本發(fā)明屬于pcr檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于擴(kuò)增矯正的數(shù)字pcr檢測方法。
背景技術(shù)：
：數(shù)字pcr即digitalpcr(dpcr)，它是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，數(shù)字pcr技術(shù)是一種新型分子診斷技術(shù)，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、絕對定量等特點(diǎn)。芯片法數(shù)字pcr和普通pcr相比，特殊性在于數(shù)字pcr的反應(yīng)體系被分配到芯片上的微孔內(nèi)，理論上每個(gè)微孔中只含一個(gè)dna模板片段，并在擴(kuò)增結(jié)束后才對每個(gè)微孔進(jìn)行熒光信號檢測?；谠撎厥庑?，當(dāng)數(shù)字pcr的擴(kuò)增效率較低時(shí)，某些微孔內(nèi)的模板在初期循環(huán)中延伸失敗，使得模板實(shí)際循環(huán)數(shù)少于理論循環(huán)數(shù)，導(dǎo)致最終的熒光信號成指數(shù)型降低，在芯片上體現(xiàn)出最終結(jié)果的偏差。該偏差降低了基于數(shù)字pcr技術(shù)的高精密度診斷試劑盒的檢測靈敏度，甚至?xí)霈F(xiàn)漏檢或假陰性結(jié)果。本專利通過在pcr反應(yīng)體系中加入人工合成的矯正質(zhì)粒來校正這種結(jié)果偏差，對于推廣數(shù)字pcr技術(shù)、提高臨床診斷準(zhǔn)確率有著深遠(yuǎn)的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：如上所述，為了克服因不同基因和引物之間擴(kuò)增效率不同帶來的數(shù)字pcr結(jié)果偏差，本發(fā)明提供了一種基于擴(kuò)增矯正的數(shù)字pcr檢測方法，可以減少或消除兩個(gè)基因之間擴(kuò)增效率不同帶來的結(jié)果偏差，也可以增加檢測方法對不同提取和樣本處理?xiàng)l件的耐受能力，使結(jié)果更加可靠。為達(dá)到上述目標(biāo)提供了一種基于擴(kuò)增矯正的數(shù)字pcr檢測方法，所述方法通過如下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)提取待檢測者的全血基因組作為血樣本模板，然后確定血樣本模板的一個(gè)單拷貝基因作為待測基因，再確定血樣本模板的另一個(gè)單拷貝基因作為參比基因，制備兩個(gè)相同且等量的第一血樣本模板和第二血樣本模板；(2)設(shè)計(jì)合成包含待測基因和參比基因的序列作為載體模板，載體模板可以是帶有待測基因和參比基因的質(zhì)?；蛘遜na片段，且質(zhì)?；蛘遜na片段上的待測基因數(shù)量等于參比基因的數(shù)量，制備兩個(gè)相同且等量的第一載體模板和第二載體模板；(3)配置含有第一血樣本模板的第一數(shù)字pcr反應(yīng)混合液分散至第一芯片的微反應(yīng)孔中，第一數(shù)字pcr反應(yīng)混合液包括2×mix、待測基因引物、第一血樣本模板及對應(yīng)的探針、水、第一載體模板及對應(yīng)的探針；(4)配置含有第二血樣本模板的第二數(shù)字pcr反應(yīng)混合液分散至第二芯片的微反應(yīng)孔中作為內(nèi)參，第二數(shù)字pcr反應(yīng)混合液包括2×mix、參比基因引物、第二血樣本模板及對應(yīng)的探針、水、第二載體模板及對應(yīng)的探針；(5)將第一芯片和第二芯片放在同一反應(yīng)條件中進(jìn)行pcr擴(kuò)增并通過熒光信號讀取值，第一芯片中得到待測基因的第一血樣本模板拷貝數(shù)濃度c1和第一載體模板拷貝數(shù)濃度c2，第二芯片中得到參比基因的第二血樣本模板拷貝數(shù)濃度c3和第二載體模板拷貝數(shù)濃度c4；(6)利用第一芯片中待測基因的第一血樣本模板拷貝數(shù)濃度c1和第二芯片中參比基因的第二血樣本模板拷貝數(shù)濃度c3的比值約等于第一芯片中第一載體模板拷貝數(shù)濃度c2和第二芯片中第二載體模板拷貝數(shù)濃度c4的比值，即約等于1的原理，得出c1矯正后的值為c3×c2÷c4。本發(fā)明所述方法的原理：首先在特定疾病的待測基因(單拷貝基因)以外，在與待測基因同血樣模板中確定并引入另一個(gè)單拷貝基因作為參比基因，在理想情況下，待測基因和參比基因的兩種熒光信號的拷貝數(shù)比值應(yīng)為1:1，然而實(shí)際擴(kuò)增中，引物、探針等因素引起的基因間擴(kuò)增效率的不同引起芯片微孔內(nèi)的拷貝數(shù)不一致，進(jìn)而導(dǎo)致了上述拷貝數(shù)比值偏離了1:1，本發(fā)明構(gòu)建了與疾病待測基因和參比基因序列均高度相似的載體作為內(nèi)參，所述載體是均包含了待測基因和參比基因的序列，載體可以是帶有待測基因和參比基因的質(zhì)?；蛘遜na片段，且質(zhì)?；蛘遜na片段上的待測基因數(shù)量等于參比基因的數(shù)量，如上所述，待測基因和參比基因中載體的拷貝數(shù)的比值理論值為1:1，實(shí)際擴(kuò)增出現(xiàn)了偏離，通過多次實(shí)驗(yàn)，確定了不同操作條件下待測基因中的血樣模板的拷貝數(shù)和參比基因中的血樣模板拷貝數(shù)的比值約等于待測基因中載體的拷貝數(shù)和參比基因中載體的拷貝數(shù)的比值，因此可以通過分別求得待測基因和參比基因的各模板的拷貝數(shù)比值來消除這個(gè)偏離。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1.可以減少或消除兩個(gè)基因之間擴(kuò)增效率不同帶來的結(jié)果偏差；2.可以增加檢測方法對不同提取和樣本處理?xiàng)l件的耐受能力，使結(jié)果更加可靠。附圖說明圖1是實(shí)施例1的1號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖2是實(shí)施例1的2號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖3是實(shí)施例1的3號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖4是實(shí)施例2的1號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖5是實(shí)施例2的2號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖6是實(shí)施例2的3號芯片的數(shù)字pcr結(jié)果的散點(diǎn)圖，圖中，橫縱兩條輔助線將附圖分為左上區(qū)、左下區(qū)、右上區(qū)和右下區(qū)共四個(gè)區(qū)，左上區(qū)中的圓點(diǎn)是fam熒光信號，右下區(qū)中的圓點(diǎn)是vic熒光信號，右上區(qū)中的圓點(diǎn)是fam+vic熒光信號，左下區(qū)中的圓點(diǎn)是rox熒光信號。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1人乳腺癌基因擴(kuò)增矯正一、正常人全血基因組提取(參考貨號為dp348的天根生化科技(北京)有限公司血液基因組dna提取試劑盒)(一)處理血液樣品(本產(chǎn)品適用于處理100μl-1ml血液樣品)：1.提取200μl血液樣品時(shí)，可直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。2.提取小于200μl血液樣品時(shí)，可加緩沖液gs補(bǔ)足體積至200μl，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.提取大于200μl血液樣品時(shí)，需細(xì)胞裂解液cl處理，具體步驟如下：在樣品中加入1-2.5倍血液樣品體積的細(xì)胞裂解液cl，顛倒混勻，10,000rpm(～11,500×g)離心1min，吸去上清，留下細(xì)胞核沉淀(如果裂解不徹底，可加入1-2.5倍血液樣品體積的細(xì)胞裂解液cl重復(fù)裂解一次)，向細(xì)胞核沉淀中加200μl緩沖液gs，振蕩至徹底混勻，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4.當(dāng)處理血樣為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的抗凝血液，紅細(xì)胞有核細(xì)胞，因此處理量為5-20μl，加緩沖液gs補(bǔ)足200μl，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。5.當(dāng)處理血樣為血凝塊，可選擇液化柱cx1(tiangen，rk165)(需自備)對血凝塊進(jìn)行液化處理，具體步驟如下：(1).取血凝塊至液化柱cx1中，12,000rpm(～11,500×g)離心1min，收集濾液(若血凝塊量大可分批多次過柱離心，收集濾液)。(2).取100μl-1ml濾液加入1-2.5倍血液樣品體積的細(xì)胞裂解液cl，顛倒混勻，10,000rpm(～11,500×g)離心1min，吸去上清，留下細(xì)胞核沉淀(如果裂解不徹底，可加入1-2.5倍血液樣品體積的細(xì)胞裂解液cl重復(fù)裂解一次)，向收集到的細(xì)胞核沉淀中加200μl緩沖液gs，振蕩至徹底混勻，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。6.加入200μl緩沖液gb和20μlproteinasek的預(yù)混溶液至上述處理獲得的200μl樣品中，充分顛倒混勻，56℃放置10min，其間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮(如溶液未徹底變清亮，請延長裂解時(shí)間至溶液清亮為止)。7.室溫放置2-5min后加入350μl緩沖液bd，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。8.將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱cg2中(吸附柱cg2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cg2放入收集管中。9.向吸附柱cg2中加入500μl緩沖液gdb，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cg2放入收集管中。10.向吸附柱cg2中加入600μl漂洗液pwb(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cg2放入收集管中。11.重復(fù)操作步驟6。12.12,000rpm(～13,400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cg2置于室溫放置2min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。13.將吸附柱cg2轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液tb，室溫放置2min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。(二)引物及矯正質(zhì)粒溶液配置1.引物及質(zhì)粒12000rpm離心60s；2.慢慢打開管蓋，加入適量的緩沖溶液或水，使引物終濃度為10mm；質(zhì)粒終濃度為500copies/ul，血樣模板濃度2ng/ul；3.蓋上蓋子后充分震蕩混勻；4.放入-20℃保存待用。(三)數(shù)字pcr檢測1.試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法如下表：2.三塊芯片數(shù)字pcr反應(yīng)混合液的配比如下表：1號芯片2號芯片3號芯片組分體積(ul)體積(ul)體積(ul)2×mix7.57.57.5her2–f101her2-r101rps27a–f011rps27a–r011her2-fam-probe0.500.5her2’-hex-probe0.500rps27a-vic-probe00.50.5rps27a’-fam-probe00.50血樣模板111矯正質(zhì)粒110水2.52.51.53.(1)pcr反應(yīng)液的配制，步驟如下：①將配制pcr反應(yīng)液所需的試劑從冰箱取出，置于冰上解凍，待各試劑完全解凍后方可使用。②解凍后將試劑放在渦旋儀上震蕩15s以上，或輕輕顛倒反復(fù)10次，使其充分混勻。③反應(yīng)液按表2中配比配制：④反應(yīng)液配制后在渦旋儀上震蕩15s以上，充分混勻(2)進(jìn)樣①打開進(jìn)樣器(iloader)，同時(shí)將所需耗材：樣本加載葉片(blade)、芯片(20kchip)、芯片蓋(chiplid)準(zhǔn)備好，并分別放置在進(jìn)樣器的相應(yīng)位置上，確認(rèn)擺放牢固、方向正確。②待進(jìn)樣器左上角指示燈變藍(lán)，先對反應(yīng)液進(jìn)行簡短的離心，將管蓋、管壁上附著的液體甩下，再用移液器取樣14.5μl，取樣時(shí)需將混勻的反應(yīng)液再次反復(fù)吹吸。③壓下進(jìn)樣按鈕開始進(jìn)樣，仔細(xì)觀察加載葉片與芯片的相對位置，以免進(jìn)樣不完美(加載葉片起終始位置、左右服帖度等)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。④進(jìn)樣結(jié)束后，即加載葉片離開芯片表面，回復(fù)到初始位置時(shí)，立馬將準(zhǔn)備好的油相浸液(immersionfluid)注射到芯片上，使之完全覆蓋芯片表面，以防反應(yīng)液受熱蒸發(fā)。⑤旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣器裝載臂，使芯片蓋與芯片基座粘合，用力按壓15s以上，以確保兩者粘合緊密。⑥取下芯片，從兩側(cè)夾住芯片握穩(wěn)，使芯片呈45°角進(jìn)行排氣。從排氣孔注射油相浸液，盡量不要產(chǎn)生氣泡，以免影響擴(kuò)增的熱均勻性。油液注滿直至芯片腔內(nèi)空氣排盡，用無塵紙擦拭排氣孔周圍，保證排氣孔周圍潔凈、干燥、無油無絨，然后粘貼3m密封膠以封閉排氣孔。4.pcr擴(kuò)增(1)打開pcr擴(kuò)增艙，用無塵布擦拭加熱模塊，保證模塊潔凈、干燥后，打開pcr儀電源開關(guān)，準(zhǔn)備pcr擴(kuò)增。(2)將芯片按順序放入芯片適配器中，并蓋上白色硅膠散熱墊(thermalpads)，將反應(yīng)架固定于pcr儀相應(yīng)位置，確保芯片排氣孔統(tǒng)一朝上后，合上pcr儀熱蓋。(3)設(shè)置pcr反應(yīng)條件如下：熱蓋溫度設(shè)定為75℃。5.結(jié)果呈現(xiàn)及分析(1)數(shù)字pcr結(jié)果匯總①散點(diǎn)圖如圖1、圖2和圖3所示，her2基因的fam信號對應(yīng)人血，vic信號對應(yīng)載體；rps27a基因的fam信號對應(yīng)載體，vic信號對應(yīng)人血，②軟件結(jié)果芯片號數(shù)copies(vic)copies(fam)1367.7149.614246.833346.33352.50547.568(2)計(jì)算方法①校正后結(jié)果計(jì)算方法：c(her2):1號芯片中fam信號拷貝數(shù)濃度，即her2基因拷貝數(shù)濃度，c(her2’):1號芯片中vic信號拷貝數(shù)濃度，即her2’基因拷貝數(shù)濃度，c(rps27a):2號芯片中fam信號拷貝數(shù)濃度，即rps27a基因拷貝數(shù)濃度，c(rps27a’):2號芯片中fam信號拷貝數(shù)濃度，即rps27a’基因拷貝數(shù)濃度。②校正前結(jié)果計(jì)算方法：c(her2):3號芯片中fam信號拷貝數(shù)濃度，即her2基因拷貝數(shù)濃度，c(rps27a):3號芯片中fam信號拷貝數(shù)濃度，即rps27a基因拷貝數(shù)濃度。(3)結(jié)果比較根據(jù)結(jié)果計(jì)算確定：矯正前結(jié)果為：1.1037，矯正后結(jié)果為0.9977；由于所用的所有全血樣本都來源于正常人，所以這些樣本的真實(shí)檢測結(jié)果應(yīng)該為1。由此可以確定本專利中所述方法可以極大程度地降低不同基因及引物之間擴(kuò)增效率差異對數(shù)字pcr結(jié)果的影響。實(shí)施例2二、外胚層神經(jīng)皮層基因擴(kuò)增矯正(一)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法：(二)數(shù)字pcr結(jié)果匯總1.散點(diǎn)圖如圖4、圖5和圖6所示，enc1基因的fam信號對應(yīng)人血，vic信號對應(yīng)載體；rnf213基因的fam信號對應(yīng)載體，vic信號對應(yīng)人血，2.結(jié)果芯片號數(shù)copies(vic)copies(fam)132.04329.97231.42129.641327.63827.4423.結(jié)果比較根據(jù)結(jié)果計(jì)算確定：矯正前結(jié)果為0.9353，矯正后結(jié)果為0.9929，由于所用的所有全血樣本都來源于正常人，所以這些樣本的真實(shí)檢測結(jié)果應(yīng)該為1。由此可以確定本專利中所述方法可以極大程度地降低不同基因及引物之間擴(kuò)增效率差異對數(shù)字pcr結(jié)果的影響。當(dāng)前第1頁12