本發(fā)明屬于植物乳桿菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種飼用植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
飼料中添加抗生素的廣泛應(yīng)用，造成動(dòng)物腸道菌群失調(diào)、二重感染以及細(xì)菌耐藥性等不良反應(yīng)也逐漸凸顯，給養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。因此，開發(fā)無毒副作用、無污染和無殘留的抗生素替代品，對(duì)畜牧業(yè)意義重大。
植物乳桿菌，人和動(dòng)物腸道內(nèi)主要的益生菌群，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能；同時(shí)還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長(zhǎng)，改善腸道微環(huán)境。另外，乳桿菌為消化道內(nèi)正常存在的一類微生物，在腸黏膜具有較強(qiáng)的耐受和定植能力，并且是一種兼性厭氧的乳酸菌，與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比，更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用。
傳統(tǒng)的靜置發(fā)酵法得到的發(fā)酵液中菌體的發(fā)酵密度較低，植物乳桿菌活菌數(shù)在5-10億左右，為了得到更多的活菌數(shù)，就需要增加生物反應(yīng)器的體積或增加發(fā)酵次數(shù)等，從而增加生物量的分離費(fèi)用，延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，從而提高生產(chǎn)成本、降低生產(chǎn)效率。
植物乳桿菌目前仍難以實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，難以實(shí)現(xiàn)的主要問題是發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足和代謝產(chǎn)物(主要是乳酸)積累抑制菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致高密度發(fā)酵難以實(shí)現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
(一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種飼用植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一目的是提供該高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵方法。
(二)技術(shù)方案
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供一種飼用植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，所述的植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分及其含量如下：葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10～20g/L、酵母粉10～25g/L，K2HPO4 5～Sg/L，檸檬酸鈉4～Sg/L，Mg2+水溶性化合物0.2～0.4g/L，F(xiàn)e2+水溶性化合物0.1～0.2g/L和Mn2+水溶性化合物20～80mg/L，吐溫-80 0.5～2mL。其中，所述的Mg2+水溶性化合物為MgSO4，MgCl2中的任一種；所述的Fe2+水溶性化合物為FeSO4，F(xiàn)eCl2，中的任一種；所述的Mn2+水溶性化合物為MnSO4。
本發(fā)明的飼用植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法如下：
(1)按含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中葡萄糖單獨(dú)溶解；
(2)葡萄糖115℃單獨(dú)滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將葡萄糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
本發(fā)明還提供了該飼用植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵方法，主要步驟如下：
(1)將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10～16小時(shí)
后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0～6.5，當(dāng)pH超過設(shè)定值時(shí)，補(bǔ)加50％葡萄糖液：當(dāng)pH低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加氨水、KOH或NaOH中的任一種；在溫度37～39℃、轉(zhuǎn)速50rpm條件下發(fā)酵12～18小時(shí)，發(fā)酵過程不通氣或通入N2，維持溶氧小于1％；
(5)當(dāng)補(bǔ)加50％葡萄糖液pH不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值(即 OD600)不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1010cfu/mL以上的發(fā)酵液。
本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法適用于其它乳桿菌。本發(fā)明所用植物乳桿菌保藏于中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心，編號(hào)為CICC 6027。
(三)有益效果
本發(fā)明采用pH反饋控制補(bǔ)加葡萄糖策略，同時(shí)降低發(fā)酵液中乳酸的濃度，從而解除乳酸的反饋抑制作用，使用本發(fā)明的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法發(fā)酵的植物乳桿菌，菌體密度較普通發(fā)酵顯著提高，活菌數(shù)不低于1010cfu/ml，這是現(xiàn)有的技術(shù)難以達(dá)到的發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)，較普通MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)活菌數(shù)5.1×108cfu/ml，提高30倍以上，實(shí)現(xiàn)了植物乳桿菌的高密度發(fā)酵；可以減小生物量的分離費(fèi)用，縮短生產(chǎn)周期，從而降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施方式
通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L，K2HPO4 5g/L，檸檬酸鈉4g/L，MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：55mg/L，吐溫-80 0.5mL。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中葡萄糖單獨(dú)溶解；
(2)葡萄糖115℃單獨(dú)滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將葡萄糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.0，當(dāng)pH超過6.0時(shí)，補(bǔ)加50％葡萄糖
液；當(dāng)pH低于6.0時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉(zhuǎn)速50rpm條件下
發(fā)酵10小時(shí)，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當(dāng)補(bǔ)加50％葡萄糖液pH不再降低時(shí)，終止發(fā)酵，即得植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.1×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)
(1)植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
葡萄糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時(shí)后。以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)10小時(shí)，終止發(fā)酵，
得到植物乳桿菌活菌數(shù)為3.5×108cfu/ml
3.3結(jié)果分析
應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.1×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應(yīng)用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的植物乳桿菌活菌數(shù)僅為3.5×108cfu/ml。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的植物乳桿菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術(shù)的30倍，實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
實(shí)施例2 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L，K2HPO4 8g/L，檸檬酸鈉8g/L，MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：55mg/L，吐溫-80 0.5mL。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中葡萄糖單獨(dú)溶解；
(2)葡萄糖115℃單獨(dú)滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將葡萄糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16小時(shí)后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.5，當(dāng)pH超過6.5時(shí)，補(bǔ)加50％葡萄糖
液；當(dāng)pH低于6.5時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉(zhuǎn)速50rpm條件下
發(fā)酵16小時(shí)，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當(dāng)補(bǔ)加50％葡萄糖液pH不再降低時(shí)，終止發(fā)酵，即得植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)
(1)植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
葡萄糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層 MRS液體試管，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后。以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16小時(shí)后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)18小時(shí)，終止發(fā)酵，
得到植物乳桿菌活菌數(shù)為4.0×108cfu/ml
3.3結(jié)果分析
應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.2×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應(yīng)用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的植物乳桿菌活菌數(shù)僅為4.0×108cfu/ml。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的植物乳桿菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術(shù)的30倍，實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
實(shí)施例3 發(fā)酵培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵比較
1、植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)基組分及其含量為：
葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉20g/L，K2HPO4 5g/L，檸檬酸鈉8g/L，MgSO4：0.2g/L，F(xiàn)eSO4：0.1g/L，MnSO4：60mg/L，吐溫-80 2mL。
2、培養(yǎng)基配制方法：
(1)按上述含量分別稱取各組分，用蒸餾水溶解，其中葡萄糖單獨(dú)溶解；
(2)葡萄糖115℃單獨(dú)滅菌20分鐘，其他組分裝入發(fā)酵罐中121℃，滅菌30分鐘；
(3)接種前通過無菌操作將葡萄糖加入發(fā)酵罐中，攪拌混勻，即得。
3高密度發(fā)酵與現(xiàn)有技術(shù)發(fā)酵的比較
(1)將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)16小時(shí)后作為種子液；
(2)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基降至所需溫度；
(3)以0.5％的接種量將步驟(1)所得的種子液接種于步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)纂中；
(4)發(fā)酵，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為6.5，當(dāng)pH超過6.0時(shí)，補(bǔ)加50％葡萄糖
液；當(dāng)pH低于6.5時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水；在溫度37′C、轉(zhuǎn)速50rpm條 件下
發(fā)酵18小時(shí)，發(fā)酵過程不通氣，維持溶氧小于1％；
(5)當(dāng)補(bǔ)加50％葡萄糖液pH不再降低時(shí)，終止發(fā)酵，即得植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.8×1010cfu/ml的發(fā)酵液。
3.2對(duì)照實(shí)驗(yàn)
(1)植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)其組分與含量為：
葡萄糖：20g/L、蛋白胨：10g/L、牛肉膏：5g/L，酵母粉；4g/L，K2HPO4：2g/L，CH3COONa：5g/L、檸檬酸鈉：2g/L，MgSO4：0.2g/L，MnSO4：50mg/L、吐溫80：1ml。
(2)發(fā)酵
將冷凍保存的植物乳桿菌在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后。以1％接種量轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液，以0.5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基。37℃靜置培養(yǎng)16小時(shí)，終止發(fā)酵，
得到植物乳桿菌活菌數(shù)為5.0×108cfu/ml
3.3結(jié)果分析
應(yīng)用本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，可以得到植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1.8×1010cfu/ml的發(fā)酵液，而應(yīng)用現(xiàn)行發(fā)酵培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)及其發(fā)酵方法，得到的植物乳桿菌活菌數(shù)僅為5.0×108cfu/ml。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法得到的植物乳桿菌活菌數(shù)為現(xiàn)有技術(shù)的36倍，實(shí)現(xiàn)了高密度發(fā)酵。
生產(chǎn)中，高密度發(fā)酵的實(shí)現(xiàn)可以減小生物量的分離費(fèi)用，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率等，這在高效節(jié)能的當(dāng)代社會(huì)具有極其重要的意義。