本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法。

背景技術：

奶牛乳房炎是奶牛生產(chǎn)中最為常見、最難防治，同時也是花費最多的疾病之一，嚴重影響了我國乃至世界奶牛業(yè)的健康發(fā)展。根據(jù)世界奶牛協(xié)會統(tǒng)計，全世界約有2.2億頭奶牛，其中約50%患有乳腺炎等，全球每年因乳房炎造成的損失約350億美元。乳房炎是乳腺組織的一種炎癥，常由微生物感染引起，已有超過150種微生物被認為能導致奶牛乳房炎的發(fā)生，其中金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的最主要致病菌之一。隨著多重耐藥性金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)和流行，以及人們對于奶制品中抗生素殘留的日益重視，研究和使用疫苗無疑是預防金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的一種有效手段。

金黃色葡萄球菌之所以難以防治，是因為在菌體的表面存在一層“保護膜”，即莢膜。有研究表明，莢膜幾乎存在于所有金黃色葡萄球菌菌株的表面，可保護細菌免受抑菌或殺菌物質的侵害以及宿主吞噬細胞的吞噬，同時還有助于細菌黏附于宿主細胞表面以誘發(fā)感染，是細菌得以生存的重要表面結構。莢膜的主要成分為多糖，是細菌結構變化最少的表面抗原之一，具有較好的免疫原性。據(jù)報道，94%～100%的金黃色葡萄球菌都含有莢膜，因此提取金黃色葡萄球菌莢膜多糖作為其疫苗的靶抗原已備受關注。目前，已被鑒定的金黃色葡萄球菌有11個莢膜多糖血清型，其中70％～80％的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生5型或8型莢膜多糖。然而，近年來多項研究表明，336型已成為我國奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的優(yōu)勢血清型，因此對于336型金黃色葡萄球菌多糖疫苗的研究，也越來越重要。

不論是莢膜多糖疫苗還是多糖蛋白結合疫苗的研制，莢膜多糖的提取與純化是其中的關鍵步驟之一。目前，關于金黃色葡萄球菌莢膜多糖提取的報道有很多，但提取方法各異。楊正濤等采用固體培養(yǎng)基對5型金葡菌莢膜多糖進行培養(yǎng)，收集菌體經(jīng)高壓裂解釋放莢膜多糖，但固體培養(yǎng)法不利于擴大生產(chǎn)。楊琦采用了液體發(fā)酵離心收集菌體，高壓裂解菌體收集上清液，再往上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨（ctab）以沉淀多糖，純化后多糖產(chǎn)量為1.3mg/l；吳建勇等采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體沉淀經(jīng)溶菌酶裂解菌體，采用乙醇沉淀對金黃色葡萄球菌336型莢膜多糖進行了提取純化。中國專利cn102971009a，公開了5型和8型金黃色葡萄球菌莢膜多糖的提取純化工藝，該發(fā)明使用了酸處理金黃色葡萄球菌以釋放多糖。然而，林樹乾利用金黃色葡萄球菌發(fā)酵上清液，也成功提取到了莢膜多糖，經(jīng)純化后，多糖產(chǎn)量為12.5mg/l。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術中的缺陷，克服現(xiàn)有技術純化金黃色葡萄球菌莢膜多糖的局限，采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)甲醛滅活離心后分別對上清及菌體中的多糖進行提取，以提高莢膜多糖產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本；同時，利用sevage法替代傳統(tǒng)工藝中苯酚抽提去除蛋白質的方法，減少了苯酚的用量，提高了多糖純化效率。

本發(fā)明所采用336型金黃色葡萄球菌，分離自患臨床型奶牛乳房炎的乳樣中，其特點為菌株傳代穩(wěn)定性好，毒力強，莢膜多糖產(chǎn)量高。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為：一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，包括以下步驟：

1）發(fā)酵培養(yǎng)：

將336型金黃色葡萄球菌種子液按1%（體積百分比）的接種量接種到ph為7.0的裝有哥倫比亞培養(yǎng)基的三角搖瓶中，37℃，200rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)16～18h，收獲得到發(fā)酵液；

2）滅活：

將步驟1）得到的發(fā)酵液中，按終體積的0.3%（體積百分比）加入甲醛溶液，置37℃搖床滅活20～24h，經(jīng)滅活檢測合格后備用，得到滅活發(fā)酵液；

3）提取莢膜多糖：

將步驟2）得到的滅活發(fā)酵液低溫離心，采用陽離子去垢劑從發(fā)酵上清液中提取莢膜多糖，采用高壓裂解法從菌體沉淀中提取莢膜多糖；

4）純化莢膜多糖：

采用分子sevage法抽提多糖中的蛋白質，并利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液做進一步純化。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟1）中，金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)中所使用的哥倫比亞培養(yǎng)基中，添加有按照體積百分比計為2%的無菌乳清。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟3）中，陽離子去垢劑為十六烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基氯化銨或十四烷基二甲基芐基氯化銨。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟3）中的滅活發(fā)酵液低溫離心，是指溫度為4℃，離心轉速為5000rpm/min，離心時間為20min，收集上清液，菌體沉淀置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟3）中的采用陽離子去垢劑從發(fā)酵上清液中提取莢膜多糖，是指向離心后得到的發(fā)酵上清液中加入陽離子去垢劑，邊加邊攪拌，4℃靜置過夜沉淀多糖；沉淀用1m的cacl2溶液溶解，加入冷無水乙醇至終濃度為25%（體積百分比），震蕩混勻后4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心20min棄沉淀，上清液中加入冷無水乙醇至終濃度為80%（體積百分比），4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心20min，收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得到莢膜多糖粗制品。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟3）中的采用高壓裂解法從菌體沉淀中提取莢膜多糖，是指將離心后得到的菌體沉淀懸浮于pbs緩沖液中，高壓裂解后，4℃，5000rpm/min離心20min，收集上清液，沉淀再次高壓裂解并離心，合并裂解上清液；將所得上清液用10kd超濾膜超濾濃縮；加入冷的無水乙醇至終濃度為25%（體積百分比），震蕩混勻后4℃靜置過夜；4℃，5000rpm/min離心20min取上清，加入冷無水乙醇至終濃度為80%（體積百分比），4℃靜置過夜，4℃，5000rpm/min離心20min收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得到莢膜多糖粗制品。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟4）中，采用的分子篩排阻層析填料為sepharose2b，sepharose4b，sepharosecl-2b，sepharosecl-4b或superdex200。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟4）中，采用分子sevage法抽提多糖中的蛋白質，是指合并步驟3）中提取得到的兩種莢膜多糖粗品，用注射用水溶解至多糖粗制品的終濃度為10mg/ml，加入1/3體積的氯仿與正丁醇體積比為4:1的sevage試劑，充分震搖25min后，4℃，5000rpm/min離心20min，上清液經(jīng)30kd超濾管超濾后凍干后，得到脫蛋白的多糖。

進一步的，上述的一種336型金黃色葡萄球菌中莢膜多糖的提取純化方法，所述步驟4）中的利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液做進一步純化，是指利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液進行純化，收集峰值處及附近的洗脫液，30kd超濾管進行超濾后低壓凍干，得到白色粉末狀物質即為莢膜多糖純品。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明采用液體發(fā)酵培養(yǎng)細菌，對發(fā)酵上清液及菌體中的多糖進行了提取，易于臨床生產(chǎn)，同時提高了莢膜多糖產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。

2、本發(fā)明利用sevage法替代傳統(tǒng)工藝中苯酚抽提去除蛋白質的方法，減少了苯酚的用量，提高了多糖純化效率。

3、本發(fā)明的純化過程避免了核酸、蛋白酶等外源因子的應用，工藝簡單、降低了后續(xù)檢測項目的壓力。

4、本發(fā)明提取的莢膜多糖純度高，雜質含量少，符合《中華人民共和國藥典》(2010版)中相關質量標準的規(guī)定。

5、本發(fā)明方法簡便、有效，設備要求低，投入成本少，可用于規(guī)?；a(chǎn)。

具體實施方式

材料來源：

336型金黃色葡萄球菌菌株j581，分離自患臨床型奶牛乳房炎的乳樣中，其特點是菌株傳代穩(wěn)定性好，毒力強，莢膜多糖產(chǎn)量高，該菌株保藏與中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所微生物與免疫實驗室。

哥倫比亞液體培養(yǎng)基（columbiabroth,cb），由招遠托普生物工程有限公司生產(chǎn)，十六烷基三甲基溴化銨（ctab，天津市大茂化工有限公司），lowry法蛋白濃度測定試劑盒（solarbio生物科技有限公司）。

主要儀器設備：

10kd超濾膜包（sartorius），30kd超濾離心管（millipore），sepharosecl-4b瓊脂糖凝膠，為solarbio生物科技有限公司生產(chǎn)。

高速冷凍離心機（backman，j6-hc），冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，fd-1b-50）。

實施例1：

336型金黃色葡萄球菌莢膜多糖的提取與純化：

一、336型金黃色葡萄球菌的發(fā)酵培養(yǎng)

1.培養(yǎng)基的配置：按說明書取35g哥倫比亞培養(yǎng)基，加入適量蒸餾水溶解，用2m的naoh或1m的hcl鹽酸調ph至7.0，蒸餾水定容至1l，121℃高壓滅菌15min，冷至室溫后加入2%體積比的無菌乳清，置4℃冰箱備用。

2.種子液的培養(yǎng)：開啟凍存的菌種j581，以1%的接種量接種至2ml哥倫比亞肉湯（cb），37℃靜置培養(yǎng)10h得一級種子發(fā)酵液；取0.3ml一級種子液接種于30ml哥倫比亞肉湯三角錐瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)（37℃，200rpm/min）12h得工作種子發(fā)酵液，置4℃冰箱備用。

3.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)將工作種子液以1%的接種量，接種于裝有哥倫比亞培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃，200rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)至16～18h。

二、發(fā)酵液的滅活與莢膜多糖提?。?/p>

1.在336型金黃色葡萄球菌發(fā)酵液中加入至終濃度為0.3%的甲醛溶液，37℃搖床滅活過夜20～24h。

2.滅活發(fā)酵液經(jīng)檢測確認無菌后，低溫離心(4℃，5000rpm/min離心20min，下同)，收集上清，沉淀置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.往步驟2制備的上清液中加入陽離子去垢劑，這里優(yōu)選的是十六烷基三甲基溴化銨（ctab），邊加邊攪拌，4℃靜置過夜沉淀多糖，ctab的加入量為：每升發(fā)酵上清液中加入1克的ctab。

4.沉淀用1m的cacl2溶液解離，加入冷無水乙醇至終濃度為25%，震蕩混勻后4℃靜置過夜；

5.低溫離心棄沉淀，上清液中加入至終濃度為80%的冷無水乙醇，4℃靜置過夜；

6.低溫離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得莢膜多糖粗制品。

7.將步驟2凍存的菌體沉淀懸浮于pbs緩沖液中（按0.25g/ml加入），121℃高壓1h裂解后離心收集上清液。

8.沉淀加入pbs緩沖液后再次高壓裂解，低溫離心收集上清液。

9.合并步驟8和步驟9所得的上清液，經(jīng)10kd超濾膜超濾濃縮至原體積的1/10。

10.向濃縮液中加入冷無水乙醇至終濃度為25%，震蕩混勻后4℃靜置過夜。

11.低溫離心棄沉淀，上清液中加入至終濃度為80％的冷無水乙醇4℃靜置過夜。

低溫離心收集沉淀，用無水乙醇和丙酮洗滌后凍干，即得莢膜多糖粗制品。

三、336型金黃色葡萄球菌莢膜多糖的純化：

1.合并步驟6和步驟11所得莢膜多糖，按照10mg/ml的量，用注射用水溶解。

2.加入1/3體積的sevage試劑(氯仿與正丁醇體積比為4:1)，充分震搖25min后低溫離心，同時采用苯酚抽提法進行比較研究（結果見表1）。

3.上清液經(jīng)30kd超濾管超濾，濃縮液凍干，得脫蛋白多糖。

4.利用分子篩排阻層析對脫蛋白的莢膜多糖溶液(5mg/ml)進行純化，這里優(yōu)選的填料是sepharosecl-4b。

5.收集峰值處及附近的洗脫液，30kd超濾管進行超濾后低壓凍干，得到白色粉末狀物質即為莢膜多糖純品。

表1

四、336型金黃色葡萄球菌精制莢膜多糖的質量檢測：

1.對制得的多糖精密稱重，計算出每升發(fā)酵液提取多糖的量。

2.采用lowry法蛋白濃度測定試劑盒，測定精制莢膜多糖中蛋白質含量。

3.采用紫外分光光度計法，測定精制莢膜多糖中核酸的含量。

336型金黃色葡萄球菌精制莢膜多糖質量檢測結果如表2所示。

表2

由表2以看出，本發(fā)明一種用于336型金黃色葡萄球菌莢膜多糖的提取純化方法，工藝穩(wěn)定，莢膜多糖產(chǎn)量高，純度較高。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。