本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及利用體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄等技術(shù)提供了一種適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模平行制備單鏈dna的方法。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)捂渄na是生命科學(xué)等領(lǐng)域研究的一種基本工具，近期在生物醫(yī)藥研究和發(fā)展中均取得了一些重大突破。在生物醫(yī)療領(lǐng)域，反義單鏈dna已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為基因靶向治療的藥物，用于抗病毒、抗腫瘤和治療遺傳性疾??；此外，當(dāng)前的基因和分子生物研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域取得的諸多進(jìn)步，如生物基因組快速掃描技術(shù)、二代測(cè)序技術(shù)，必須依靠大規(guī)模平行制備的單鏈dna，表i是單鏈dna的各種應(yīng)用的列表：表i單鏈dna的應(yīng)用單鏈dna類型應(yīng)用引物dna測(cè)序、pcr探針克隆雜交、診斷雜交基因組合成基因組藥物反義療法生理研究核磁共振、x射線晶體分析法目前，單鏈dna主要采用化學(xué)合成的方法，分為固相合成法和液相合成法，固相合成法通常使用亞磷酰胺縮合反應(yīng)方式，液相合成法通常使用磷酸三酯縮合反應(yīng)方式或者氫膦酸酯縮合反應(yīng)方式，但其均存在產(chǎn)物純度低，而純化十分困難，且合成的目標(biāo)序列出錯(cuò)率極高，大規(guī)模合成單鏈dna的成本十分昂貴等問(wèn)題，大大限制了寡核酸的研究和應(yīng)用。目前雖然已開(kāi)發(fā)芯片技術(shù)為大規(guī)模平行合成單鏈dna提供了一種相對(duì)簡(jiǎn)單便捷的方法，但是，大多受到合成單鏈dna種類或?qū)嶒?yàn)條件等方面的限制而無(wú)法推廣成為一種實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法。為克服以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明在傳統(tǒng)化學(xué)合成單鏈dna的方法上進(jìn)行改進(jìn)和擴(kuò)展，利用體外轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄等技術(shù)提供了一種適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模平行制備單鏈dna的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模平行制備單鏈dna的方法，其克服了傳統(tǒng)化學(xué)法合成單鏈dna產(chǎn)物純度低、產(chǎn)量低、成本高、平行性差的缺點(diǎn)。技術(shù)方案一方面，本發(fā)明提供了一種適用于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模平行制備單鏈dna的方法，所述方法包括以下步驟：1)合成可重復(fù)生產(chǎn)單鏈dna的模板，其中，合成時(shí)在所述模板的5’端和3’端分別為啟動(dòng)子序列和一段通用接頭序列(universaladaptor)，其中，模板的特征為長(zhǎng)度差別不超過(guò)5個(gè)堿基，優(yōu)選地，模板序列的長(zhǎng)度相同，并且任意兩個(gè)模板序列沒(méi)有穩(wěn)定的互補(bǔ)熱穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)。所述熱穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是指互補(bǔ)區(qū)域在標(biāo)準(zhǔn)普通pcr離子濃度條件下解鏈溫度不超過(guò)47℃，優(yōu)選地，不超過(guò)30℃。2)模板的純化；3)對(duì)步驟2)純化的模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成rna；4)以步驟3)中得到的rna為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈dna，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的通用反轉(zhuǎn)錄引物為步驟1)所述通用接頭序列的互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，所述通用反轉(zhuǎn)錄引物的dttp核酸被dutp核酸取代；5)使用udg酶對(duì)步驟4)中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的單鏈dna末端帶有的通用反轉(zhuǎn)錄引物序列進(jìn)行消化，以對(duì)其純化。具體地，在步驟1)中，通過(guò)晶芯微陣列基片微量合成單鏈dna模板，采用化學(xué)合成的單鏈dna作為制備所述單鏈dna的模板，合成時(shí)在其5’端和3’端分別為啟動(dòng)子序列和通用接頭序列，便于后續(xù)單鏈dna大規(guī)模生產(chǎn)，帶有啟動(dòng)子的pcr產(chǎn)物可以作為模板用于體外轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子序列可為t7、sp6、t3或其他類型的啟動(dòng)子；更優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子序列和所述通用接頭序列可如下：?jiǎn)?dòng)子序列：5’tgcataatacgactcactataggg3’；通用接頭序列：5’gcttcggttcacgcaatg3’。具體地，在步驟2)中，所述純化的方式為對(duì)稱pcr，pcr反應(yīng)所使用的正向引物和反向引物序列分別對(duì)應(yīng)于步驟1)中的啟動(dòng)子序列和通用接頭序列，pcr純化使用的dna聚合酶為熱啟動(dòng)taq酶，pcr純化循環(huán)數(shù)為5-20個(gè)循環(huán)，優(yōu)選地，6-15個(gè)循環(huán)，更優(yōu)選地，8-12個(gè)循環(huán)。具體地，在步驟3)中，使用rna聚合酶，特別是t7rna聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。具體地，在步驟4)中，使用無(wú)rnase活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(特別是無(wú)rnaseh活性的m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。具體地，在步驟4)中，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)一步包括使用的e.colirnaseh孵育以去除與單鏈dna互補(bǔ)的rna的步驟。具體地，在步驟4)中，進(jìn)一步包括加入標(biāo)簽和修飾。更具體地，根據(jù)用途需要，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步人工優(yōu)化，包括為提高dna序列退火溫度或增加序列穩(wěn)定性進(jìn)行的核酸分子替代，如lockednucleicacids(lna)、bridgednucleicacid(bna)；再如為限制dna序列的酶反應(yīng)應(yīng)答，如3’端加inverteddttp等；再如核苷酸分子基團(tuán)水平的修飾，如磷酸化、熒光標(biāo)簽、氨基酸標(biāo)簽、生物素標(biāo)記等。有益效果根據(jù)本發(fā)明的大規(guī)模平行制備單鏈dna的方法，由于在傳統(tǒng)化學(xué)合成單鏈dna的基礎(chǔ)上，利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)的特點(diǎn)，在反應(yīng)過(guò)程中始終以原始底物為模板進(jìn)行反應(yīng)，不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增漂移，克服了傳統(tǒng)化學(xué)法合成單鏈dna產(chǎn)物純度低、產(chǎn)量低、平行性差的缺點(diǎn)，最終獲得高產(chǎn)量平行性好的目標(biāo)單鏈dna。此方法操作簡(jiǎn)單便捷，大大降低了大規(guī)模平行制備單鏈dna的成本，從而可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模平行生產(chǎn)的目的。附圖說(shuō)明圖1為pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后凝膠電泳結(jié)果的照片。圖2為體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成rna產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳結(jié)果的照片。圖3為單鏈dna純化回收產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳結(jié)果的照片。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如“j.薩姆布魯克等編著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社，2002”中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、模板的合成本發(fā)明中的模板委托北京艾吉康泰公司合成，涉及72個(gè)基因雜交探針panel，這些模板的啟動(dòng)子序列和通用接頭序列如下：?jiǎn)?dòng)子序列：5’tgcataatacgactcactataggg3’，通用接頭序列：5’gcttcggttcacgcaatg3’?；蛎Q如下：nras，akt1，alk，atm，braf，brca1，brca2，kit，csf1r，ddr2，egfr，fgfr1，fgfr2，flt3，gna11，gnaq，erbb2，hras，kdr，kras，met，pdgfrb，pdgfra，pik3ca，ptch1，pten，ret，smo，ntrk1，tsc1，chek2，mek1，vegfa，abl1，apc，brip1，cdkn2a，cdh1，ctnnb1，erbb4，ezh2，fbxw7，fgfr3，foxl2，gnas，hnf1a，idh1，idh2，jak2jak3，mlh1，mpl，msh2，msh6，mtor，nf1，nf2，notch1，npm1，palb2，pms2，ptpn11rb1，ros1，smad4，smarcb1，src，stk11，tert，tp53，tsc2，vhl。2、模板的純化本發(fā)明采用對(duì)稱pcr的方法對(duì)模板進(jìn)行純化，pcr反應(yīng)所使用的引物、具體成分以及反應(yīng)程序分別如下：1)引物正向引物：5’tgcataatacgactcactataggg3’；反向引物：5’gcttcggttcacgcaatg3’。2)pcr反應(yīng)成分：3)pcr反應(yīng)程序：4)pcr產(chǎn)物純化回收：使用北京天根通用型dna純化回收試劑盒(貨號(hào)dp214)對(duì)pcr反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收后使用qubit3.0定量，純化回收產(chǎn)物濃度為9.0ng/μl。產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳制備0.8％瓊脂糖凝膠，電泳條件：120v，20min，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后凝膠電泳結(jié)果的照片如圖1所示。3、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成rna本發(fā)明的單鏈dna模板上游添加了t7啟動(dòng)子，所以采用t7rna聚合酶(南京諾唯贊t7高產(chǎn)rna轉(zhuǎn)錄試劑盒，貨號(hào)tr101)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，操作過(guò)程中使用無(wú)核酸酶的試劑及ep管，避免引入rna酶污染，反應(yīng)的具體成分及操作步驟如下：1)t7體外轉(zhuǎn)錄體系成分t7體外轉(zhuǎn)錄體系成分用量(μl)備注純化回收產(chǎn)物8濃度：9.0ng/μl反應(yīng)緩沖液(10×)2atp2gtp2utp2ctp2t7rna聚合酶混合物2不含核酸酶的水0共計(jì)202)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：混勻反應(yīng)混合液并短暫離心(1-2s)收集，37℃孵育2個(gè)小時(shí)。注：為了避免蒸發(fā)對(duì)反應(yīng)體系的影響，使用pcr儀進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于小于0.3kb的短片段rna的合成，為了達(dá)到最大產(chǎn)量，可以延長(zhǎng)37℃孵育時(shí)間至4小時(shí)或者更長(zhǎng)，16小時(shí)的過(guò)夜反應(yīng)不會(huì)影響產(chǎn)物質(zhì)量。3)消化dna模板：向反應(yīng)體系中加入1μldnase，37℃孵育15分鐘消化用于轉(zhuǎn)錄的dna模板。4)rna產(chǎn)物純化及定量：加入160μl不含rna酶的水將反應(yīng)液稀釋到180μl并混勻。加入20μl3m的醋酸鈉(ph5.2)到稀釋后的反應(yīng)體系中并混勻。使用等體積的酚/氯仿(體積比1:1)抽提一次，并使用等體積的氯仿抽提2次。收集上層水相到新的ep管中。加入2倍體積的無(wú)水乙醇并混勻，-20℃孵育至少30分鐘，離心機(jī)冷卻至4℃后使用最大轉(zhuǎn)速離心15分鐘沉淀rna。棄上清并加入500μl預(yù)冷的70％乙醇洗滌rna沉淀。離心棄上清并使用不含rna酶的水或者其它需要的緩沖液溶解rna。使用qubit3.0定量，純化回收產(chǎn)物濃度為3.2μg/μl。產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳制備0.8％瓊脂糖凝膠，電泳條件：120v，20min，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成rna產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳結(jié)果的照片如圖2所示。4、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成單鏈dna使用m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶(無(wú)rnaseh活性，貨號(hào)c28025)進(jìn)行單鏈dna的合成，為了便于通用反轉(zhuǎn)錄引物的消化，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的通用反轉(zhuǎn)錄引物使用dutp合成，這樣在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中形成單鏈dna引物端帶有dutp，便于下一步對(duì)產(chǎn)物的純化。如果生產(chǎn)出的單鏈dna有特殊作用，可在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中加入標(biāo)簽和修飾，便于后續(xù)應(yīng)用，操作過(guò)程中使用無(wú)核酸酶的試劑及ep管，避免引入rna酶污染，反應(yīng)的具體成分及操作步驟如下：1)將以下組分加入無(wú)核酸酶的微量離心管中：2pmoldutp替代合成的通用反轉(zhuǎn)錄引物中的dttp(引物序列：5’cauugcgugaaccgaagc3’)；500ng體外轉(zhuǎn)錄rna純化產(chǎn)物；1μl10mmdntp混合物(datp、dgtp、dctp和dttp均為10mm，ph中性)；加入不含核酸酶的水至12μl。2)混合物在65℃加熱5分鐘后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分：4μl5×第一鏈合成緩沖液；2μl0.1mdtt；1μlrnaseouttm核酸酶抑制劑(40單位/μl)。3)在離心管中輕輕將各種成分混合，并在37℃下孵育2分鐘。4)在室溫下加入1μl(200單位)m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕地吹打混勻。5)在37℃孵育50分鐘。6)在70℃加熱15分鐘以終止反應(yīng)。5、單鏈dna純化1)通用反轉(zhuǎn)錄引物的消化：udg酶能很好的工作于常用的各種pcr反應(yīng)體系，因此在反應(yīng)液中加入udg酶即可，無(wú)需另加udg緩沖液，但因各反應(yīng)體系不同，udg酶的加入量需依據(jù)反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整，本發(fā)明直接在上步反應(yīng)液中加入1μl活性為1u/μl的udg酶(同科生物，貨號(hào)tk01033)，50℃孵育30min消化，95℃孵育5min使攜帶dutp的dna鏈在dutp堿基處降解，降解反應(yīng)完成后滅活udg酶。2)單鏈dna的提取純化：使用苯酚氯仿法從反應(yīng)體系中提取純化單鏈dna，具體操作步驟可參考本發(fā)明中以上體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成rna步驟中的rna產(chǎn)物純化步驟。3)單鏈dna的質(zhì)檢定量：使用qubit3.0定量，純化回收產(chǎn)物濃度為113ng/μl，產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳，制備0.8％瓊脂糖凝膠，電泳條件：120v，20min，純化回收產(chǎn)物稀釋后凝膠電泳結(jié)果的照片如圖3所示。sequencelisting<110>大連晶泰生物技術(shù)有限公司<120>一種大規(guī)模制備單鏈dna的方法<130>di17-0734-xc86<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>啟動(dòng)子<400>1tgcataatacgactcactataggg24<210>2<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>通用接頭<400>2gcttcggttcacgcaatg18<210>3<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>通用反轉(zhuǎn)錄引物<400>3cauugcgugaaccgaagc18當(dāng)前第1頁(yè)12