本發(fā)明屬于乳酸菌胞外多糖領(lǐng)域，具體涉及一種植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌胞外多糖(exopolysaccharides，eps)是一類微生物利用培養(yǎng)基中的碳源經(jīng)過一系列磷酸化、脂質(zhì)化、連接、聚合及運(yùn)輸?shù)桨饧纯筛街诩?xì)胞壁上亦可直接滲入到培養(yǎng)中，由寡糖經(jīng)脂質(zhì)載體聚合而成的大分子多糖，其中由一種寡糖形成的多糖為同型多糖，否則為異型多糖，經(jīng)過提取純化并凍干后的多糖呈白色。胞外多糖的生理生化功能主要體現(xiàn)在食品加工中，比如可以作為穩(wěn)定的增稠劑、乳化劑、脫水收縮劑，相對化學(xué)添加劑而言，胞外多糖的天然無毒性將更有市場價值。不同的乳酸菌所產(chǎn)生的eps結(jié)構(gòu)不同，即寡糖組成和比例不同，同時，同種菌株在不同的碳源存在條件下也將生成不同結(jié)構(gòu)的eps。因此可選擇合適的碳源、發(fā)酵條件、菌株等來獲得高產(chǎn)eps菌株。此外，胞外多糖在聚合運(yùn)輸?shù)桨夂螅勺鳛槲锢肀Ｗo(hù)屏障起到保護(hù)菌體免受外界毒害、抵御外界不良信息的作用，還可協(xié)助細(xì)胞與細(xì)胞間的識別、便于在特殊環(huán)境中附著在固體表面，比如在營養(yǎng)相對較缺乏的環(huán)境中，固定在營養(yǎng)較豐富的表面上，待營養(yǎng)物耗盡便從表面解離。eps作為次級代謝物可保護(hù)細(xì)菌免受干燥、捕食，并具有一定耐毒性。細(xì)菌eps的大量分泌使得液體培養(yǎng)基變粘稠，可作為良好的增稠劑、乳化劑。除此之外，乳酸菌eps對人體的免疫系統(tǒng)也有一定調(diào)節(jié)作用，如增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，這為食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)帶來研究價值。膳食纖維的攝入可以降低代謝綜合征的生理危險因素，例如高血脂和低度炎癥狀態(tài)。膳食纖維通常是來源于植物，然而微生物胞外多糖(eps)具有可潛在地發(fā)揮類似生理效應(yīng)的結(jié)構(gòu)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明eps可抑制血壓升高，降低血清膽固醇總水平，降低動物體內(nèi)血糖水平，并能夠在動物腸粘膜中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)調(diào)節(jié)免疫能力，這表明可以使用微生物eps來控制代謝綜合征中發(fā)生的異常，并且eps的研究可為降脂藥物或保健品的開發(fā)提供理論指導(dǎo)。然而目前微生物胞外多糖的產(chǎn)量依然較低，想要投入大規(guī)模的生產(chǎn)還需要進(jìn)一步的提高菌種生產(chǎn)能力，并且eps結(jié)構(gòu)和特性隨菌株和發(fā)酵條件的改變而不同，比如碳源、發(fā)酵時間和培養(yǎng)基組成的差異，eps產(chǎn)量和性能也將有所不同。進(jìn)一步提高微生物eps產(chǎn)量，并開拓其生理生化特性，將是胞外多糖研究領(lǐng)域的突破點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的方法。目前在乳酸菌產(chǎn)eps的研究領(lǐng)域中主要集中在eps的提取純化及其結(jié)構(gòu)鑒定方面，本發(fā)明提供一種經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)后的植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件，以及所提取的eps具有高效降膽固醇的功能，開拓了eps降低膽固醇的潛力。利用本發(fā)明中的植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件后，eps具有很明顯的降膽固醇能力的提升。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的植物乳桿菌胞外多糖。本發(fā)明的再一目的在于提供上述植物乳桿菌胞外多糖的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的方法，包括如下步驟：(1)植物乳桿菌la-10(lactobacillusplantarum，以下簡稱la-10)在改良mrs液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，其接種量為3％～5％(v/v)，得菌體發(fā)酵液；所述的靜置發(fā)酵的條件為25℃～31℃靜置發(fā)酵30h～40h；所述的改良mrs液體培養(yǎng)基：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30～40g/l、k2hpo4為2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o為0.58g/l、mnso4·4h2o為0.25g/l、吐溫-80為1.0ml/l，ph6.2～6.4，滅菌，備用；(2)將步驟(1)得到的菌體發(fā)酵液離心，取上清液；加入三氯乙酸(tca)除蛋白，4℃條件下靜置，離心取上清液；95％乙醇沉淀多糖，離心棄上清液，沉淀透析后得到粗多糖，測定提取量并凍干成粉末狀，即植物乳桿菌胞外多糖。步驟(1)中所述的接種量優(yōu)選為4～5％；最優(yōu)選為4％；步驟(1)中所述的靜置發(fā)酵的條件優(yōu)選為30～31℃靜置發(fā)酵30～35h；最優(yōu)選為30℃靜置發(fā)酵30h。步驟(1)中所述的改良mrs液體培養(yǎng)基優(yōu)選為：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30～34g/l、k2hpo4為2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o為0.58g/l、mnso4·4h2o為0.25g/l、吐溫-80為1.0ml/l，ph6.2～6.4，滅菌，備用；最優(yōu)選的，步驟(1)中所述的改良mrs液體培養(yǎng)基為：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2hpo4為2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o為0.58g/l、mnso4·4h2o為0.25g/l、吐溫-80為1.0ml/l，ph6.2～6.4，滅菌，備用；所述的滅菌優(yōu)選為121℃滅菌30分鐘。步驟(2)中所述的離心的條件均優(yōu)選為4℃、8000r/min離心15min。步驟(2)中所述的透析所用的透析袋的孔徑大小為3500da。步驟(2)中所述的測定提取量為2.67～3.18g/l。一種植物乳桿菌胞外多糖，通過上述制備方法制備得到。所述的植物乳桿菌胞外多糖在制備降脂藥物或保健品中的應(yīng)用。將植物乳桿菌胞外多糖加入至1g/l的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液中，其中，植物乳桿菌胞外多糖的終濃度為0.8～1.6g/l，于恒溫條件下30～37℃振蕩吸附15～25h，實(shí)現(xiàn)膽固醇的高效吸附。優(yōu)選的，所述的植物乳桿菌胞外多糖的終濃度為0.8g/l。優(yōu)選的，所述的振蕩吸附的條件為于恒溫條件下30℃振蕩吸附15h。本發(fā)明所使用的菌株是廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心篩選得到的具有一定降膽固醇能力的植物乳桿菌la-10(lactobacillusplantarum，以下簡稱la-10)，目前保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心。菌株la-10在改良mrs液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，在接種量分別為2％、3％、4％、5％、6％時，接種量為4％的菌體發(fā)酵液經(jīng)過提取純化并使用苯酚-硫酸法檢測的eps提取量最高(圖1)。菌株la-10分別在蔗糖含量為5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l的改良mrs液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖含量為30g/l時的菌體發(fā)酵液經(jīng)過提取純化并使用苯酚-硫酸法檢測的eps提取量最高(圖2)。菌株la-10在改良mrs液體培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，其發(fā)酵溫度分別為20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，菌體發(fā)酵液經(jīng)過提取純化并使用苯酚-硫酸法檢測的eps提取量最高(圖3)。菌株la-10在改良mrs液體培養(yǎng)基中分別靜置發(fā)酵15h、25h、30h、35h、40h，其中30h的菌體發(fā)酵液經(jīng)過提取純化并使用苯酚-硫酸法檢測的eps提取量最高(圖4)。上述菌株胞外多糖發(fā)酵的改良mrs液體培養(yǎng)基組成為：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2hpo42.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o0.58g/l、mnso4·4h2o0.25g/l、吐溫-801.0ml/l，ph6.2～6.4，121℃滅菌30分鐘后使用。上述植物乳桿菌eps提取方法：菌體發(fā)酵液經(jīng)4℃、8000r/min離心15min，取上清液并棄去菌體沉淀；上清液加入三氯乙酸(tca)至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％，4℃條件下靜置過夜，以去除蛋白；4℃、8000r/min離心15min取上清液；上清液中加入3倍體積的95％乙醇，于4℃條件下靜置過夜，沉淀粗多糖；4℃、8000r/min離心15min，棄上清，將沉淀溶于滅菌的ddh2o中；經(jīng)三級水透析(透析袋孔徑大小為3500da)16h，其間每8h換水一次，再用超純水透析8h，其間每4h換水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀釋數(shù)倍，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用苯酚-硫酸法測定eps含量；加入3倍體積的95％乙醇沉淀剩余eps，凍干收集多糖粉末。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分別置于50ml容量瓶中，加水定容，搖勻；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取樣器混勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作線性回歸方程，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。上述la-10的eps定量方法(苯酚-硫酸法)：將待測溶液稀釋數(shù)倍后，并吸取2ml于50ml離心管中，量取3份；分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，搖勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。除此之外，本發(fā)明中的la-10所產(chǎn)的eps具有高效降膽固醇的功能，經(jīng)過體外優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，可達(dá)到40％的膽固醇清除率，優(yōu)化前和優(yōu)化后的eps降膽固醇能力差異見圖6。上述優(yōu)化前的原始mrs液體培養(yǎng)基：細(xì)菌學(xué)蛋白胨10.0g/l，牛肉膏10.0g/l，酵母粉5g/l，磷酸氫二鉀2.0g/l，檸檬酸氫二銨2.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐溫-801.0ml/l，乙酸鈉5.0g/l，硫酸鎂0.58g/l，硫酸錳0.25g/l、ph6.5。la-10分別以最適發(fā)酵條件在原始mrs液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，其發(fā)酵液經(jīng)過提取純化后得到的eps降膽固醇率為17.12％±2.9％，在改良mrs液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，其發(fā)酵液經(jīng)過提取純化后得到的eps降膽固醇率為40.60％±3.2％。la-10在本發(fā)明中的最適碳源含量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量以及培養(yǎng)基組成的發(fā)酵條件下經(jīng)過提取純化后的eps不僅產(chǎn)量得到了提高，其降膽固醇性能亦有所提高。分別準(zhǔn)確稱取從la-10的發(fā)酵液中提取得到的胞外多糖粉末(0.1g/l、0.4g/l、0.8g/l、1.2g/l、1.6g/l)置于50ml離心管中，加入10ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)，以不加入胞外多糖為對照。于恒溫條件下37℃振蕩吸附12h，10000rpm離心6分鐘，取上清液，鄰苯二甲醛法測上清液膽固醇含量，其最佳eps質(zhì)量濃度為0.8g/l，膽固醇吸附率高達(dá)43.79％±1.36％(圖7)。分別準(zhǔn)確稱取相應(yīng)適量的從la-10的發(fā)酵液中提取得到的胞外多糖粉末置于50ml離心管中，加入10ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，以不加入胞外多糖為對照。于恒溫條件下37℃振蕩吸附一定的時間(5h、10h、15h、20h、25h)，10000rpm離心6分鐘，取上清液，鄰苯二甲醛法測上清液膽固醇含量，并利用上述公式計算出la-10胞外多糖的膽固醇吸附率，其最佳吸附時間為15h，膽固醇吸附率是43.85％±1.32％(圖8)。分別準(zhǔn)確稱取相應(yīng)適量的從la-10的發(fā)酵液中提取得到的胞外多糖粉末置于50ml離心管中，加入10ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液，以不加入胞外多糖為對照。于恒溫條件下(15℃、25℃、30℃、37℃、42℃)振蕩吸附數(shù)小時，12000rpm離心2分鐘，取上清液，鄰苯二甲醛法測上清液膽固醇含量，并利用上述公式計算出la-10胞外多糖的膽固醇吸附率。最佳吸附溫度為30℃，其膽固醇清除率為33.78％±0.4％(圖9)。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，見圖10。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣體系配置混合體系時，濃硫酸緩慢加入，并用取樣器充分混勻，室溫靜置10min，分光光度計測od550。上述上清液中膽固醇定量方法(領(lǐng)苯二甲醛法)：將待測溶液稀釋數(shù)倍后，并吸取400μl于15ml離心管中，量取3份；分別加入領(lǐng)苯二甲醛試劑2ml，95％的硫酸溶液1ml，用取樣器混合均勻；室溫靜置10min；分光光度計測定吸光值od550；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算膽固醇含量，并根據(jù)公式計算出膽固醇清除率。除此之外，本發(fā)明中的植物乳桿菌la-10胞外多糖降膽固醇功能還體現(xiàn)在：根據(jù)上述高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵方法，吸取能提取出10mg胞外多糖的菌體發(fā)酵液約3.4ml，熱水煮沸15分鐘以滅活菌體，離心取已滅活菌體于滅菌離心管中，另取3.4ml渾濁發(fā)酵液于滅菌離心管中并熱水煮沸15分鐘以滅活菌體，再取另一干凈離心管中加入10mgeps固體粉末，分別加入10ml含有1％膽固醇溶解液(10mg/ml)的改良mrs液體培養(yǎng)基，30℃靜置12h，進(jìn)行降膽固醇能力比較，分別以不加菌體和加入3.4ml新鮮配置的改良mrs液體培養(yǎng)基為對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出膽固醇含量，并參照上述公式分別計算出eps、滅活菌體與菌液的降膽固醇率。上述菌液中膽固醇含量測定方法：10000rpm，6min離心取上清樣液0.5ml，加入無水乙醇3.0ml；加入50％koh2.0ml，振蕩器混合均勻；60℃水浴15min；冷卻后加入正己烷5.0ml，混合均勻，加入一級水3.0ml，混合均勻，室溫靜置15min；待溶液分層，取正己烷層(最上層)溶液400μl沸水浴蒸干；加入領(lǐng)苯二甲醛溶液2.0ml，95％的硫酸溶液1.0ml，用取樣器混合均勻；室溫靜置10min，分光光度計測定吸光值(od550)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算膽固醇含量，比較菌體、eps與菌液的降膽固醇能力。結(jié)果表明：eps降膽固醇率高達(dá)59％，熱滅活的菌體和發(fā)酵菌液降膽固醇率分別是6.45％、9.99％(圖11)。熱滅活的菌體和發(fā)酵菌液對培養(yǎng)基中的膽固醇都有一定的清除作用，發(fā)酵菌液相比滅活菌體吸附率較高，說明菌液中的化學(xué)物質(zhì)或菌體分泌的代謝產(chǎn)物有降膽固醇能力，比如某些有機(jī)酸、膠狀胞外多糖等，植物乳桿菌eps分泌到胞外呈粘液狀或膠狀，其凍干粉末狀見圖12。本發(fā)明不僅提供了一種植物乳桿菌高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件和提取純化方法，還通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取獲得的eps具有高效的膽固醇清除功能，為現(xiàn)代降脂藥物和保健品的開發(fā)提供新思路。本發(fā)明進(jìn)一步研究了eps不同狀態(tài)的降膽固醇功能，為eps開拓不同的市場應(yīng)用提供指導(dǎo)。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明所使用的菌株具有高效產(chǎn)胞外多糖的特點(diǎn)，并且該菌株在本發(fā)明中的發(fā)酵條件下所產(chǎn)生的eps具有高效降膽固醇的功能，具體體現(xiàn)在：1)通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得菌株最佳產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件，其產(chǎn)量可高達(dá)2.67～3.18g/l；2)通過優(yōu)化前與優(yōu)化后的eps降膽固醇能力比較，eps降膽固醇能力得到了明顯提升；3)通過單因素體外定性實(shí)驗(yàn)，其eps具有高效的膽固醇清除能力，最高可達(dá)59％；4)通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分泌到胞外的未經(jīng)過提取純化的eps依然具有一定的膽固醇清除能力。使用本發(fā)明中的發(fā)酵條件和制備方法可提高微生物eps產(chǎn)量，并且獲得的eps有高效降膽固醇能力，具有廣闊的降脂藥物和保健品的開發(fā)應(yīng)用。附圖說明圖1是植物乳桿菌la-10高產(chǎn)eps最適接種量測定結(jié)果。圖2是植物乳桿菌la-10高產(chǎn)eps最適蔗糖含量測定結(jié)果。圖3是植物乳桿菌la-10高產(chǎn)eps最適發(fā)酵溫度測定結(jié)果。圖4是植物乳桿菌la-10高產(chǎn)eps最適發(fā)酵時間測定結(jié)果。圖5是葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6是發(fā)酵優(yōu)化前和優(yōu)化后的eps降膽固醇能力差異。圖7是eps降膽固醇最適質(zhì)量濃度測定結(jié)果。圖8是eps降膽固醇最適吸附時間測定結(jié)果。圖9是eps降膽固醇最適吸附溫度測定結(jié)果。圖10是膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖11是菌液、滅活菌體及eps降膽固醇能力比較測定結(jié)果。圖12是植物乳桿菌la-10提取純化凍干后的eps固體粉末。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1植物乳桿菌la-10胞外多糖的發(fā)酵及提取純化植物乳桿菌la-10按4％體積分?jǐn)?shù)的接種量接種于改良mrs液體培養(yǎng)基中，30℃的發(fā)酵溫度，靜置培養(yǎng)30小時，其中改良mrs液體培養(yǎng)基中的蔗糖含量為30g/l。表2各單因素的最高提取量單因素eps(g/l)接種量3.1756±0.02b蔗糖含量2.8255±0.03a發(fā)酵溫度2.9417±0.09a發(fā)酵時間2.6694±0.001a改良mrs液體培養(yǎng)基組成：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖30g/l、k2po4為2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o為0.58g/l、mnso4·4h2o為0.25g/l、吐溫-80為1.0ml/l，ph6.2～6.4。eps提取方法為：(1)4℃、8000r/min離心15min，取上清液并棄去菌體沉淀。(2)上清液加入三氯乙酸(tca)至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％，4℃條件下靜置過夜，以去除蛋白。(3)4℃、8000r/min離心15min取上清液。(4)上清液中加入3倍體積的95％乙醇，于4℃條件下靜置過夜，沉淀粗多糖。(5)4℃、8000r/min離心15min，棄上清，將沉淀溶于滅菌的ddh2o中。(6)經(jīng)三級水透析(透析袋孔徑大小為3500da)16h，其間每8h換水一次，再用超純水透析8h，其間每4h換水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀釋數(shù)倍，苯酚-硫酸法測定eps含量為2.664g/l。(7)加入3倍體積的95％乙醇溶液，于4℃條件下靜置過夜，收集多糖并凍干。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分別置于50ml容量瓶中，加水定容，搖勻；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取樣器混勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作線性回歸方程，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。苯酚-硫酸法：吸取上清液300μl，稀釋30倍后，并吸取2ml于50ml離心管中，量取3份；分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，搖勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。實(shí)施例2植物乳桿菌la-10胞外多糖的降膽固醇定性方法收集接種量為4％、蔗糖含量為30g/l、發(fā)酵時間為30h、發(fā)酵溫度為30℃時，la-10在改良mrs液體培養(yǎng)基中經(jīng)過靜置培養(yǎng)后提取純化并凍干的eps粉末。稱取eps固體粉末0.8g/l于15ml干凈離心管中，并加入10ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)，以不加入胞外多糖為對照。于恒溫條件下30℃振蕩吸附15h，10000rpm離心6分鐘，取上清液，鄰苯二甲醛法測上清液膽固醇含量，并利用上述公式計算出la-10胞外多糖的膽固醇吸附率為41.45％±1.3％。領(lǐng)苯二甲醛法：吸取500μl上清液，將待測溶液稀釋5倍后，并吸取400μl于15ml離心管中，量取3份；分別加入領(lǐng)苯二甲醛試劑2ml，95％的硫酸溶液1ml，用取樣器混合均勻；室溫靜置10min；分光光度計測定吸光值od550；根據(jù)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計算膽固醇含量，并根據(jù)公式計算出膽固醇清除率。膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，見表1和圖10。實(shí)施例3植物乳桿菌la-10液體靜置發(fā)酵產(chǎn)eps植物乳桿菌la-10按5％體積分?jǐn)?shù)的接種量接種于改良mrs液體培養(yǎng)基中，31℃的發(fā)酵溫度，靜置培養(yǎng)35小時，其中改良mrs液體培養(yǎng)基中的蔗糖含量為34g/l。mrs液體培養(yǎng)基組成：大豆蛋白胨10.0g/l、牛肉膏10.0g/l、酵母膏5.0g/l、蔗糖34g/l、k2po4為2.0g/l、乙酸鈉5.0g/l、檸檬酸三銨2.0g/l、mgso4·7h2o為0.58g/l、mnso4·4h2o為0.25g/l、吐溫-80為1.0ml/l，ph6.2～6.4。eps提取方法為：(1)4℃、8000r/min離心15min，取上清液并棄去菌體沉淀。(2)上清液加入三氯乙酸(tca)至終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％，4℃條件下靜置過夜，以去除蛋白。(3)4℃、8000r/min離心10min取上清液。(4)上清液中加入4倍體積的95％乙醇，于4℃條件下靜置過夜，沉淀粗多糖。(5)4℃、8000r/min離心10min，棄上清，將沉淀溶于滅菌的ddh2o中。(6)經(jīng)三級水透析(透析袋孔徑大小為3500da)16h，其間每8h換水一次，再用超純水透析8h，其間每4h換水一次，收集透析后的多糖溶液，吸取少量稀釋數(shù)倍，苯酚-硫酸法測定eps含量為2.955±0.039g/l。(7)加入3倍體積的95％乙醇溶液，于4℃條件下靜置過夜，收集多糖并凍干。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液(0.6mg/ml)1ml、2ml、4ml、6ml、10ml，分別置于50ml容量瓶中，加水定容，搖勻；精密量取上述各容量瓶中的溶液2ml，分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，用取樣器混勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作線性回歸方程，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。苯酚-硫酸法：吸取上清液300μl，稀釋30倍后，并吸取2ml于50ml離心管中，量取3份；分別加入6％的苯酚溶液1ml，95％的硫酸溶液6ml，搖勻；40℃水浴30min，取出并冷卻至室溫；分光光度計測定吸光值od490；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12