例如，所述比例可以為約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％等，或上述值組成的任意范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于某一核酸序列中所含的堿基數(shù)目是不定的，因此，上文所述的比例應(yīng)當(dāng)理解為大致的指導(dǎo)值而不一定為確切值。例如，對(duì)于包含63個(gè)堿基的核酸序列而言，其20％為12.6，那么鎖核酸置換的數(shù)量可以理解為12，也可以理解為13；同樣，其50％為31.5，那么鎖核酸置換的數(shù)量可以理解為 31，也可以理解為32。

在一些實(shí)施方案中，鎖核酸置換在封閉序列中為基本上均勻地分布。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，“基本上”均勻的分布是指置換后的各個(gè)鎖核酸堿基之間所間隔的未置換堿基的數(shù)量基本相同。在一些實(shí)施方案中，“基本上”均勻的分布是指置換后的各個(gè)鎖核酸堿基之間所間隔的未置換堿基的數(shù)量最大變異不超過3個(gè)。例如，置換后的各個(gè)鎖核酸堿基之間所間隔的未置換堿基的數(shù)量最少的為n，最多可以為n+1、n+2或n+3，或者可以全部為n。

在一些具體實(shí)施方案中，鎖核酸置換被設(shè)計(jì)為每隔2-5個(gè)堿基存在一處鎖核酸置換，例如，鎖核酸置換的分布為每隔2、3、4或5個(gè)未置換堿基存在一個(gè)置換堿基。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列的長(zhǎng)度比目標(biāo)片段短約20-40個(gè)堿基，且封閉序列的兩端與步驟(3)使用的正向和反向引物分別有大約3-5個(gè)堿基的重疊。不希望被任何理論束縛，這樣的實(shí)施方案在目標(biāo)片段較短的情況下能夠產(chǎn)生較高的效率。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列在3’端包含防止所述封閉序列在pcr反應(yīng)中進(jìn)行延伸的化學(xué)修飾，例如磷酸化修飾、c3-間隔子修飾、c6-間隔子修飾。

在步驟(2)中，提供包含所述樣品、封閉序列和根據(jù)所述目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的正向和反向引物的pcr反應(yīng)體系并進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)的pcr擴(kuò)增反應(yīng)中的正向和反向引物的方法，以及實(shí)施pcr擴(kuò)增反應(yīng)所需要的常規(guī)試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，除了樣品、封閉序列和引物之外，pcr反應(yīng)體系還可以包括擴(kuò)增反應(yīng)所需的任意一種或多種試劑，例如dna聚合酶、dntp等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠容易理解，pcr反應(yīng)一般為多循環(huán)擴(kuò)增(例如，20-40個(gè)循環(huán))，并且每一循環(huán)通常包括變性、退火和延伸步驟。

本申請(qǐng)的pcr循環(huán)中的變性步驟包括兩個(gè)階段：

第一階段，升溫至足夠高的溫度，使封閉序列與核酸樣品接觸(此時(shí)核酸樣品中的核酸雙鏈能夠開鏈)，隨后降溫至第一溫度使封閉序列與目標(biāo)核酸序列以及目標(biāo)序列的野生型形式形成雙鏈體，其中所述第一溫 度高于所述引物與模板的退火溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在足夠高的溫度下(例如，95℃以上)，雙鏈核酸會(huì)發(fā)生變性，分開為兩條單鏈。因此，當(dāng)單鏈封閉序列能夠與解鏈的目標(biāo)片段的正義鏈或反義鏈接觸時(shí)，由于單鏈封閉序列與目標(biāo)片段的正義鏈或反義鏈互補(bǔ)(取決于封閉序列是針對(duì)正義鏈還是反義鏈設(shè)計(jì))，因此，構(gòu)成了結(jié)合為雙鏈(封閉/目標(biāo)雙鏈)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。并且，由于鎖核酸置換的引入，封閉/目標(biāo)雙鏈的tm值會(huì)高于目標(biāo)/目標(biāo)雙鏈(即，原始目標(biāo)片段的正義鏈和反義鏈形成的雙鏈)的tm值，因此，隨著降溫過程，封閉/目標(biāo)雙鏈會(huì)優(yōu)先形成。將第一溫度設(shè)定為高于引物與模板的退火溫度可以避免或降低引物結(jié)合對(duì)上述過程的干擾。

在一些實(shí)施方案中，降溫過程為自然降溫。

在一些實(shí)施方案中，降溫過程也可以為受控降溫。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列相對(duì)于目標(biāo)片段是過量的。

第二階段，升溫至第二溫度，所述第二溫度比所述封閉序列與所述目標(biāo)序列的野生型形式形成的雙鏈體的熔解溫度(tm)低約1-5℃，并且高于目標(biāo)序列的野生型形式雙鏈體的tm。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，由于目標(biāo)片段相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變，并且封閉序列與目標(biāo)片段的野生型形式的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)，因此，步驟(2)中形成的封閉/目標(biāo)雙鏈會(huì)包含錯(cuò)配；同時(shí)，由于核酸樣品中還可能包含目標(biāo)片段的野生型形式，那么步驟(2)中形成的封閉/野生型目標(biāo)雙鏈則不包含錯(cuò)配。本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述“封閉/目標(biāo)雙鏈”的熔解溫度(tm)比“封閉/野生型目標(biāo)雙鏈”的熔解溫度(tm)具有較為明顯的降低，通常為約1-5℃，例如約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5℃。因此，通過控制pcr反應(yīng)中的變性溫度，能夠?qū)崿F(xiàn)“封閉/目標(biāo)雙鏈”大量解鏈，而“封閉/野生型目標(biāo)雙鏈”解鏈程度較低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)片段的偏向擴(kuò)增。此外，如上文所述，由于封閉序列與目標(biāo)片段優(yōu)先形成封閉/目標(biāo)雙鏈，因此體系中封閉/目標(biāo)雙鏈的量大大高于目標(biāo)片段野生型形式雙鏈體，這也使得“封閉/目標(biāo)雙鏈”解鏈作為主要的引物結(jié)合模板。

作為非限制性實(shí)例，步驟(2)可以如下實(shí)施：

首先，將pcr體系升溫至足夠高的溫度(例如，95℃以上)，隨后降 溫至明顯高于引物與模板的退火溫度的第一溫度，再升溫至第二溫度，在第二溫度下，封閉序列與目標(biāo)片段之間形成的雙鏈將優(yōu)先打開；隨后，降溫至引物退火溫度下進(jìn)行退火；再升溫至72℃進(jìn)行延伸。

重復(fù)上述步驟30個(gè)循環(huán)后再于72℃延伸約3min后，結(jié)束整個(gè)pcr反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，上文所述的方法還包括分離和純化步驟(2)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的分離和純化技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如，可以通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物混合物進(jìn)行分級(jí)，然后根據(jù)目標(biāo)片段的長(zhǎng)度對(duì)所在分子量處的條帶進(jìn)行核酸分離純化。

第二方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的試劑盒，目標(biāo)片段相對(duì)于其野生型形式具有一處或多處突變，所述試劑盒包含與目標(biāo)片段的野生型形式的至少一部分的正義鏈和/或反義鏈互補(bǔ)的單鏈封閉序列，其中封閉序列中包含一處或多處鎖核酸置換。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含根據(jù)所述目標(biāo)片段設(shè)計(jì)的正向和反向引物。

在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)片段包含約40-250個(gè)堿基。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列包含約10％至約100％的鎖核酸置換。

在一些實(shí)施方案中，鎖核酸置換在封閉序列中為基本上均勻地分布。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列的長(zhǎng)度比目標(biāo)片段短約20-40個(gè)堿基，且封閉序列的兩端與步驟(3)使用的正向和反向引物分別有大約3-5個(gè)堿基的重疊。

在一些實(shí)施方案中，封閉序列在3’端包含防止所述封閉序列在pcr反應(yīng)中進(jìn)行延伸的化學(xué)修飾，例如磷酸化修飾、c3-間隔子修飾、c6-間隔子修飾。

第三方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜趯?duì)核酸樣品中的目標(biāo)片段進(jìn)行偏向擴(kuò)增的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括合成第一方面所述的封閉序列裝置以及實(shí)施第一方面所述的pcr擴(kuò)增反應(yīng)的可控溫?cái)U(kuò)增裝置。用于在合成序列中定點(diǎn)引入鎖核酸置換的設(shè)備是能夠購(gòu)買到的，并且目前已有的很多類型的pcr儀都可以用于第一方面所述的方法中，其中對(duì)于pcr設(shè)備的低要求性也是本申請(qǐng)的優(yōu)勢(shì)之一。

第四方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜跈z測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)片段中的突變的方法，所述方法包括鑒定根據(jù)第一方面所述的方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中的突變。例如，如果目標(biāo)片段中的突變性質(zhì)未知的情況下，可以采用測(cè)序法，此時(shí)經(jīng)過偏向擴(kuò)增后，核酸樣品中目標(biāo)片段的比例已大幅度提高，能夠滿足測(cè)序的要求。例如，如果目標(biāo)片段中的突變位置和突變形式已知的情況下，則可以采用探針雜交法，當(dāng)然，也可以采用測(cè)序法。

應(yīng)當(dāng)理解，在不存在矛盾的情況下，第一方面所描述的技術(shù)特征和實(shí)施方案也適用于第二至第四方面。

還應(yīng)當(dāng)理解，以上詳細(xì)描述僅為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地了解本申請(qǐng)的內(nèi)容，而并非意圖在任何方面加以限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)λ鰧?shí)施方案進(jìn)行各種改動(dòng)和變化。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本申請(qǐng)，而并非加以任何限制。

實(shí)施例1.標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣本的建立

之前已有研究人員對(duì)tp53基因第8外顯子區(qū)的突變檢測(cè)進(jìn)行過研究，在本研究中也選取了該檢測(cè)對(duì)象來驗(yàn)證本申請(qǐng)的方案，tp53基因第8外顯子區(qū)的野生型序列顯示于seqidno:1。

5’-cttactgcctcttgcttctcttttcctatcctgagtagcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgaggtaagcaagcaggacaagaagcggtggaggagaccaagggtgcagttatgcctca-3’(seqidno:1)

上述序列為克隆進(jìn)載體的野生型序列，其中下劃線部分為tp53第8外顯子的野生型序列，雙下劃線部分為下文實(shí)施例檢測(cè)的擴(kuò)增子區(qū)(87bp)。

具體而言，選擇了4株細(xì)胞系，它們分別含有tp53第8外顯子區(qū)的不同組成型突變，有關(guān)這4株細(xì)胞系的詳細(xì)信息見表1。建立了這4株細(xì)胞系的培養(yǎng)方法，并且提取了它們的全基因組dna。通過將它們的全基因組dna按照一定的比例稀釋到正常人類細(xì)胞的全基因組dna去，已成功建立了一系列標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣本，這樣建立的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)樣本可以模擬臨床檢測(cè)樣本。

表1細(xì)胞系及相關(guān)基因突變信息

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為了避免頻繁地培養(yǎng)細(xì)胞以及提取全基因組dna，將野生型以及上述4個(gè)突變型tp53第8外顯子分別克隆進(jìn)了大腸桿菌克隆載體puc57中(圖1)，所用的引物如下：

tp8-230f1:5’-cgcttactgcctcttgcttc-3’(seqidno:2)

tp8-230r1:5’-ctctgaggcataactgcacc-3’(seqidno:3)

劃線部分顯示的是酶切位點(diǎn)，選用的酶切位點(diǎn)分別為saci和bamhi。由此，可以通過提取上述幾種突變型質(zhì)粒，并將它們按不同比例稀釋到野生型質(zhì)粒中，能夠方便地制備各種標(biāo)準(zhǔn)樣品。

實(shí)施例2.封閉序列的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)上述四個(gè)突變所在的位置，設(shè)計(jì)了能否覆蓋它們的參考序列rs60(referencesequence，60個(gè)堿基)，該參考序列相當(dāng)于本文所述的目標(biāo)片段的野生型形式。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了4條不同的鎖核酸序列作為封閉序列：bs60-1、bs60-2、bs60-3以及bs60-4(blockingsequence，60個(gè)堿基，編號(hào)1、2、3、4)，它們與rs60的堿基序列完全一致，但摻入了不同比例的鎖核酸單體。rs60、bs60-1、bs60-2、bs60-3以及bs60-4如下：

rs60:

5’-ctctgtgcgccggtctctcccaggacaggcacaaacacgcacctcaaagctgttccgtcc-c3間隔子-3’(seqidno:8)

bs60-1:

5’-cttgtggccgtctccccagacagcacaacagc actcaagctgtccgcc-c3間隔子-3’(seqidno:9)

bs60-2:

5’-cttgtgcccggttctccaggacggcacaacaccacccaaagcgttcctcc-c3間隔子-3’(seqidno:10)

bs60-3:

5’-ctctgtcgccggctctcccggacaggccaaacagcacctcaagctgtccgtcc-c3間隔子-3’(seqidno:11)

rs60-4:

5’-cctgtcgcggctccccagacggccaacaccacccaagcgttcgtc-c3間隔子-3’(seqidno:12)

上述序列中斜體帶星號(hào)字母所示即為相應(yīng)鎖核酸單體。

通過固相合成法在abiexpedite8909核酸合成儀上合成了上述設(shè)計(jì)的4條封閉序列，并通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了分離，從page膠上回收純化得到了相應(yīng)的寡核苷酸序列，進(jìn)而對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的分子量進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖2所示。質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示：所測(cè)定的分子量與理論分子量基本一致，

此外，還合成了rs60以及rs60的反向互補(bǔ)序列rs60rc(rs60reversecompliment)。

實(shí)施例3.封閉序列熔解溫度(tm值)的測(cè)定

通過熔解曲線法測(cè)定了實(shí)施例2所合成的四條封閉序列的tm值。

首先，將四條封閉序列以及參考序列rs60分別與它們的反向互補(bǔ)序列(rs60rc)等摩爾混勻后置于沸水浴中，高溫變性2min后，關(guān)閉電源，使樣品的溫度隨著水溫降低而逐漸降低至室溫，從而實(shí)現(xiàn)退火，生成相應(yīng)雙鏈。為了驗(yàn)證退火效率，我們對(duì)上述退火產(chǎn)物進(jìn)行了3％瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示于圖3。

如圖3所示：5組退火產(chǎn)物均與相應(yīng)pcr產(chǎn)物pcr-60(表示長(zhǎng)為60bp，seqidno:6：5’-ggacggaacagcttt-3’；seqidno:7：5’-ctctgtgcgccggtc-3’)有著一致的條帶，且與6條單鏈序列的條帶位置明顯不同，說明封閉序列、參考序列與它們的反向互補(bǔ)序列之間的退火成功。

接下來，通過熔解曲線實(shí)驗(yàn)測(cè)定了rs60以及這4條封閉序列的tm值。實(shí)驗(yàn)在bioradcfx96型實(shí)時(shí)pcr儀上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖4，如圖4所示：rs60退火產(chǎn)物與相應(yīng)pcr產(chǎn)物pcr-60的tm值完全一致，再次說明了退火的成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示全部四條封閉序列的tm值均較天然序列rs60明顯要高(實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的tm值如表2所示)，并且隨著封閉序列中所摻入lna單體數(shù)量的增加，其tm值也隨之增加。

表2封閉序列與參考序列與反向互補(bǔ)序列退火的tm

由此證實(shí)了：相對(duì)于天然寡核苷酸序列，鎖核酸對(duì)其反向互補(bǔ)的dna序列有著更強(qiáng)的親和力。這也使得通過調(diào)整封閉序列中的鎖核酸數(shù)量，使得關(guān)鍵變性溫度tc(低于封閉序列與靶標(biāo)dna之間的tm值)略高于pcr產(chǎn)物的tm值成為可能。

實(shí)施例4.單堿基突變對(duì)封閉序列tm值的影響

在本實(shí)施例中，仍然通過熔解曲線法研究了不同單堿基突變對(duì)不同封閉序列以及參考序列rs60tm值的影響。首先，采用seqidno：4和5所示的引物(seqidno:4：5’-tggtaatctactgggacg-3’；seqidno:5：5’-cggagattctcttcctct-3’)，對(duì)實(shí)施例1所述的野生型以及不同類型的突變基因進(jìn)行了pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為87bp。

隨后，通過將過量封閉序列與pcr產(chǎn)物混合后于高溫變性后，再于70℃進(jìn)行退火。實(shí)驗(yàn)采用4條不同的封閉序列以及包括野生型和4種突變型在內(nèi)的五種pcr產(chǎn)物。這些封閉序列中l(wèi)na單體所處的位置以及突變基因中突變位點(diǎn)所處的位置如圖5所示。

最后，對(duì)上述退火產(chǎn)物的熔解曲線進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和表3所示。

表3不同的單堿基錯(cuò)配對(duì)封閉序列tm值的影響

從圖6和表3所示實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)于這四條不同的封閉序列，四種不同的單堿基錯(cuò)配導(dǎo)致其tm值下降了1.1-3.0℃，較天然序列rs60而言(同樣四種不同的單堿基錯(cuò)配所引起的tm值下降僅為0.2-0.8℃)，它們識(shí)別錯(cuò)配的能力有了明顯提高。值得注意的是，通過以上熔解曲線分析tm值結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，似乎單堿基突變引起tm值的改變與封閉序列中含有l(wèi)na單體的數(shù)量，以及l(fā)na單體相對(duì)于單堿基突變點(diǎn)的位置并無明顯相關(guān)性。

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了：相對(duì)于天然核酸，鎖核酸有著更強(qiáng)的識(shí)別錯(cuò)配能力。

實(shí)施例5.偏向擴(kuò)增平臺(tái)的建立

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇了封閉序列bs60-1來搭建本申請(qǐng)?zhí)岢龅钠驍U(kuò)增平臺(tái)，簡(jiǎn)要流程如圖7所示。

1封閉序列優(yōu)先抑制野生型模板的擴(kuò)增

首先，以單獨(dú)的野生型和突變型序列為模板，在高濃度(25nm)封閉序列bs60-1存在的條件下，對(duì)偏向擴(kuò)增的關(guān)鍵變性溫度(criticaldenaturetemperature，tc)進(jìn)行了梯度擴(kuò)增，結(jié)果顯示于圖8。

從圖8所示，隨著關(guān)鍵變性溫度tc的降低，從第4泳道起，野生型已經(jīng)看不到目的條帶的擴(kuò)增，而兩個(gè)突變型都至少在第5泳道下都還可以看到清晰的目的條帶。由此說明，在高濃度封閉序列bs60-1存在的條 件下，偏向擴(kuò)增對(duì)突變型的擴(kuò)增效率明顯優(yōu)于對(duì)野生型的擴(kuò)增效率。

2偏向擴(kuò)增條件的優(yōu)化

以含有g(shù)818a/(g818a+wt)＝5％的標(biāo)準(zhǔn)混合樣本作為模板，在反應(yīng)體系中添加不同濃度的封閉序列bs60-1的情況下，在不同tc值條件下進(jìn)行了偏向擴(kuò)增。圖9顯示了典型的偏向擴(kuò)增中梯度擴(kuò)增的結(jié)果。結(jié)合測(cè)序結(jié)果，我們對(duì)不同條件下的富集效果進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖10所示。從圖10所顯示的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著封閉序列濃度的增加，最佳tc值也隨之增加，但最終的富集效果并沒有隨封閉序列濃度的增加而有明顯改變。根據(jù)這一結(jié)果，我們選擇了在中濃度(2.5nm)封閉序列bs60-1存在的條件下進(jìn)行后續(xù)的偏向擴(kuò)增條件優(yōu)化。

接下來，我們以c847t/(c847t+wt)＝3％的標(biāo)準(zhǔn)混合樣本為模板，在中濃度封閉序列bs60-1存在的條件下，對(duì)最佳tc值進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示于圖11。

如圖11所示，盡管g818a單堿基突變所導(dǎo)致的δtm最大，而c847t單堿基突變所導(dǎo)致的δtm最小(表3)，利用這兩個(gè)突變分別進(jìn)行優(yōu)化所得到的最佳tc值基本一致。

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本申請(qǐng)?zhí)岢龅钠驍U(kuò)增平臺(tái)的成功。