本發(fā)明屬于分子生物學(xué)中的核酸提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速廣譜的基因組dna提取試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

所有現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)首先面臨的問題就是如何從復(fù)雜多樣的生物樣本中迅速有效地分離和提純所需的基因組dna，dna質(zhì)量及其完整性將會(huì)直接影響到下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。傳統(tǒng)的核酸提取技術(shù)需要用到大量的生物樣本，且包含多步的裂解、沉淀和離心等操作，步驟較為繁雜，費(fèi)時(shí)長，收率低，很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，因此，長期以來基因組dna的提取和純化是項(xiàng)耗時(shí)費(fèi)力的工作，占據(jù)了整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的不可忽略的時(shí)間比例。目前，許多生物技術(shù)公司在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上研發(fā)出了各自的試劑盒，用于從不同的樣本中分離和提取基因組dna。但是，這些試劑盒提取基因組dna大多仍具有耗時(shí)長，操作繁的缺點(diǎn)，此外，這些試劑盒產(chǎn)品通常特異性很強(qiáng)，通常只能處理特定種類的樣品，缺乏通用性，這很大程度上提高是實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)營成本，降低了研究人員工作的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對目前市場上基因組dna提取試劑盒大多只能處理特定種類生物樣品的局限性，本發(fā)明的目的是提供一種快速廣譜的基因組dna提取試劑，廣泛適用于多種常見生物材料基因組dna的提取，提取速度快，dna提取質(zhì)量高，且同時(shí)適用于少量提取和大量提取。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述快速廣譜的基因組dna提取試劑的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種快速廣譜的基因組dna提取試劑：1l的試劑中含有以下成分：乙酸鈉0.08-0.12m，檸檬酸鈉0.02-0.03m，苯酚350-500ml，1％-1.5％sds6-8m鹽酸胍補(bǔ)足到1l。

所述的dna提取試劑在dna提取中的應(yīng)用。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行細(xì)菌基因組dna提取的方法，步驟如下：

1)取1-4ml過夜培養(yǎng)的菌液于離心管內(nèi)，12000rpm離心5s，棄上清；

2)加入10ug/ml的溶菌酶100μl-200μl和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)加入dna提取試劑1ml，輕輕的上下顛倒晃動(dòng)10下；

4)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

5)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

6)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

7)12000rpm離心5min，棄上清；

8)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

9)打開蓋子風(fēng)干；

10)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行血液dna提取的方法，步驟如下：

1)取50-200μl全血，加入1μl的rnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行土壤總dna提取的方法，步驟如下：

1)0.1-1g土壤研磨后移至于2ml離心管中，加入500μl的te緩沖液混勻；

2)加入10ug/ml的溶菌酶100μl和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)12000rpm離心1min，取全部上清到新的離心管；

4)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

5)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

6)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

7)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

8)12000rpm離心5min，棄上清；

9)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

10)打開蓋子風(fēng)干；

11)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行真菌菌絲dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量菌絲，液氮研磨后重懸于200μlte緩沖液中，加入1μlrnase反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行肌肉組織dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量組織液氮研磨或用勻漿器破碎組織，加入1μlrnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行植物根部及葉片基因組dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量根部組織液氮研磨，用200μlte緩沖液重懸研磨粉末，加入1μlrnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

應(yīng)用所述的dna提取試劑進(jìn)行基因組dna提取的方法，步驟如下：

1)取4ml過夜培養(yǎng)的菌液于離心管內(nèi)，12000rpm離心5s，棄上清；

2)加入10ug/ml的溶菌酶200μl和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)10下；

4)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

5)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

6)往剩余的溶液中加入600μl的te緩沖液，上下顛倒混勻；

7)12000rpm離心5min，移取上清至步驟5的離心管中；

8)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

9)12000rpm離心5min，棄上清；

10)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清，重復(fù)一次；

11)打開蓋子風(fēng)干；

12)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)勢包括：本試劑可在15-30min完成基因組dna提取，能夠進(jìn)行dna微量和大量的提取。與現(xiàn)在流行基因組dna提取方法相比，本發(fā)明所述方法和試劑簡化了基因組dna提取步驟，降低了提取工作的物質(zhì)和時(shí)間成本，拓寬了單一試劑的適用范圍，并進(jìn)一步提高產(chǎn)物得率。本方法及試劑適用范圍廣，如適用于血液、肌肉組織、細(xì)菌、真菌和土壤等。試劑的配置和操作更加簡單，且穩(wěn)定性高，適合微量和大量樣品的快速提取，且提取方法簡單，所需時(shí)間短，大大提高了基因組dna的提取效率。

附圖說明

圖1是血液(魚血)、懸浮細(xì)胞(魚血細(xì)胞)、肌肉組織(雞肉)基因組dna提取結(jié)果圖(0.8％瓊脂糖凝膠電泳，下同)；圖中，m:marker，1:血液，2：懸浮細(xì)胞，3：肌肉組織；各dna樣品均上樣1μl；

圖2是植物(綠蘿)根部、葉片基因組dna提取結(jié)果圖；圖中，m:marker，1:根，2：葉片；各dna樣品均上樣4μl；

圖3是土壤dna提取結(jié)果圖，圖中，m：marker，1：潮濕泥土，2：干砂；各dna樣品均上樣2μl；

圖4是真菌(大豆疫霉)、芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌fzb42)、大腸桿菌(dh5a)基因組dna提取結(jié)果圖，圖中，m：marker1:真菌菌絲，2：芽孢桿菌，3：大腸桿菌；各dna樣品均上樣1μl；

圖5是細(xì)菌基因組(解淀粉芽孢桿菌fzb42)的大量提取結(jié)果圖，圖中，m：marker，1：1ml菌液，2:2ml菌液，3:3ml菌液，4；4ml菌液，5：1ml菌液有機(jī)相再處理，6：2ml菌液有機(jī)相再處理，7：3ml菌液有機(jī)相再處理，8：4ml菌液有機(jī)相再處理；各dna樣品均上樣1μl；

圖6是18s擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，1:血液，2：肌肉組織，3：根部，4：陰性對照；各dna樣品均上樣1μl；

圖7是16s擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，1:fzb42，2：大腸桿菌，3：土壤1,4：土壤2；各dna樣品均上樣1μl；

圖8是its1，its4擴(kuò)增結(jié)果圖，圖中，1：根，2：葉片，3：真菌(疫霉)；各dna樣品均上樣1μl；

圖9是18s擴(kuò)增2結(jié)果圖，圖中，1:根，2：葉，3：真菌(疫霉)。各dna樣品均上樣1μl。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

dna提取試劑的配方：乙酸鈉0.08-0.12m，檸檬酸鈉0.02-0.03m，苯酚350-500ml，1％-1.5％sds6-8m鹽酸胍補(bǔ)足到1l。優(yōu)選使用的配方為：2m乙酸鈉50ml，1m檸檬酸鈉25ml，苯酚400ml，25％sds50ml，8m鹽酸胍補(bǔ)足到1l(無需調(diào)ph)，以下實(shí)施例均使用該優(yōu)選配方進(jìn)行。

實(shí)施例2

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行細(xì)菌基因組dna提取的方法，步驟如下：

1)取1-4ml過夜培養(yǎng)的菌液于2ml離心管內(nèi)(可多次加入菌液)，12000rpm離心5s，棄上清；

2)加入10ug/ml的溶菌酶100μl-200μl(100ul最多裂解2ml過夜培養(yǎng)的菌液。)和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)10下；

4)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

5)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

6)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

7)12000rpm離心5min，棄上清；

8)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

9)打開蓋子風(fēng)干；

10)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例2

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行血液dna提取的方法，步驟如下：

1)取50-200μl全血，1μl的rnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例3

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行土壤總dna提取的方法，步驟如下：

1)0.1-1g土壤徹底研磨后移至于2ml離心管中，加入500μl的te緩沖液混勻；

2)加入10ug/ml的溶菌酶100μl和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)12000rpm離心1min，取全部上清到新的離心管；

4)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

5)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

6)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

7)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

8)12000rpm離心5min，棄上清；

9)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

10)打開蓋子風(fēng)干；

11)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例5

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行真菌菌絲dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量菌絲，液氮研磨后重懸于200μlte緩沖液中，加入1μlrnase反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例6

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行肌肉組織dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量組織液氮研磨或用勻漿器破碎組織，加入1μlrnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例7

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行植物根部及葉片基因組dna提取的方法，步驟如下：

1)取適量根部組織液氮研磨，用200μlte緩沖液重懸研磨粉末，加入1μlrnase，37℃反應(yīng)10min；

2)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)待其形成均勻的溶液；

3)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

4)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

5)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

6)12000rpm離心5min，棄上清；

7)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清；重復(fù)一次；

8)打開蓋子風(fēng)干；

9)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例8

采用實(shí)施例1的dna提取試劑進(jìn)行基因組dna的大量提取(以細(xì)菌為例)的方法，步驟如下：

1)取4ml過夜培養(yǎng)的菌液于2ml離心管內(nèi)(分兩次加入菌液)，12000rpm離心5s，棄上清；

2)加入10ug/ml的溶菌酶200μl和1μl的rnase，37℃裂解10min；

3)加入dna提取試劑1ml，輕輕上下顛倒晃動(dòng)10下；

4)加入500μl氯仿，輕輕晃動(dòng)，待其成為乳白色的液體；

5)12000rpm離心5min，移取上清至新的離心管中；

6)有機(jī)相再處理，往剩余的下層有機(jī)相溶液中加入600μl的te緩沖液，上下顛倒混勻；

7)12000rpm離心5min，移取上清至步驟5的離心管中；

8)加入0.6倍體積的異丙醇，上下顛倒晃動(dòng)，待其混勻；

9)12000rpm離心5min，棄上清；

10)加入70％乙醇后搖勻，12000rpm離心1min后棄上清，重復(fù)一次；

11)打開蓋子風(fēng)干；

12)加入適量te緩沖液，待其溶解后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

實(shí)施例9提取的基因組dna質(zhì)量驗(yàn)證

以上述實(shí)施例2-8的方法提取得到的dna為模板，按照標(biāo)準(zhǔn)的pcr方法進(jìn)行16s、18srdna和its的擴(kuò)增，以檢測所提基因組dna的質(zhì)量。

1、pcr體系：

10mm上游引物1ul，10mm下游引物1ul，2.5mmdntp2.5ul，10×pcrbuffer2.5ul模板10-50ng，taq酶1u，補(bǔ)足雙蒸水至25ul

pcr擴(kuò)增程序：94℃變性5min，(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s)30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

2、擴(kuò)增所用引物如下：

1)細(xì)菌16srdna擴(kuò)增引物：

引物1：5’-tacggttaccttgttacgactt-3’；

引物2：5’-agagtttgatcatggctcag-3’。

2)血液及肌肉組織18srdnapcr擴(kuò)增引物：

引物1：5’-acgggtaacggggaa-3’；

引物2：5’-gcggtgtgtacaaagg-3’。

3)根部、葉片、真菌及土壤樣品18srdnapcr擴(kuò)增引物：

引物1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；

引物2：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。

4)its1和its4引物

its1：tccgtaggtgaacctgcgg

its4：tcctccgcttattgatatgc

3、結(jié)果

1)圖1是血液(魚血)、懸浮細(xì)胞(魚血細(xì)胞)、肌肉組織(雞肉)基因組dna提取，圖中，m:marker，1:血液，2：懸浮細(xì)胞，3：肌肉組織。電泳結(jié)果表明，血液、懸浮細(xì)胞和肌肉組織中所提取的基因組dna結(jié)構(gòu)完整，條帶單一，無rna污染。其中全血所提取的基因組dna濃度較高，懸浮細(xì)胞和肌肉組織次之。

2)圖2是植物(綠蘿)根部、葉片基因組dna提取，圖中，m:marker，1:根，2：葉片。電泳結(jié)果表明，根部、葉片中所提取的基因組dna結(jié)構(gòu)完整，條帶單一，無rna污染。

3)圖3是土壤dna提取，圖中m：marker，1：潮濕泥土，2：干砂。電泳結(jié)果表明，從兩種土壤中所提取的基因組dna結(jié)構(gòu)完整，條帶單一，無rna污染，有一定的拖帶，說明樣品中可能有少許雜質(zhì)。

4)圖4是真菌(大豆疫霉)、芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌fzb42)、大腸桿菌(dh5a)基因組dna提取，圖中，m：marker1:真菌菌絲，2：芽孢桿菌，3：大腸桿菌。電泳結(jié)果表明，從真菌、革蘭陽性菌(芽孢桿菌)和革蘭陰性菌(大腸桿菌)中提取的基因組dna結(jié)構(gòu)完整，條帶單一，無rna污染。

5)圖5是細(xì)菌基因組(解淀粉芽孢桿菌fzb42)的大量提取(見實(shí)施例8)，圖中，m：marker，1：1ml菌液，2:2ml菌液，3:3ml菌液，4；4ml菌液，5：1ml菌液有機(jī)相再處理，6：2ml菌液有機(jī)相再處理，7：3ml菌液有機(jī)相再處理，8：4ml菌液有機(jī)相再處理。

圖5是細(xì)菌基因組大量提取，1-4泳道中的基因組dna濃度逐漸增大，說明隨著加入菌液量的增加，dna提取量也會(huì)增加。5泳道幾乎無條帶，6-8泳道中的基因組dna濃度也逐漸增大，說明加入過量樣品后有機(jī)相再處理也能收集到更多的基因組dna。

6)以提取的dna為模板pcr擴(kuò)增效果，圖6是18s擴(kuò)增，圖中，1:血液，2：肌肉組織，3：根部，4：陰性對照。圖6說明提取的血液、肌肉組織、根部基因組dna樣品能夠用于pcr反應(yīng)，且pcr后瓊脂糖電泳條帶清晰單一。

圖7是16s擴(kuò)增，圖中，1:fzb42，2：大腸桿菌，3：土壤1,4：土壤2。圖7說明提取的芽孢桿菌、大腸桿菌和兩種土壤樣品基因組dna樣品能夠用于pcr反應(yīng)，且pcr后瓊脂糖電泳條帶清晰單一。

圖8是its1，its4擴(kuò)增，圖中，1：根，2：葉片，3：真菌(疫霉)。圖8說明提取的根、葉片和疫霉基因組dna樣品能夠用于pcr反應(yīng)和its鑒定，且pcr后瓊脂糖電泳條帶清晰單一。

圖9是18s擴(kuò)增2，圖中，1:根，2：葉，3：真菌(疫霉)。圖9說明提取的根、葉片和疫霉基因組dna樣品能夠用作pcr反應(yīng)和18s鑒定且pcr后瓊脂糖電泳條帶清晰單一。