本發(fā)明屬于寡糖制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種均一性褐藻寡糖的制備方法。

背景技術(shù)：

褐藻寡糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種不同的生物學(xué)活性，且寡糖存在分子量小，容易被吸收利用的優(yōu)勢(shì)，因此在藥物制劑、功能食品、化工等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。褐藻寡糖本身沒有細(xì)胞毒性，它通過提高機(jī)體免疫力而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的防御能力。研究表明，褐藻寡糖可以抑制人白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞核形態(tài)學(xué)上的變化表現(xiàn)為典型的細(xì)胞凋亡；褐藻寡糖具有抗氧化作用。研究表明，褐藻膠寡糖對(duì)o^2-，·oh和clo·等自由基均有較好的清除作用，而且清除活性受到褐藻寡糖的濃度及分子量的影響。研究發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖顯示出對(duì)abts，羥基和超氧自由基的清除活性。自由基清除活性主要源于在酶解過程中形成的共軛烯酸結(jié)構(gòu)的存在。褐藻寡糖通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)血糖和脂質(zhì)。由于褐藻寡糖的多種生物學(xué)活性，因此迫切需要建立綠色高效的均一性褐藻寡糖制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種均一性褐藻寡糖的制備方法，從而制備出均一性褐藻寡糖，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的方法，是用氨基酸序列為seqidno:1的褐藻膠酶和氨基酸序列為seqidno:2的褐藻膠酶來降解褐藻膠；

所述的方法，是一種方式是將兩種褐藻膠酶同時(shí)來降解褐藻膠；

所述的方法，其另一種方式是先用氨基酸序列為seqidno:1的褐藻膠來降解褐藻膠，再用氨基酸序列為seqidno:2的褐藻膠酶來降解褐藻膠；

所述的氨基酸序列為seqidno:1的褐藻膠酶，其編碼基因的核苷酸序列為seqidno:3；

所述的氨基酸序列為seqidno:2的褐藻膠酶，其編碼基因的核苷酸序列為seqidno:4。

本發(fā)明的方法基于酶解法制備褐藻寡糖，具有清潔，環(huán)保的優(yōu)勢(shì)此外，由于酶具有特異性，其反應(yīng)的副產(chǎn)物少；更為重要的是本發(fā)明采用的是復(fù)合物酶法，產(chǎn)物更單一(僅有兩種組分)，有利于后續(xù)的均一性寡糖的制備。

附圖說明

圖1：重組酶的分離純化圖，其中l(wèi)ane1.alyb-ou02；lane2.alyd-ou02；

圖2：復(fù)合酶對(duì)褐藻膠的降解圖，其中a:復(fù)合酶；b:依次加入alyb-ou02與alyd-ou02；圖2-a:1：未加酶對(duì)照；2：只加alyb-ou02；3：只加alyd-ou02；4：加alyb-ou02與alyd-ou02復(fù)合酶；圖2-b：1：加入alyb-ou02反應(yīng)2h后；2：加入alyd-ou02反應(yīng)2h；

具體實(shí)施方式

申請(qǐng)人在長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，通過將氨基酸序列為seqidno:1的褐藻膠酶和氨基酸序列為seqidno:2的褐藻膠酶來降解褐藻膠；能有效的克服已有方法制備的寡糖不均一的問題，從而促成了本發(fā)明。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：酶的重組表達(dá)

1、基因組dna的提?。?/p>

將目標(biāo)菌種ou02接種于lb液體培養(yǎng)基，在25℃、150rpm振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7小時(shí)左右，取1.5ml菌液，在4℃、12,000×g離心1min，棄去上清液，再加入菌液重復(fù)離心3次，收集菌體。然后使用基因組dna試劑盒提取dna。(基因組dna試劑盒：tiangenbiotech)提取步驟如下：

1)在菌體中加入200μl緩沖液ga，振蕩使菌體懸浮，加入4μlrnasea(100mg/ml)溶液除rna，渦旋振蕩15s，室溫靜置5min。

2)向管中加入20μlproteinasek溶液，混勻。

3)加入220μl緩沖液gb，振蕩15s，70℃放置10min，溶液應(yīng)變透亮，點(diǎn)動(dòng)離心以去除管內(nèi)壁的水珠。

4)加入220μl無水乙醇，渦旋振蕩15s，此時(shí)應(yīng)該會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，點(diǎn)動(dòng)離心。

5)將上一步所得混合物均加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

6)加入500μl緩沖液gd(已加入無水乙醇)，12,000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

7)加入700μl漂洗液pw(已加入無水乙醇)，12,000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

8)加入500μl漂洗液pw(已加入無水乙醇)，12,000×g離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。

9)12,000g離心2min，倒掉廢液。室溫靜置數(shù)分鐘，晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5min，12,000×g離心2min，收到的液體即為提取的細(xì)菌基因組dna，將管內(nèi)溶液重復(fù)洗脫吸附膜，可提高回收率，將提取的細(xì)菌基因組dna于-20℃保存。

2、從產(chǎn)高活性褐藻膠裂解酶的微生物的基因組中，克隆褐藻膠裂解酶基因alyb-ou02和alyd-ou02，設(shè)計(jì)引物如下：

alyb-ou02-bamhi-f:cgggatccgacttccctaacaacaaagaaacg

alyb-ou02-xhoi-r:ccgctcgagctactttttgtattgatcgtgcg

alyd-ou02-bamhi-f:cgggatccaataacggtgtgtcttatccag

alyd-ou02-xhoi-r:cgctcgagctacttgccgttcagcttaagtg

3、進(jìn)行目的基因alyb-ou02和alyd-ou02的pcr擴(kuò)增：

以菌株的總基因組dna為模版，pcr反應(yīng)體系如下：5×primestarbuffer10μl，2.5mmdntpmixture4μl，10μm正反向引物各1μl，primestarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，dna模版1μl，滅菌超純水補(bǔ)足50μl。

pcr條件如下：預(yù)變性94℃3min；變性94℃30s；退火50℃30s；延伸72℃2min，5個(gè)循環(huán)；變性94℃30s；退火58℃30s；延伸72℃2min，30個(gè)循環(huán)；延伸72℃10min。產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，電壓90v，25min，alyb-ou02和alyd-ou02分別在1500bp、975bp左右出現(xiàn)目的條帶，并用購自omegabio-tek的gelextractionkit切膠回收pcr產(chǎn)物。膠回收步驟如下：

1)用干凈的刀片切下含有目的條帶的膠，盡量切除多余的膠。

2)將切下的膠放入滅菌的1.5ml離心管中，并稱重。按膠濃度1g/ml，加入等體積的溶膠液(xp2)，即0.3g的膠加0.3ml溶膠液。

3)50-60℃孵育7min直到膠完全溶解，每2-3min振蕩離心管加速溶膠。

4)把hibinddnamini吸附柱放入2ml收集管中。

5)第3步得到的dna/瓊脂糖溶液，取不超過700μl加入吸附柱。

6)室溫10,000×g離心1min，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

7)重復(fù)5-6步驟，直到所有的溶膠液轉(zhuǎn)入吸附柱。

8)加入300μlxp2，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

9)加入700μlspw漂洗液(加入無水乙醇)，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

10)重復(fù)步驟9。

11)空吸附柱，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心2min，干燥吸附柱基質(zhì)。

12)把吸附柱放入1.5ml滅菌的離心管中，取15-30μl洗脫緩沖液懸空滴加到吸附柱膜的中心。

13)室溫靜置2min，最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，重復(fù)洗脫提高dna回收率。

14)將回收的pcr產(chǎn)物再次進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存于-20℃。

4、酶切質(zhì)粒與模板：

將表達(dá)質(zhì)粒pgex6p-1與pcr回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ、ecorⅰ分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系為：dna模板20μl，10×kbuffer6μl，bamhⅰ、ecorⅰ各3μl，滅菌超純水補(bǔ)足60μl，30℃酶切5h。并用購自omegabio-tek的cycle-purekit回收酶切產(chǎn)物。純化步驟如下：

1)在酶切反應(yīng)體系中加入4-5倍體積的cp緩沖液，渦旋振蕩使溶液充分混勻，簡(jiǎn)短離心以收集管蓋和管壁上的水珠。

2)把hibinddnamini吸附柱放入2ml收集管中。

3)把第一步的溶液加入吸附柱，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，取收集管中的液體加入吸附柱中，重復(fù)吸附，提高產(chǎn)物回收率，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

4)加入700μldna漂洗液(加入無水乙醇)，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。

5)重復(fù)步驟4。

6)空吸附柱，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心2min，干燥吸附柱基質(zhì)。

7)把吸附柱放入滅菌的1.5ml離心管中，取30-50μl洗脫緩沖液懸空滴加到吸附柱膜的中心。

8)室溫靜置2min，室溫最大轉(zhuǎn)速(≥13,000×g)離心1min，重復(fù)洗脫提高dna回收率。

14)將回收的酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存于-20℃。

5、目的基因與表達(dá)載體連接：

酶切后的質(zhì)粒(pgex6p-1)與目的基因片段(alyb-ou02、alyd-ou02)在t4dna連接酶作用下過夜連接，連接體系為：t4dna連接酶1μl，10×buffer1μl，目的基因片段與質(zhì)粒按質(zhì)量比10:1，滅菌超純水補(bǔ)足10μl，16℃連接過夜。

6、轉(zhuǎn)化：

將感受態(tài)細(xì)胞bl21(de3)從-80℃冰箱中取出，迅速放入冰中。待細(xì)胞完全融化后，在無菌條件下將連接產(chǎn)物緩慢加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。迅速放置42℃水浴熱激75s。快速將離心管放入冰中，冰浴2min。無菌條件下向混合液中加入500μllb液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使菌體復(fù)蘇。無菌條件下，取200μl菌液均勻地涂布于含amp+抗性的lb固體培養(yǎng)基上，待液體完全吸收后倒置放入恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基表面有菌落生成。

7、菌液pcr鑒定陽性克隆

隨機(jī)挑取單克隆菌落，測(cè)序分析，并于-80℃保存菌液。其中褐藻膠酶alyb-ou02，其氨基酸序列為seqidno:1,編碼核苷酸序列為seeidno:3。酶alyd-ou02，其氨基酸序列為seqidno:2,編碼核苷酸序列為seeidno:4。具體序列信息如下：

其中alyb-ou02的氨基酸序列如下：

dfpnnketgealltpvdatasshdgngpdrlidqdlttrwssagdgewamldygsvqefdavqasfskgnerqskfdiqvsvdgetwttvlenqlssgkaiglerfqfepavkaryvryvghgntkngwnsvtglaavncsinacpasqiitsdvvaaeavliaemkaaekarkaarkdlrsgnfgvaavypcetsvkcdtrsalpvptglpatpvagnapsenfdmthwylsqpfdhdkngkpddvsewnlangyqhpeifytaddgglvfksyvkgvrtskntkyartelremmrrgdqsistkgvnknnwvfssapeadleaaagidgvleatlkidhatttgnanevgrfiigqihdqndepirlyyrklpnqptgavyfahesqdatkedfyplvgdmtaevgedgialgevfsyridvkgntmtvtlmregkddvvqvvdmsnsgydvggkymyfkagvynqnisgdlddysqatfyqldvshdqykk；

其編碼基因的核苷酸序列如下：

gacttccctaacaacaaagaaacgggtgaagcacttcttactccggttgatgctaccgctagcagccacgatggaaatggcccagatcgcctcattgaccaagacctaacaacacgttggtcgtcagcgggtgacggtgagtgggcaatgctagattatggttcagtacaagagtttgacgctgttcaagcatccttcagtaaaggtaatgagcgccaatctaaatttgatattcaagtgagtgtcgatggtgaaacctggacgacggtacttgagaaccaactcagttctggtaaagctatcggcctagagcgtttccaatttgagcctgcggtgaaagcacgttacgtaagatatgttggtcacggcaacaccaaaaacggttggaacagtgtgactgggttagcagcggttaactgtagcatcaacgcttgtccagcgagtcaaatcatcacttcagacgtggtggctgcagaagcggtgcttattgctgaaatgaaagcagcggaaaaagcgcgtaaagcagcacgcaaagatctacgctcaggtaacttcggcgtagcagcagtttacccttgtgagacttcagttaaatgtgacactcgcagcgcgctacctgttccgacaggcctaccagcgacacccgttgccggtaatgcaccgagcgaaaacttcgacatgactcactggtacctgtctcaaccattcgaccatgacaaaaacggtaagccagatgatgtatccgagtggaaccttgcaaacgggtatcaacacccagaaatcttctataccgcggacgacggtggtctagtgttcaagtcttacgtgaaaggtgtacgtacatctaaaaacactaagtacgcgcgtaccgagcttcgtgagatgatgcgtcgtggtgaccagtctatcagtacgaaaggtgttaataagaacaactgggtattctcaagcgcacctgaagctgatttagaagctgcggctggtatcgatggcgttctagaagcaacattgaaaatcgatcatgcgacaacaacgggtaatgcgaatgaagtaggtcgctttatcattggtcagattcacgatcaaaacgatgagccgattcgtttgtactaccgtaaactgccaaaccaaccaacgggcgcagtttactttgcacacgaaagccaagacgcgaccaaagaggacttctatcctctagtgggagacatgacggctgaagtaggtgaagatggtatcgcacttggtgaagtgttcagctaccgtattgacgttaaaggcaacacgatgacggtaacgctaatgcgtgaaggcaaagacgatgttgtacaagtggttgatatgagcaacagcggctatgacgttggcggcaagtacatgtatttcaaagcgggtgtttacaaccaaaatatcagcggcgacctagacgattactcacaagctactttctaccagctagacgtatcgcacgatcaatacaaaaagtag；

alyd-ou02酶的氨基酸序列如下：

pvpadkfdmrnwkitipsdinedgrvdeiegvammsyshsdffhldkdgnlvfevqnqaittknsknarselrqmprgadfsidtadkgnqwalsshpaaseysavggtleatlkvnhvsinakypqrypahsvvvgqihakkhdalikaktgyghgneplkifykkfpdqemgsvfwnyernlekkdpnradiaypvwgntwenpaepgeagialgeefsykvevkgtmmyltfetarhdtvkyevdlskgideldsptgyaeddfyykagaygqcsvsdshpvwgpgcagtgdfavdkkngdynsvtfsalklngk；

編碼基因的核苷酸序列如下：

ccagttcccgctgataagtttgatatgcgaaattggaaaataacgatcccttcagatattaatgaagatggacgtgttgacgaaatcgaaggggtggcaatgatgagctactcacacagcgatttcttccaccttgataaagacggtaatctcgtctttgaagtacaaaaccaagcgattaccacgaagaactcgaaaaacgcacgctctgagttacgccagatgccacgaggtgctgatttctcaatcgatacggcggacaaaggaaaccagtgggcactatcgagccacccagcagcgagtgaatacagtgcggttggtggaacgctagaagcgacgctaaaggtgaatcacgtttcgattaacgctaagtacccacaaagatacccagctcactcggtagttgttggccagatacacgcgaagaaacacgatgctttgatcaaagcaaaaacaggttacggccacggtaacgaaccactaaaaatcttctataagaaatttcctgatcaagagatgggttcagtcttttggaactatgaacgcaacttagagaagaaagatcctaaccgtgctgatattgcttacccagtttggggcaatacttgggaaaacccagcagagcctggtgaagcgggaattgctctaggtgaagagttcagctacaaagtggaagtgaagggtacaatgatgtatctaacatttgaaacggctcgccacgataccgttaagtatgaagtcgacttgagcaagggcatcgatgaacttgattcgccaacaggctatgcggaagatgacttttactataaagcgggtgcgtacggtcaatgcagtgtaagcgactctcacccagtgtggggcccgggttgtgcgggtactggcgatttcgctgtcgataaaaagaacggcgattacaatagtgtgactttctcagcacttaagctgaacggcaagtag。

二、重組酶的制備

1)pgex-6p-1菌體，60mlpbs重懸菌體并超聲破碎(30min)，20,000g離心20min。

2)上清與2ml平衡后的gstbeads(ge)在4℃結(jié)合2h，重力作用下流出；

3)400mlpbs緩沖液沖洗未結(jié)合蛋白；

4)加入2ml的pbs緩沖液，并按質(zhì)量比50:1加入prescission酶，4℃靜置酶切(每15min輕吹混勻一次)。

5)酶切2h后流出，流出進(jìn)行sds-page檢測(cè)(圖1)：

實(shí)施例2：基于復(fù)合酶的高均一性褐藻寡糖的制備

方法1)復(fù)合酶法：用重組表達(dá)的alyb-ou02和alyd-ou02褐藻膠裂解酶進(jìn)行褐藻膠降解，底物為0.2％褐藻膠(m/v)200μl，酶alyb-ou02(1.58μm)和alyd-ou02(約13.9μm)各20μl。

設(shè)置三組反應(yīng)，即：alyb-ou02、alyd-ou02分別單獨(dú)降解褐藻膠以及alyb-ou02和alyd-ou02相互配合共同降解褐藻膠?？偡磻?yīng)體系為220μl，緩沖液為50mmtris-hcl200mmnaclph7.5，室溫(約30℃)靜置反應(yīng)90min，反應(yīng)結(jié)束后12000rpm離心3min，取上清通過tlc法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

方法2)先后加入法：用重組表達(dá)的alyb-ou02和alyd-ou02褐藻膠裂解酶進(jìn)行褐藻膠降解，底物為0.2％褐藻膠(m/v)200μl，酶alyb-ou02(1.58μm)和alyd-ou02(約13.9μm)各20μl。設(shè)置一組反應(yīng)，即先用alyb-ou02降解褐藻膠，緩沖液為50mmtris-hcl200mmnaclph7.5，室溫(約30℃)靜置反應(yīng)90min，之后加入alyd-ou02繼續(xù)反應(yīng)90min。反應(yīng)結(jié)束后，12000rpm離心3min，取上清通過tlc法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

分別取2μl降解后的溶液和對(duì)照組溶液點(diǎn)樣于硅膠板上(silicagel60f254，merck)。吹干后將硅膠板置于展開劑中開始層析，展開劑按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。層析結(jié)束后，取出硅膠板并吹干，在硅膠板上噴灑顯色劑(苯胺-二苯胺顯色劑)，吹干，再將硅膠板置于高溫條件下顯色，直至出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)。(圖2)。如圖2-a泳道2及圖2-b泳道1所示，僅用酶alyb-ou02降解褐藻膠，產(chǎn)物主要有4個(gè)組份。alyb-ou02降解后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，確定樣品的分子量。儀器型號(hào)為qexactivefocus。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，alyb-ou02降解后的樣品(圖2-a，泳道1)主要為：dp1:175da；dp2:351da；dp3:527da；dp4:703da。

在利用復(fù)合酶alyd-ou02或者在alyb-ou02降解后，通過后續(xù)補(bǔ)加alyd-ou02，產(chǎn)物如圖2-a泳道4及圖2-b泳道2所示，結(jié)果表明復(fù)合酶解可以有效降解其中兩個(gè)組分(后續(xù)質(zhì)譜鑒定為dp3和dp4),降解后產(chǎn)物主要為dp1與dp2。結(jié)果說明alyd-ou02的加入提高了產(chǎn)物的均一性。

酶解產(chǎn)物的回收的步驟如下：

反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于100℃，水浴10min，滅活酶終止反應(yīng)。4℃，12000g離心20min，收集上清，冷凍干燥獲得寡糖。稱重計(jì)算得到的寡糖的回收率在85％左右。

sequencelisting

<110>中國海洋大學(xué)

<120>一種均一性褐藻寡糖的制備方法

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>494

<212>prt

<213>1

<400>1

asppheproasnasnlysgluthrglyglualaleuleuthrproval

151015

aspalathralaserserhisaspglyasnglyproaspargleuile

202530

aspglnaspleuthrthrargtrpserseralaglyaspglyglutrp

354045

alametleuasptyrglyservalglnglupheaspalavalglnala

505560

serpheserlysglyasngluargglnserlyspheaspileglnval

65707580

servalaspglygluthrtrpthrthrvalleugluasnglnleuser

859095

serglylysalaileglyleugluargpheglnphegluproalaval

100105110

lysalaargtyrvalargtyrvalglyhisglyasnthrlysasngly

115120125

trpasnservalthrglyleualaalavalasncysserileasnala

130135140

cysproalaserglnileilethrseraspvalvalalaalagluala

145150155160

valleuilealaglumetlysalaalaglulysalaarglysalaala

165170175

arglysaspleuargserglyasnpheglyvalalaalavaltyrpro

180185190

cysgluthrservallyscysaspthrargseralaleuprovalpro

195200205

thrglyleuproalathrprovalalaglyasnalaprosergluasn

210215220

pheaspmetthrhistrptyrleuserglnpropheasphisasplys

225230235240

asnglylysproaspaspvalserglutrpasnleualaasnglytyr

245250255

glnhisprogluilephetyrthralaaspaspglyglyleuvalphe

260265270

lyssertyrvallysglyvalargthrserlysasnthrlystyrala

275280285

argthrgluleuargglumetmetargargglyaspglnserileser

290295300

thrlysglyvalasnlysasnasntrpvalpheserseralaproglu

305310315320

alaaspleuglualaalaalaglyileaspglyvalleuglualathr

325330335

leulysileasphisalathrthrthrglyasnalaasngluvalgly

340345350

argpheileileglyglnilehisaspglnasnaspgluproilearg

355360365

leutyrtyrarglysleuproasnglnprothrglyalavaltyrphe

370375380

alahisgluserglnaspalathrlysgluaspphetyrproleuval

385390395400

glyaspmetthralagluvalglygluaspglyilealaleuglyglu

405410415

valphesertyrargileaspvallysglyasnthrmetthrvalthr

420425430

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