本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分檢測(cè)的寡核苷酸引物和熒光標(biāo)記探針，包含所述引物探針的試劑盒，用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr檢測(cè)方法以及樣品中轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的大量研究及其在日常生活中的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人類健康以及生存環(huán)境所帶來的安全性問題已經(jīng)引起世人的廣泛關(guān)注及爭(zhēng)論。因此，世界各國(guó)在積極研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)，也對(duì)各種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)分析方法進(jìn)行了大量研究。但由于轉(zhuǎn)基因種類多，數(shù)量大，尤其是很多轉(zhuǎn)基因食品經(jīng)過深加工和各種條件處理保存后，轉(zhuǎn)基因成分大量降解，檢測(cè)難度加大。因此，需要根據(jù)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展不斷更新和發(fā)展各種轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)技術(shù)，以加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)督、監(jiān)測(cè)和管理，減少其商品化可能帶來的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)保護(hù)公眾健康、保護(hù)廣大消費(fèi)者知情權(quán)和選擇權(quán)。

目前，世界各國(guó)出于經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生、環(huán)保等各種目的紛紛對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品加強(qiáng)管理和檢測(cè)。包括中國(guó)在內(nèi)的50個(gè)左右國(guó)家和地區(qū)相繼頒布并實(shí)行了“轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度”，對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)和管理。近年來，隨著各國(guó)有關(guān)gmo（geneticallymodifiedorganism）標(biāo)簽法的建立和不斷完善，對(duì)食品中的gmo含量下限已有所規(guī)定。很多國(guó)家不但要求對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行定性檢測(cè)，還需要對(duì)食品中的gmo含量進(jìn)行定量檢測(cè)，以便標(biāo)識(shí)，其標(biāo)識(shí)的閾值一般在0.9%–5%之間。而建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)尤其是精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)是實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的技術(shù)前提。因此，轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量技術(shù)將隨著全世界標(biāo)識(shí)制度的完善和發(fā)展日趨重要。

數(shù)字pcr(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)作為更精確和更靈敏的dna定量檢測(cè)新技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單分子dna的絕對(duì)定量。dpcr是在普通數(shù)字pcr基礎(chǔ)上建立起來的dna絕對(duì)定量方法，解決了普通數(shù)字pcr所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響等問題，并可減少其帶來的基體效應(yīng)。dpcr具有測(cè)量獨(dú)立性與無需任何校準(zhǔn)物的特點(diǎn)。

我國(guó)轉(zhuǎn)基因水稻研究處于國(guó)際領(lǐng)先水平，dpcr技術(shù)的出現(xiàn)為大米轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)開辟了新的途徑，使得食品中大米轉(zhuǎn)基因成分的定量分析與溯源成為可能。利用dpcr技術(shù)提升定量檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性與實(shí)用價(jià)值將成為轉(zhuǎn)基因精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和熒光標(biāo)記探針。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供精準(zhǔn)定量測(cè)定轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供精準(zhǔn)定量測(cè)定轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr檢測(cè)方法。

本發(fā)明的還一個(gè)目的在于，提供轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在精準(zhǔn)定量檢測(cè)食品中轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分中的應(yīng)用。

針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻外源插入位點(diǎn)與大米基因組交界處設(shè)計(jì)了能特異性鑒別轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的寡核苷酸引物對(duì)和探針，能從樣品dna中高效特異擴(kuò)增出一段較短的轉(zhuǎn)基因大米特異性基因片段。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于數(shù)字pcr方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和熒光標(biāo)記探針，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因與其他品系轉(zhuǎn)基因作物具有差異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所述引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物為kmd-lftccgcaatgtgttattaagttgtctaa（seqidno.1），所述下游引物為kmd-lrccgatatgcctgcccatct（seqidno.2）；所述探針為kmd-lpcgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg（seqidno.3），在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因大米特異性檢測(cè)組合物，所述組合物包含特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于數(shù)字pcr方法定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的組合物，所述組合物包含轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針，其中所述轉(zhuǎn)基因大米特異性引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr定量檢測(cè)方法，所述方法包括使用針對(duì)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針，所述引物對(duì)和探針是根據(jù)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因的唯一性而設(shè)計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr定量檢測(cè)方法中，所使用的轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的pcr擴(kuò)增條件為95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個(gè)循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大米數(shù)字pcr定量檢測(cè)方法還進(jìn)一步包括確定特異性寡核苷酸引物和探針組合的定量檢測(cè)限的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述數(shù)字pcr檢測(cè)方法定量檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的檢測(cè)靈敏度為0.5copy/μl。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明用于數(shù)字pcr方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)以及探針和使用說明書。在本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分定量檢測(cè)特異性寡核苷酸引物對(duì)是根據(jù)該品系特異性基因與其他任何一種轉(zhuǎn)基因作物的序列均具有差異性的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒的轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的堿基序列為seqidno.1，所述下游引物的堿基序列為seqidno.2；所述試劑盒中探針的堿基序列為seqidno.3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的用于數(shù)字pcr方法鑒別轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針以及使用說明書。在試劑盒的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒中包含轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)seqidno.1、seqidno.2和轉(zhuǎn)基因大米特異性探針seqidno.3，在探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的使用說明書中包括對(duì)用于快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的數(shù)字pcr擴(kuò)增條件的描述。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒的說明書中給出的pcr擴(kuò)增條件是95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個(gè)循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分定量檢測(cè)的試劑盒還包括對(duì)照品。優(yōu)選地，對(duì)照品包括陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品。在一個(gè)實(shí)施方案中，陰性對(duì)照為無菌雙蒸水。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供本發(fā)明的用于數(shù)字pcr方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物和探針在檢測(cè)食品中轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分中的應(yīng)用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供果汁中轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)seqidno.1、seqidno.2和轉(zhuǎn)基因大米特異性探針seqidno.3，在轉(zhuǎn)基因大米its基因探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供本發(fā)明的試劑盒在定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的應(yīng)用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上述應(yīng)用中，所述試劑盒包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針。更優(yōu)選的，在本發(fā)明的上述應(yīng)用中，所述試劑盒包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因大米特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因大米品系克螟稻的基因組為參考模板，根據(jù)該品系特異性基因序列與其他轉(zhuǎn)基因作物基因具有差異性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用數(shù)字pcr法定量檢測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分。

數(shù)字pcr技術(shù)(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)是通過將微量樣品分級(jí)作大倍數(shù)稀釋和細(xì)分，直至每個(gè)細(xì)分試樣中所含有的待測(cè)分子數(shù)不會(huì)超過1個(gè)后，再將所有細(xì)分試樣同時(shí)在相同條件下進(jìn)行pcr放大，按照泊松分布原理逐個(gè)進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種技術(shù)，是一種絕對(duì)定量測(cè)量方法。

本發(fā)明的數(shù)字pcr檢測(cè)方法不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值，也不需要看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，是dna絕對(duì)定量方法，具有結(jié)果可靠和準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的按照引物序列制成的試劑盒，用于此類產(chǎn)品的精準(zhǔn)定量和低含量靈敏定性檢測(cè)，具有定量結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定可靠且避免交叉污染造成假陽性的優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明的數(shù)字pcr檢測(cè)方法和pcr檢測(cè)試劑盒，可對(duì)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量檢測(cè)，其定量檢測(cè)限能達(dá)到0.5拷貝/μl，適合用于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上米制品中轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的實(shí)際定量檢測(cè)需求。

附圖說明

圖1顯示的是通過實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因序列的結(jié)果，其中基線上方為轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系樣品及陽性對(duì)照的擴(kuò)增曲線，基線下方為轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)、m12、轉(zhuǎn)基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、mon88017及非轉(zhuǎn)基因大米、大豆、玉米、空白對(duì)照（無菌雙蒸水）。

圖2顯示的是數(shù)字pcr精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻及其他轉(zhuǎn)基因作物的結(jié)果圖，其中從左到右依次為轉(zhuǎn)基因大米克螟稻、轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)、m12、轉(zhuǎn)基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、mon88017及非轉(zhuǎn)基因大米、大豆、玉米、空白對(duì)照（無菌雙蒸水）。

圖3是對(duì)數(shù)字pcr精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的準(zhǔn)確性和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，將轉(zhuǎn)基因大米樣品基因組dna原液分別稀釋5倍、25倍、250倍，每個(gè)梯度重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行數(shù)字pcr擴(kuò)增。與理論值相比計(jì)算定量結(jié)果的偏差，并根據(jù)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算其sd和rsd值。

圖4是利用本發(fā)明建立的數(shù)字pcr技術(shù)對(duì)理論含量為0.5copies/μl的克螟稻低含量模擬樣品進(jìn)行精準(zhǔn)定量的數(shù)字pcr微滴分布圖。從左到右，分別為4個(gè)平行，每個(gè)平行均進(jìn)行了2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

通過實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

本發(fā)明的發(fā)明人首次通過實(shí)時(shí)熒光pcr（探針法）擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因。所使用的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因引物探針序列為上游引物kmd-lftccgcaatgtgttattaagttgtctaa（seqidno.1），下游引物為kmd-lrccgatatgcctgcccatct（seqidno.2）；探針為kmd-lpcgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg（seqidno.3）。

1.所使用的檢測(cè)主要儀器：

微量移液器（eppendorf）、熒光定量pcr儀（ab7500）、高速臺(tái)式離心機(jī)(12000r/min)、電泳儀(dyy22c型)等。

2.檢測(cè)主要試劑：

2×taqmanuniversalpcrmastermix(abi)，引物探針（thermofisher）等。

3.檢測(cè)主要步驟：

實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)體系：

2×mastermix12.5μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探針（10mm）0.5μl

模板dna50ng

加無菌雙蒸水至總體積為25μl

注：每次pcr檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照（用配制反應(yīng)體系的超純水代替dna模板，檢測(cè)試劑是否受到污染）；

4實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)參數(shù)：

95℃10min

95℃15s

60℃1min

注：不同儀器應(yīng)將pcr各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。

如圖1所示，利用實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因時(shí)，克螟稻品系樣品和陽性對(duì)照可出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他品系轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)、m12、轉(zhuǎn)基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、mon88017及非轉(zhuǎn)基因大米、大豆、玉米、空白對(duì)照均未出現(xiàn)熒光曲線，表明該引物探針對(duì)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系具有特異性。

實(shí)施例2

本實(shí)施例為通過使用轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性引物探針序列經(jīng)數(shù)字pcr定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米基因的拷貝數(shù)。所使用的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性引物探針序列為上游引物為上游引物kmd-lftccgcaatgtgttattaagttgtctaa（seqidno.1），下游引物為kmd-lrccgatatgcctgcccatct（seqidno.2）；探針為kmd-lpcgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg（seqidno.3）。

1.所使用的檢測(cè)主要儀器：

微量移液器（eppendorf）、微滴式數(shù)字pcr儀（bio-rad,qx200）、高速臺(tái)式離心機(jī)(12000r/min)等。

2.檢測(cè)主要試劑：

2×taqmanmastermix(bio-rad)，引物探針（thermofisher）等。

3.檢測(cè)主要步驟：

數(shù)字pcr反應(yīng)體系：

2×mastermix10μl

上游引物（10mm）1.0μl

下游引物（10mm）1.0μl

探針（10mm）0.5μl

模板dna5.0μl

無菌雙蒸水2.5μl

注：每次pcr檢測(cè)均設(shè)立相應(yīng)的空白對(duì)照（用配制反應(yīng)體系的超純水代替dna模板，檢測(cè)試劑是否受到污染）；

4.數(shù)字pcr反應(yīng)參數(shù)：

95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個(gè)循環(huán)；98℃10min（1℃/s）

注：不同儀器應(yīng)將pcr各試劑及反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。

如圖2所示，利用數(shù)字pcr精準(zhǔn)定量檢測(cè)同樣dna濃度的轉(zhuǎn)基因大米及其他樣品時(shí)，成功檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大米的量為578copies/μl，而其他品系轉(zhuǎn)基因大米科豐6號(hào)、m12、轉(zhuǎn)基因大豆gts-40-3-2、dp-306043、轉(zhuǎn)基因玉米nk603、mon88017及非轉(zhuǎn)基因大米、大豆、玉米、空白對(duì)照均無擴(kuò)增，表明該方法可準(zhǔn)確特異的檢測(cè)出樣品中的轉(zhuǎn)基因大米克螟稻成分。

實(shí)施例3

與實(shí)施例2所述的方法相同，將轉(zhuǎn)基因大米樣品基因組dna分別稀釋1倍、5倍和50倍后作為模板，每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次，采用轉(zhuǎn)基因大米克螟稻擴(kuò)增引物探針序列與實(shí)施例2中的相同，進(jìn)行數(shù)字pcr定量檢測(cè)，以測(cè)定方法靈敏度。

轉(zhuǎn)基因大米樣品基因組dna原液、稀釋5倍及50倍后的平均含量分別為551copies/μl、106.4copies/μl、13.2copies/μl，與理論值的偏差分別為-4.67%、0.15%、1.74%，基本符合其理論拷貝數(shù)值，各稀釋梯度的3次重復(fù)的rsd值分別為1.07%、6.92%、7.35%（圖3），表明該精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分時(shí)準(zhǔn)確性和靈敏度較好，可對(duì)不同含量的該品系特異性基因成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量。

實(shí)施例4

本實(shí)施例中提供精準(zhǔn)定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的試劑盒。所述試劑盒包括本發(fā)明的用于數(shù)字pcr方法鑒別轉(zhuǎn)基因大米克螟稻品系特異性基因成分的特異性寡核苷酸引物對(duì)和探針以及使用說明書。所述試劑盒包括引物對(duì)seqidno.1、seqidno.2和轉(zhuǎn)基因大米特異性探針seqidno.3，在轉(zhuǎn)基因大米tt51-1品系特異性基因探針的3’端連接有一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)bhq1，5’端連接有一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)fam，所述使用說明書中給出了pcr擴(kuò)增條件，該條件為95℃，5min（1℃/s）；94℃15s，60℃1min（1℃/s），共50個(gè)循環(huán)；98℃10min（1℃/s）。對(duì)于不同儀器，反應(yīng)參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。與實(shí)施例3所述的方法相同，對(duì)理論含量為0.5copies/μl的克螟稻低含量模擬樣品進(jìn)行dpcr擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，共設(shè)置6個(gè)平行。

如圖3所示，克螟稻檢測(cè)濃度為0.5copy/μl時(shí)，6份平行樣品定量結(jié)果分別為0.53336copies/μl、0.47793copies/μl、0.55447copies/μl、0.50107copies/μl、0.55442copies/μl、0.49793copies/μl，與理論含量值的偏差在-4.41%~10.89%之間，其各平行樣品的rsd在9.07%~24.71%之間，6份平行樣品的rsd為6.2%，均符合rsd值小于等于25%的要求。結(jié)果表明該方法對(duì)于精準(zhǔn)定量檢測(cè)低含量的轉(zhuǎn)基因大米tt51-1品系特異性基因成分時(shí)方法精密度和重現(xiàn)性均較好。

由于目前的數(shù)字pcr平臺(tái)分為微滴式和芯片式兩種，本發(fā)明通過在不同平臺(tái)進(jìn)行實(shí)施例分析，驗(yàn)證了本發(fā)明所建立的方法對(duì)于這兩個(gè)平臺(tái)同時(shí)適用。雖然已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的前提下可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改變與修飾。因而，本發(fā)明意欲涵蓋落在附屬權(quán)利要求書及其同等物范圍內(nèi)的所有這些改變與修飾。