本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒，及其檢測方法。

背景技術(shù)：

編碼葡糖腦苷脂酶的基因(glucocerebmsidas，以下簡述gba)突變會(huì)造成葡糖腦苷脂酶的缺乏，從而引起葡糖腦苷脂在肝、脾、骨骼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)蓄積而發(fā)病，產(chǎn)生肝脾腫大、骨骼畸形、生長發(fā)育落后、貧血等臨床表現(xiàn)。

鑒于目前檢測gba的主要技術(shù)存在低通量、操作復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)，本發(fā)明旨在提供一種高通量、操作簡便、快速的檢測試劑盒，以實(shí)現(xiàn)對(duì)gba的基因篩查。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種高準(zhǔn)確性、低成本、高通量、快速的檢測試劑盒，可用于檢測葡糖腦苷脂酶基因是否存在突變。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于特異性擴(kuò)增葡萄糖腦苷脂酶基因上4個(gè)突變位點(diǎn)的引物對(duì)，4個(gè)突變位點(diǎn)分別為n188s、f213i、d409h和l444p，所述引物對(duì)包括公共上游引物和分型下游引物，所述分型下游引物包括野生型特異引物和突變型特異引物，對(duì)應(yīng)4個(gè)突變位點(diǎn)的公共上游引物、野生型特異引物和突變型特異引物如下表所示：

表1、各個(gè)突變位點(diǎn)的引物序列

f代表公共上游引物，w代表野生型特異引物，m代表突變型特異引物。

優(yōu)選地，每個(gè)公共上游引物的5'端標(biāo)記有熒光基團(tuán)。所述熒光基團(tuán)是fam、hex、vic、tamra、ned、rox中的一種或多種。

本發(fā)明所述葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒還包括基因序列對(duì)照模板，所述基因序列對(duì)照模板包括正常序列模板和突變序列模板。所述基因序列對(duì)照模板是由兩段人工合成的核苷酸序列。所述gba基因的正常序列模板是根據(jù)ncbi上公布的gba基因序列外顯子6、9與10的部分序列人工合成的一段核苷酸序列。所述gba基因的突變序列模板是根據(jù)上述正常序列修改突4個(gè)變位點(diǎn)堿基(c.680a>g，c.754t>a，c.1342g>c，c.1448t>c)后人工合成的核苷酸序列。

所述正常序列模板：

cctttgtctctagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagtaagggatcagcaaggatgtgggatcaggactggcctcccatttagccatgctgatctgtgtcccaaccctcaacctagttccacttccagatctgcctgtcctcagctcacctttctacctggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcaggtgagtggagggcgggcacccccattccataccaggcctatcatctcctacatcggagctccaggcctagagagccagggcagagcctctgcaggagttatggggtgggtccgtgggtgggtgacttcttagatgagggtttcatgggaggtaccccgagggactctgaccatctgttcccacattcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccggtgagggcaatggtgaggtctgggaagtgggctgaagacagcgttgggggccttgg

(seqidno.13)

所述突變序列模板：

cctttgtctctagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccagtggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatacattgtgaagtaagggatcagcaaggatgtgggatcaggactggcctcccatttagccatgctgatctgtgtcccaaccctcaacctagttccacttccagatctgcctgtcctcagctcacctttctacctggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaagcacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcaggtgagtggagggcgggcacccccattccataccaggcctatcatctcctacatcggagctccaggcctagagagccagggcagagcctctgcaggagttatggggtgggtccgtgggtgggtgacttcttagatgagggtttcatgggaggtaccccgagggactctgaccatctgttcccacattcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacccggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccggtgagggcaatggtgaggtctgggaagtgggctgaagacagcgttgggggccttgg

(seqidno.14)。

進(jìn)一步，所述的葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒還包括pcr緩沖液、熱啟動(dòng)c-taq酶、超純水、熒光分子量內(nèi)標(biāo)和等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。

本發(fā)明還提供了使用上述葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒的使用方法，包括對(duì)樣品中葡萄糖腦苷脂酶基因的4個(gè)突變位點(diǎn)的擴(kuò)增采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測采用高效液相色譜、多重?zé)晒饷?xì)管電泳或聚丙烯酰氨凝膠電泳。

其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃2分鐘；94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共10個(gè)循環(huán)；94℃30秒、59℃30秒、72℃30秒，共18個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提高了檢測的模板量，大大降低假陽性；

(2)使用毛細(xì)管電泳對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，一次電泳最多可以檢測96個(gè)樣本的基因分型，具有高效節(jié)約的特點(diǎn)；

(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)僅需要1小時(shí)，毛細(xì)管電泳檢測也可在1小時(shí)內(nèi)完成，整個(gè)檢測過程在3小時(shí)內(nèi)完成，檢測所需時(shí)間大大減少；

(4)可以省去dna抽提步驟，唾液卡、fta卡和血濾紙可以直接擴(kuò)增，減少了操作步驟，簡化了其操作流程；

(5)本發(fā)明能夠準(zhǔn)確判斷正常及突變樣本的基因分型，精確度高。

附圖說明

圖1是所述試劑盒中正常序列模板對(duì)照野生型特異引物的3個(gè)位點(diǎn)檢測圖譜；

圖2是試劑盒中突變序列模板對(duì)照突變型特異引物的3個(gè)位點(diǎn)檢測圖譜；

圖3是實(shí)施例1的檢測圖譜；

圖4是實(shí)施例2的檢測圖譜；

圖5是實(shí)施例3的檢測圖譜；

圖6是實(shí)施例4的檢測圖譜；

圖7是實(shí)施例5的檢測圖譜；

圖8是實(shí)施例6的檢測圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于特異性擴(kuò)增葡萄糖腦苷脂酶基因上4個(gè)突變位點(diǎn)的引物對(duì)，4個(gè)突變位點(diǎn)分別為n188s、f213i、d409h和l444p，所述引物對(duì)包括公共上游引物和分型下游引物，所述分型下游引物包括野生型特異引物和突變型特異引物，其中上游引物為共用引物，包括熒光基團(tuán)標(biāo)記和靶序列特異結(jié)合區(qū)；下游引物包括分型識(shí)別位點(diǎn)和長度調(diào)節(jié)區(qū)，所述熒光基團(tuán)是fam、hex、vic、tamra、ned、rox中的一種或多種。還包括對(duì)照基因序列、pcr緩沖液、熱啟動(dòng)c-taq酶、超純水、熒光分子量內(nèi)標(biāo)和等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，所述基因序列對(duì)照模板包括正常序列模板和突變序列模板。

具體為如下表所示：

表2、試劑盒的組成

本發(fā)明試劑盒的具體使用方法：

1、樣本dna的提取

根據(jù)樣本的實(shí)際情況，選擇合適的方法提取樣本dna，常見的方法有：磁珠法、陰離子交換樹脂法和堿裂解法等等。若樣本是血濾紙、fta卡、唾液卡等，可簡化步驟，直接擴(kuò)增。

2、pcr反應(yīng)

pcr反應(yīng)的擴(kuò)增體系如下：

pcr反應(yīng)的擴(kuò)增程序如下：

3、遺傳分析儀熒光電泳檢測

12μl去離子甲酰胺與0.5μl分子量內(nèi)標(biāo)(agcumarkersiz-500)混合。再加入1μlpcr反應(yīng)產(chǎn)物，渦旋混勻3500r/min離心2min，95℃變性3min，冰浴3min,用遺傳分析儀abi3130xl進(jìn)行檢測分析。

標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立：

按上述使用方法對(duì)照基因序列進(jìn)行檢測，獲得如圖1所示的正常序列模板對(duì)照野生型特異引物的4個(gè)位點(diǎn)檢測圖譜，以及如圖2所示的突變序列模板對(duì)照突變型特異引物的4個(gè)位點(diǎn)檢測圖譜。

實(shí)施例1：一號(hào)樣品檢測

按上述使用方法對(duì)一號(hào)樣品進(jìn)行檢測，獲得如圖3所示的圖譜，可知一號(hào)樣品為n188s位點(diǎn)單位點(diǎn)突變。

實(shí)施例2：二號(hào)樣品檢測

其整體流程與實(shí)施例1相同，二號(hào)樣品的檢測結(jié)果如圖4所示，可知二號(hào)樣品為f213i位點(diǎn)單位點(diǎn)突變。

實(shí)施例3：三號(hào)樣品檢測

其整體流程與實(shí)施例1相同，三號(hào)樣品的檢測結(jié)果如圖5所示，可知三號(hào)樣品為d409h位點(diǎn)單位點(diǎn)突變。

實(shí)施例4：四號(hào)樣品檢測

其整體流程與實(shí)施例1相同，四號(hào)樣品的檢測結(jié)果如圖6所示，可知四號(hào)樣品為l444p位點(diǎn)單位點(diǎn)突變

實(shí)施例5：五號(hào)樣品檢測

其整體流程與實(shí)施例1相同，五號(hào)樣品的檢測結(jié)果如圖7所示，可知五號(hào)樣品為n188s和f213i位點(diǎn)雙位點(diǎn)突變。

實(shí)施例6：六號(hào)樣品檢測

其整體流程與實(shí)施例1相同，六號(hào)樣品的檢測結(jié)果如圖8所示，可知六號(hào)樣品為d409h和l444p位點(diǎn)雙位點(diǎn)突變。

sequencelisting

<110>廣東華美眾源生物科技有限公司

<120>葡萄糖腦苷脂酶基因檢測試劑盒及其檢測方法

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