本發(fā)明涉及一種rlj-rgd3蛋白的制備方法，尤其是一種高純度無內毒素的rlj-rgd3蛋白制備方法。

背景技術：

lj-rgd3為來源于日本七鰓鰻口腔腺分泌物的rgd毒素蛋白，由117個氨基酸殘基組成，lj-rgd3的一級結構除具有三個rgd模體和一對半胱氨酸這一典型的rgd毒素蛋白特征外，還含有17個組氨酸，17個精氨酸，是一類hrg的堿性蛋白，已公開于專利號為200510083437.7、名稱為“具抗腫瘤作用的日本七鰓鰻口腔腺rgd模體蛋白的基因克隆與表達”的中國發(fā)明專利文獻中，即命名為lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗腫瘤增殖、抗血栓等功效。rlj-rgd3是lj-rgd3的基因重組蛋白，該重組蛋白沒有任何純化標簽。

內毒素是存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，也叫做脂多糖，對宿主具有毒性。內毒素的主要毒性成分為類脂質a，其位于細胞壁的最外層，覆蓋于細胞壁的黏肽上，當細菌死亡溶解或者用人工方法破壞細菌細胞后，內毒素會從細菌中釋放出來。內毒素可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等癥狀，因此對生物制品的內毒素含量有嚴格的限定，在生物制品的制備過程中內毒素的去除是必不可少的一個環(huán)節(jié)。由于rlj-rgd3來自于大腸桿菌的表達上清，因此所收集的菌體破碎液中會含有大量內毒素，而內毒素不是蛋白質，因此非常耐熱，只有在160℃的溫度下加熱2~4個小時，或用強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能破壞它的生物活性，但是在破壞內毒素活性的同時，也破壞了rlj-rgd3的活性。

目前，對于rlj-rgd3的制備過程中大多需要采用高壓均質機進行菌體細胞破碎，之后再采用離心方法進行菌體收獲及澄清，存在明顯弊端：由于菌液粘度大，限制的離心機的離心速度，需要多臺離心機連續(xù)工作，不僅導致極高的設備投資和日常維護成本，而且操作繁瑣、勞動強度大、參數(shù)不可控、易受人為因素干擾，不利于大規(guī)模的生產和工藝放大，影響生產工藝的重復性。雖然，后續(xù)也有對澄清液進行純化的步驟，但是并不能將所含有的內毒素徹底去除。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種高純度無內毒素的rlj-rgd3蛋白制備方法。

本發(fā)明的技術解決方案是：一種無內毒素的rlj-rgd3蛋白制備方法，其特征在于按如下步驟進行：

a.將轉化有pet23b-rgd3重組質粒的大腸桿菌bl21高密度發(fā)酵及iptg誘導表達，收集菌體，采用高壓均質機進行菌體細胞破碎，得破菌液；

b.過濾破菌液得澄清液；

c．將澄清液通過鎳離子親和層析進行目的蛋白的捕獲；

d.利用superdex75分子篩進行蛋白的第二步精細純化；

e.利用qff陰離子交換進行蛋白的第三步純化。

所述a步驟是將轉化有pet23b-rgd3重組質粒的大腸桿菌bl21在lb培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，od600達90，終濃度1mmiptg誘導表達后，30℃過夜培養(yǎng)，收獲菌體并采用高壓均質機進行菌體細胞破碎。

所述b步驟是先以體積比為1：1向破菌液中加入緩沖液稀釋，再將稀釋的破菌液用緩沖液稀釋5倍，采用750k中空纖維微濾膜進行切向流過濾，得澄清液。

所述步驟c是采用鎳離子親和層析ni6fastflow柱，所用的1×bindingbuffer成分由5mmimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9；所用的1×washingbuffe成分由60mmimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9；所用的1×elutingbuffe成分由1mimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9。

所述d步驟所用的ph7.4的20mmpbs緩沖液是由1mna2hpo4貯液15.48ml與1mnah2po4貯液4.52ml混合后，用h2o定容至1000ml配制而成。

所述e步驟所用的ph8.0的20mmpbs緩沖液是由1mna2hpo4貯液18.64ml與1mnah2po4貯液1.36ml混合后，用h2o定容至1000ml配制而成。

本發(fā)明是將菌體高密度發(fā)酵并通過切向流過濾、鎳離子親和層析、分子篩層析、陰離子離子交換層析等系列方法制備無內毒素的高純度rlj-rgd3蛋白，蛋白純度達99%。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例所得澄清液過濾透過端目標蛋白的sds-page示意圖。

圖2是本發(fā)明實施例分子篩層析純化結果sds-page示意圖。

圖3是本發(fā)明實施例分子篩層析純化結果sechplc示意圖。

圖4是本發(fā)明實施例qff陰離子交換后純化結果sds-page示意圖。

具體實施方式

按如下步驟進行：

a.將轉化有pet23b-rgd3重組質粒的大腸桿菌bl21在lb培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，od600達90，終濃度1mmiptg誘導表達后，30℃過夜培養(yǎng)，收獲菌體并采用高壓均質機進行菌體細胞破碎，得破菌液；

b.過濾破菌液得澄清液：

先以體積比為1：1向破菌液中加入緩沖液稀釋，再將稀釋的破菌液用緩沖液稀釋5倍，采用ge公司的aktaflux系統(tǒng)，用750k中空纖維微濾膜進行切向流過濾，獲得澄清液；

采用sds-page鑒定回流端殘留，以有效完成目標蛋白的透過澄清目的。sds-page的鑒定結果示意圖，見圖1。

圖1中：m:marker；1:200ml緩沖液過濾透過端；2：1ll緩沖液過濾透過端；3：1.5ll緩沖液過濾透過端；4：1.94ll緩沖液過濾透過端；5：2ll緩沖液過濾透過端：6：3ll緩沖液過濾透過端；7：3.5ll緩沖液過濾透過端；8：4ll緩沖液過濾透過端；9：4.5ll緩沖液過濾透過端；10：5ll緩沖液過濾透過端；11：終止；12：回流端殘留。

從圖1可以看出，目的蛋白隨著透過端體積的增大而濃度越來越低。當連續(xù)洗濾體積達到4倍后濃度顯著下降，即4~4.5倍的連續(xù)洗濾體積即可完成樣品澄清。本步驟平均透過流速為20l/h，tmp過膜壓力均小于6psi（遠小于20psi的安全壓力上限）。

c．將澄清液通過鎳離子親和層析進行目的蛋白的捕獲：

具體實施按如下步驟：

打開akat蛋白純化系統(tǒng)、電腦顯示器等電源開關，待儀器自檢完畢，雙擊桌面上unicorn6圖標，進入操作界面；首先將a1管路放入去離子水中，將a2管路放入1×bindingbuffer緩沖液進行管路清洗及準備，在systemcontrol窗口點擊工具欄內的manual選擇pumpsandpressures→pumpwash，點擊execute，泵清洗將自動結束；將ge公司空柱安放到柱夾上，并將其下口連接頭接在柱位閥的4b位置；選擇manual→alarms→alarmprecolumnpressure，設置highpressure為0.3mpa；選擇flowpath→columnposition→4號，upflow；選擇pumpsandpressures→systemflow，速設置為5ml/min，執(zhí)行execute。排除管路中的氣泡，將下口連接柱子上，擰緊密封圈；下面柱頭處保留1~2cm水，按操作板上“pause”鍵使機器暫停；將混勻好的ni6fastflow緩緩倒入空柱中，沉淀；待膠面穩(wěn)定后，吸出膠面上方多余水，將柱子上面連接頭接在機器柱位閥的4a處，程序設flowpath→columnposition→downflow，執(zhí)行execute；排出柱頭上面管路中氣泡，按“pause”鍵暫停，下柱頭至膠面2~3cm，擰緊密封圈；點擊操作板上“continue”鍵，使機器運行；用5倍柱體積去離子水去除膠中所含的20%乙醇，以機器上電導值為0為準對柱子進行平衡；再設置程序flowpath→inleta→a2，點擊execute，用1×bindbuffer緩沖液平衡ni柱，平衡體積為5個cv以上，此時紫外線達到平行，進行紫外調零，選擇monitors→autozerouv，execute；將a泵的a1口放入過濾好的澄清液中，程序設置a1口進行上樣；此時紫外檢測的是蛋白穿透液，可進行收集，以檢測蛋白結合情況；待上完樣后，設將a2口放入1×bindingbuffer緩沖液，使蛋白與柱子緊密結合，直到電導線平行，按操作板上“pause”鍵使機器暫停；將a2放入配制好的1×washbuffer中，flowpath→inleta→a2，點擊execute，待一個cv后紫外又重新降為0為準；程序設置flowpath→inleta→a2，系統(tǒng)泵入1×elutebuffer進行洗脫目的蛋白；在manual里選擇fractioncollection→fraction，點擊execute進行目的蛋白洗脫，將所得蛋白濃度電泳檢測后進行下一步的純化。

所用的1×bindingbuffer成分由5mmimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9；所用的1×washingbuffe成分由60mmimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9；所用的1×elutingbuffe成分由1mimidazole，0.5mnacl，20mmtris-hcl組成，ph7.9。

d.利用superdex75分子篩進行蛋白的第二步精細純化：

準備20mmpbs（ph7.4）緩沖液，使用前要進行低頻超聲脫氣處理10min；將新膠加脫氣后的去離子水進行充分沉淀，多次更換去離子水，以保證去除膠中所帶20%乙醇；打開akat蛋白純化系統(tǒng)、電腦顯示器等電源開關，待儀器自檢完畢，雙擊桌面上unicorn6圖標，進入操作界面；將a1管路放入去離子水中，在systemcontrol窗口點擊工具欄內的manual選擇pumpsandpressures→pumpwash，點擊execute進行管路清洗及準備，泵清洗將自動結束；將ge公司xk50×100空柱安放到柱夾上，并將其下口連接頭接在柱位閥的3b位置；選擇manual→alarms→alarmprecolumnpressure，設置highpressure為0.3mpa；選擇flowpath→columnposition→3號，upflow；選擇pumpsandpressures→systemflow，流速設置為8.5ml/min，執(zhí)行execute；排除管路中的氣泡，將下口連接柱子上，擰緊密封圈；下面柱頭處保留1~2cm水，柱子上方接上裝柱器；按操作板上“pause”鍵使機器暫停；將裝柱器蓋子管路連接在3a柱位閥上，程序設flowpath→columnposition→downflow，執(zhí)行execute灌膠；點擊操作板上“continue”鍵，使機器運行；排出中氣泡，待液體穩(wěn)定流出時，用玻璃棒引流，將充分混勻好的3400mlsuperdex75膠、水混合物（其體積是空柱加裝柱器的體積之和）以適當?shù)乃俣鹊谷肟罩校簧w上裝柱器的蓋子，保證液液相接，擰緊裝柱器蓋；流速8.5ml/min，大約3h；待膠面穩(wěn)定后，停止程序，采用恒壓進行壓柱；待膠面穩(wěn)定后，取下裝柱器及其管路，吸出膠面上方多余水，將柱子上面連接頭接在機器柱位閥的3a處，程序設flowpath→columnposition→downflow，執(zhí)行execute；排出柱頭上面管路中氣泡，按“pause”鍵暫停，下柱頭至膠面2~3cm，擰緊密封圈；用去離子水平衡5個cv，上樣2ml2%的丙酮，運行1個cv進行柱效測定；用20mmpbs緩沖液平衡柱子至少5個體積，以紫外檢測為0為準；上樣ni柱蛋白；再用20mmpbs緩沖液進行走柱，收集分子篩樣品，進行電泳、sechplc檢測。

所用的ph7.4的20mmpbs緩沖液是由1mna2hpo4貯液15.48ml與1mnah2po4貯液4.52ml混合后，用h2o定容至1000ml配制而成。

電泳檢測結果如圖2所示。

圖2中（a）aktaavant-25蛋白洗脫收集曲線；（b）15%膠濃度非還原sds-page，示峰1各收集管樣品。

sechplc檢測結果如圖3所示，結果表明經(jīng)superdex75分子篩層析純化的蛋白純度達98%。

e.利用qff陰離子交換進行蛋白的第三步純化：

準備20mmpbs（ph=8.0）緩沖液、0.6mnaoh溶液，所有緩沖液使用前要進行低頻超聲脫氣處理10min；空柱下端連接好，保證有1~2cm水且無氣泡；將qff膠混勻后緩緩灌入空柱中，待膠面穩(wěn)定后，緩緩下柱頭；0.6mnaoh溶液走4個cv，最后以naoh溶液保存在柱中過夜；用去內毒素水沖洗柱子中的naoh溶液，走8個體積水，檢測ph，以此來確定出口水ph為中性；確定q柱中無堿后，用20mmpbs（ph=8.0）緩沖液平衡q柱，收集出口緩沖液，檢測電導，以此來確定q柱是否平衡；q柱平衡后，對分子篩樣品進行上樣；上樣走柱一半體積后，開始對流穿蛋白進行收集，并對其進行濃度、電泳、內毒素檢測。

所用的ph8.0的20mmpbs緩沖液是由1mna2hpo4貯液18.64ml與1mnah2po4貯液1.36ml混合后，用h2o定容至1000ml配制而成。

采用凝膠法利用鱟試劑對純化蛋白進行內毒素檢測。

蛋白純度檢測：純化蛋白檢測方法為sechplc法或非還原sds-page法，其中sechplc法所用層析柱為tskgelg3000swxl層析色譜柱，流動相為3.2mm磷酸氫二鈉、1.5mm磷酸二氫鉀、400mmnacl，ph7.3；流動相配制方法：稱取1.15gna2hpo4,0.204gkh2po4,16gnacl溶于水，調節(jié)ph至7.3后，以水定容至1000ml。非還原sds-page法采用15%的丙烯酰胺分離膠濃度。

e步驟所得產品的sds-page結果示意圖如圖4所示，圖4中m：marker；1-4：各收集管樣品。結果表明：產品蛋白純度達99%以上。