本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海帶來源的褐藻功能寡糖的酶解制備方法。

背景技術(shù)：

褐藻膠在海藻中含量較高，主要存在于藻體的細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中，從海帶、馬尾藻、巨藻、泡葉藻等褐藻中均可提取褐藻膠。工業(yè)應(yīng)用的褐藻膠主要來源于海帶、巨藻、泡葉藻三個(gè)屬，歐美國家生產(chǎn)的褐藻膠大部分源自巨藻，中國生產(chǎn)的褐藻膠則更多源自海帶。目前商品化的褐藻膠主要以褐藻酸鈉等褐藻酸鹽的形式存在，因褐藻酸鹽具有獨(dú)特的理化性質(zhì)包括親水、凝膠、粘稠等特性，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、印染、化工等多領(lǐng)域。

但天然提取的海藻多糖因其黏性大、不易溶解、難消化、分子量大等缺點(diǎn)，難以被動(dòng)物體吸收利用，限制了其利用。褐藻寡糖是褐藻膠降解后生成的功能性低聚糖，一般是指聚合度（dp）低于20的糖鏈，其具有多種生物活性，尤其在抗氧化、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等方面具有重要作用。目前，褐藻膠降解的方法主要分為三類：物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法。生物降解法是利用褐藻膠裂解酶作用于底物位點(diǎn)的差異性制備褐藻寡糖，其通過β-消除反應(yīng)作用糖苷鍵形成的不飽和寡糖具有比化學(xué)降解法獲得的飽和寡糖更好的生物活性。同時(shí)，生物降解法相較于化學(xué)降解法具有特異性高、酶解條件溫和、反應(yīng)過程易控、產(chǎn)物產(chǎn)率高、不污染環(huán)境等優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明采用現(xiàn)代微生物工程技術(shù)研發(fā)可生物降解褐藻多糖的褐藻膠裂解酶，再通過酶工程技術(shù)取代傳統(tǒng)的化學(xué)降解法制備褐藻寡糖，使得海帶中不易被人體吸收利用的高黏度多糖降解成富含生理活性的褐藻寡糖，以及一些小分子活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了褐藻資源的高值化利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種海帶來源的褐藻功能寡糖的酶解制備方法，其可使海帶中不易被人體吸收利用的高黏度多糖降解成富含生理活性的褐藻寡糖，有利于實(shí)現(xiàn)褐藻資源的高值化利用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種海帶來源的褐藻功能寡糖的酶解制備方法，其特征在于：以海帶為原料，采用碳酸鈉堿提獲得褐藻膠，再利用褐藻膠裂解酶酶解，并通過凝膠色譜純化，制得所述褐藻功能寡糖。其具體包括以下步驟：

1）堿提制備褐藻膠：將海帶清洗后絞碎，按料液比70g/l加水，于90℃、碳酸鈉濃度3%w/v的條件下堿提3h，得褐藻膠；

2）酶解制備褐藻寡糖：在所得褐藻膠中加入磷酸緩沖液，加熱溶解，配成濃度為0.2%w/v的底物，然后加入褐藻膠裂解酶0.35u/ml，于45℃、ph7.0條件下酶解3h，然后沸水浴滅酶處理5min，用sevage法反復(fù)抽提去除蛋白，12000r/min離心5min，棄沉淀，上清液（50℃）旋蒸至原體積的1/20，無水乙醇沉淀寡糖，經(jīng)冷凍干燥后備用；

3）酶解寡糖的分離純化：將所得酶解產(chǎn)物采用bio-gelp-6凝膠柱進(jìn)行分離純化，以0.2mol/l碳酸氫銨為洗脫液，流速為0.4ml/min，分別收集各組分并進(jìn)行濃縮，經(jīng)冷凍干燥后得純化干品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明以海帶為原料，采用碳酸鈉堿提獲得褐藻膠后，利用褐藻膠裂解酶降解，并采用bio-gelp-6凝膠柱分離純化，制得富含生理活性的褐藻寡糖，有利于實(shí)現(xiàn)海帶資源的高值化利用；同時(shí)，本發(fā)明使用的褐藻膠裂解酶為本實(shí)驗(yàn)室自行研制，其活性高，有助于降低褐藻寡糖的生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為堿提時(shí)間的變化對(duì)褐藻膠得率的影響。

圖2為堿提溫度的變化對(duì)褐藻膠得率的影響。

圖3為料液比的變化對(duì)褐藻膠得率的影響。

圖4為堿濃度的變化對(duì)褐藻膠得率的影響。

圖5為加酶量的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響。

圖6為酶解時(shí)間的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響。

圖7為酶解溫度的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響。

圖8為ph的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響。

圖9為底物濃度的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響。

圖10為溫度和ph對(duì)褐藻膠水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖。

圖11為溫度和加酶量對(duì)褐藻膠水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖。

圖12為ph和加酶量對(duì)褐藻膠水解度影響的響應(yīng)曲面圖及等高線圖。

圖13為不同褐藻產(chǎn)物對(duì)羥自由基清除能力的對(duì)比圖。

圖14為不同褐藻產(chǎn)物對(duì)abts自由基清除能力的對(duì)比圖。

圖15為不同褐藻產(chǎn)物對(duì)dpph自由基清除能力的對(duì)比圖。

圖16為不同褐藻產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的對(duì)比圖。

圖17為不同濃度褐藻酶解產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活力的抑制作用情況圖。

圖18為褐藻酶解產(chǎn)物的薄層色譜圖，其中，m為褐藻寡糖標(biāo)品；1為酶解產(chǎn)物。

圖19為酶解產(chǎn)物采用凝膠柱分離純化的情況圖。

圖20為各分離純化產(chǎn)物的薄層色譜圖，其中，m為褐藻寡糖標(biāo)品；1為組分1；2為組分2；3為組分3。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

所用褐藻膠裂解酶按文獻(xiàn)（韓偉，林娟，謝勇，等.“褐藻膠裂解酶基因的克隆表達(dá)及重組酶酶學(xué)性質(zhì)”，《微生物學(xué)通報(bào)》，2017,44（5）：1074-1080）進(jìn)行制備。

所用海帶由福建億達(dá)食品有限公司提供；所用bio-gelp-6凝膠、abts、dpph、酪氨酸酶均購自sigma公司；所用薄層用硅膠粉購自德國merck公司；所用褐藻寡糖標(biāo)品購自青島博智匯力公司；所用羧甲基纖維素鈉(cmc)購自阿拉丁公司；所用無水乙醇、苯酚、硫酸、鹽酸等常規(guī)藥品均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

實(shí)施例1堿提海帶制備褐藻膠的工藝優(yōu)化

褐藻膠得率的計(jì)算方法為：褐藻膠得率（%）=褐藻膠干重/海帶干重×100%。

1.在液料比50:1，溫度70℃，碳酸鈉濃度1%的條件下，考察堿提時(shí)間的變化對(duì)褐藻膠得率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可見，最適堿提時(shí)間為3h。

2.在液料比50:1，提取時(shí)間3h，碳酸鈉濃度1%的條件下，考察溫度的變化對(duì)褐藻膠得率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可見，最適堿提溫度為80℃。

3.在堿提溫度80℃，提取時(shí)間3h，碳酸鈉濃度1%的條件下，考察料液比的變化對(duì)褐藻膠得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可見，最適液料比為60:1。

4.在堿提溫度80℃，提取時(shí)間3h，液料比60:1的條件下，考察堿液濃度的變化對(duì)褐藻膠得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可見，最適堿濃度為2%。

5.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，按l9（3⁴）正交表對(duì)堿提褐藻膠中的時(shí)間（2h，3h，4h）、溫度（70℃，80℃，90℃）、堿濃度（1%，2%，3%）、液料比（50:1，60:1，70:1）進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，各因素水平表如表1所示，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果見表3。

表1因素水平表

表2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3方差分析表

方差分析可知，只有因素a（時(shí)間）對(duì)褐藻膠得率具有顯著性影響，因素作用的主次順序?yàn)閍（時(shí)間）>d（液料比）>b（溫度）>c（堿濃度），通過表2可知a、b、c、d的最優(yōu)水平分別為a2b3c3d1，即從海帶中堿提褐藻膠的最佳工藝條件為：時(shí)間為3h，溫度90℃，堿濃度3%，液料比70:1，此時(shí)褐藻膠的最高得率為62%。

實(shí)施例2褐藻寡糖的酶解制備工藝優(yōu)化

褐藻膠水解度的計(jì)算方法：

，

式中：n：苯酚-硫酸法測得糖含量，g；

m：苯酚-硫酸法測得總糖含量，g。

1.在酶解時(shí)間2h，溫度50℃，底物濃度0.5%，ph值7.0的條件下，考察加酶量的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見，當(dāng)加酶量為0.3u/ml時(shí)水解度最大。

2.在酶解溫度50℃，底物濃度0.5%，ph值7.0，加酶量0.3u/ml的條件下，考察酶解時(shí)間的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可見，當(dāng)酶解時(shí)間為3h時(shí)水解度最大。

3.在酶解時(shí)間3h，底物濃度0.5%，ph7.0，加酶量0.3u/ml的條件下，考察酶解溫度的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可見，當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)水解度最大。

4.在酶解時(shí)間3h，溫度45℃，底物濃度0.5%，加酶量0.3u/ml的條件下，考察ph變化對(duì)褐藻膠水解度的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可見，當(dāng)ph為7.5時(shí)水解度最大。

5.在酶解時(shí)間3h，溫度45℃，ph7.5，加酶量0.3u/ml的條件下，考察底物濃度的變化對(duì)褐藻膠水解度的影響，結(jié)果見圖9。由圖9可見，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.2%時(shí)水解度最大。

6.在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用box-behnken中心組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)酶解工藝。因素水平編碼表如表4所示，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表5。

表4響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

表5響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

二階模型的建立與分析

利用design-expert8.0.5b軟件對(duì)表5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：y=67.86+1.42·x1-5.99·x2-15.04·x3+4.54·x1·x2-6.56·x2x3-9.98·x1²-12.62·x2²。

表6方差分析表

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。由表6可見，模型的f=74.00，p<0.0001<0.01，表明模型效應(yīng)顯著；失擬p=0.3251>0.05，表明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度較好。x2、x3、x1x2、x2x3、x1²、x2²對(duì)褐藻膠水解度的影響極顯著，表明酶解溫度（x2）、ph（x3）、加酶量和酶解溫度的交互作用（x1x2）、酶解溫度和ph的交互作用（x2x3）、加酶量的平方（x1²）、酶解溫度的平方（x2²）在所取水平范圍內(nèi)對(duì)褐藻膠水解度有顯著影響。加酶量（x1）對(duì)回歸方程的影響不顯著。由各項(xiàng)的f值可知，各因素對(duì)褐藻膠水解度的影響程度依次為：x3（ph）>x2（酶解溫度）>x1（加酶量）。

根據(jù)分析結(jié)果，得到最終優(yōu)化條件為：最佳酶解工藝條件為ph7.0、溫度45.15℃、加酶量0.35u/ml、酶解時(shí)間3h、底物濃度0.2%，水解度預(yù)測值為80.35%，水解度實(shí)驗(yàn)測定值為71.22%，說明該模型可以較好地反映實(shí)際酶解過程。

實(shí)施例3酶解產(chǎn)物的生物活性研究

褐藻寡糖酸解產(chǎn)物的制備：配制1.5%褐藻膠底物100ml，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至4.0，120℃烘箱中反應(yīng)4h；反應(yīng)后調(diào)ph至7.0，離心棄沉淀，上清液50℃旋蒸至原體積的1/20；無水乙醇沉淀寡糖，樣品干燥后得酸解褐藻寡糖，備用。

1.羥自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

由圖13可見，在相同濃度下，褐藻酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除能力（ic50為0.182mg/ml）明顯高于酸解產(chǎn)物（ic50為0.448mg/ml）和褐藻膠多糖（ic50為0.554mg/ml）。

2.abts自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

由圖14可見，在相同濃度下，褐藻酶解產(chǎn)物清除abts自由基的能力（ic50為0.0798mg/ml）明顯高于酸解產(chǎn)物（ic50為0.125mg/ml），而褐藻膠多糖對(duì)abts自由基基本沒有清除能力。

3.dpph自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

由圖15可見，在相同濃度下，褐藻酶解產(chǎn)物清除dpph自由基的能力（ic50為0.11mg/ml）明顯高于酸解產(chǎn)物（ic50大于0.4mg/ml），而褐藻膠多糖對(duì)dpph自由基基本沒有清除能力。

4.超氧陰離子自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

由圖16可見，在相同濃度下，褐藻酶解產(chǎn)物具有清除超氧陰離子自由基的能力（ic50為0.26mg/ml），而褐藻膠多糖和酸解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果不明顯。

5.對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活力的抑制作用

由圖17可見，褐藻酶解產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶雙酚酶催化l-多巴具有抑制作用，其ic50為1.8mg/ml，與酸解產(chǎn)物接近（ic50為1.62mg/ml），而褐藻膠多糖沒有明顯的抑制作用。

實(shí)施例4酶解產(chǎn)物的成分分析

將酶解得到的產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜分析，所用展開劑為v正丁醇/v甲酸/v水=4：6：1。由圖18可見，所得酶解產(chǎn)物主要含3種聚合度的褐藻寡糖，分別為dp1、dp2、dp3，其中dp2和dp3為主要產(chǎn)物，dp1為少量存在。

實(shí)施例5酶解產(chǎn)物的分離純化

將酶解產(chǎn)物用bio-gelp-6凝膠柱進(jìn)行分離，以0.2mol/l碳酸氫銨為洗脫液，流速為0.4ml/min，每2.5min收集一管，235nm下檢測吸光值。由圖19結(jié)果表明，各組分分離效果較好，得到3個(gè)主要成分，組分1（峰范圍為430-467.5min）、組分2（峰范圍為392.5-420min）、組分3（峰范圍為362.5-377.5min）。收集各組分濃縮后進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果如圖20。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。