本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法及成綠肉座菌的固體培養(yǎng)基。
背景技術：
成綠肉座菌(Hypocrea virens)是一種抑制多種土傳植物病原真菌的重寄生菌，菌落生長快，培養(yǎng)4天后直徑7～9.5cm，氣生菌絲卷毛狀，白色或者灰色。分生孢子豐富，近于平展狀覆蓋于平板。成綠肉座菌作為植物病害生物防治的主要機制，已經(jīng)越來越受到各國植物病理學家的重視。重寄生菌作為生物防治的重要因子，對于防治植物病害具有重要作用。
現(xiàn)有技術中，關于成綠肉座菌發(fā)酵工藝的報道較少，僅專利號為CN10375911A的發(fā)明專利記載了關于成綠肉座菌的發(fā)現(xiàn)和應用的相關內(nèi)容，成綠肉座菌培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基僅是對成綠肉座菌的活化培養(yǎng)及活化培養(yǎng)基兩方面有記載，并未就成綠肉座菌發(fā)酵方法以及發(fā)酵各階段所使用的培養(yǎng)基有記載。
成綠肉座菌活化培養(yǎng)方法無法滿足本領域預防植物病害的應用，而傳統(tǒng)的真菌發(fā)酵方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但存在發(fā)酵時間長，成本高，收率低等問題，不能滿足現(xiàn)有防止植物病害的應用。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于得到優(yōu)化的發(fā)酵生產(chǎn)方法，能夠得到一種更高效的控制手段，最終獲取孢子含量較高的綠肉座菌孢子粉。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：
本發(fā)明提供了一種成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括下列步驟：
1)將成綠肉座菌菌種活化，接種到一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子液；
2)將所述步驟1)得到的一級種子液接種到二級液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到二級種子液；
3)將所述步驟2)得到的二級種子液與固體培養(yǎng)基混合后形成菌料，培養(yǎng)后，得到成綠肉座菌孢子；
所述固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷殼7.80％～13.40％。
優(yōu)選的，所述步驟1)中培養(yǎng)的時間為35～50h，培養(yǎng)的溫度為25～30℃，光照培養(yǎng)的強度為2000～3000lx。
優(yōu)選的，所述步驟1)中的培養(yǎng)在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/20min，每次攪拌的時間為1～2min，攪拌頻率為150～300r/min；所述培養(yǎng)過程進行通氣，所述通氣的程序具體為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為10～15m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量15～24m3/h；所述培養(yǎng)的接種量為1～5％；所述一級種子液培養(yǎng)基的初始pH值為5.5～6.5。
優(yōu)選的，所述步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)的時間為55～70h，培養(yǎng)溫度為28～32℃，光照培養(yǎng)的強度為3000～4000lx；
優(yōu)選的，所述步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)過程進行通氣，所述通氣的程序具體為：接種到固體培養(yǎng)后24h之內(nèi)，通氣量為100～180m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為200～260m3/h。
優(yōu)選的，所述步驟2)中的培養(yǎng)在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/20min，每次攪拌的時間為1～2min，攪拌頻率為150～300r/min。
優(yōu)選的，所述步驟2)中培養(yǎng)的接種量為8～15％。
優(yōu)選的，所述培養(yǎng)發(fā)酵過程控制二級液體培養(yǎng)基的pH值為5.5～6.5。
優(yōu)選的，所述步驟3)固體培養(yǎng)的接種量為12～20％。
優(yōu)選的，所述步驟3)固體培養(yǎng)基的厚度為2.5～3.5cm。
優(yōu)選的，所述步驟3)固體培養(yǎng)過程進行溫度和濕度的控制，所述溫度和濕度的控制程序具體為：在進入固體培養(yǎng)1～3d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為85～90％，環(huán)境溫度為25～26℃，菌料溫度控制為28～30℃，在進入固體培養(yǎng)4～5d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為40～60％，環(huán)境溫度為30℃，6～7d之內(nèi)環(huán)境溫度為30～35℃；所述固體培養(yǎng)32～36h時翻盤散熱；所述固體培養(yǎng)48～55h時將營養(yǎng)液噴灑到菌料上；光照培養(yǎng)的強度為2000～3000lx。
優(yōu)選的，所述營養(yǎng)液包括質(zhì)量濃度為3～6％葡萄糖和質(zhì)量分數(shù)為0.0005～0.002％的ZnCl2；
優(yōu)選的，所述營養(yǎng)液的噴灑量為菌料質(zhì)量的5～10％。
優(yōu)選的，所述一級種子液體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量的組分：葡萄糖0.50％～2.00％、白砂糖0.50％～2.00％、黃豆粉0.10％～0.30％、硫酸銨0.10％～0.30％、磷酸氫二鉀0.05％～0.10％、氯化鉀0.05％～0.10％、硫酸鎂0.01％～0.04％、硫酸鐵0.00％～0.004％，余量為水；更優(yōu)選的，所述一級種子液體培養(yǎng)基包括下列百分含量組分，葡萄糖1％、白砂糖1％、黃豆粉1％、硫酸銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、氯化鉀0.08％、硫酸鎂0.02％、硫酸鐵0.0002％，余量為水。
優(yōu)選的，所述的二級種子液體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，葡萄糖1％～3％、白砂糖1％～3％、馬鈴薯粉0.5％～1.5％、黃豆粉0.5％～1.5％、玉米粉0.3％～1.0％、磷酸氫二鉀0.01％～0.02％，余量為水；更優(yōu)選的，所述的二級種子液體培養(yǎng)基包括下列百分含量組分，葡萄糖2％、白砂糖2％、馬鈴薯粉1％、黃豆粉1％、玉米粉0.5％、磷酸氫二鉀0.01％，余量為水。
本發(fā)明還提供了一種成綠肉座菌的固體培養(yǎng)基，包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷殼7.80％～13.40％，余量為水。
優(yōu)選的，所述的固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩70％、豆粕10％、玉米粉10％、谷殼10％。
本發(fā)明提供了一種成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，將成綠肉座菌菌種活化，在一級種子液體培養(yǎng)基和二級液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)以擴大繁殖，得到強健的菌體和一定量的孢子，將二級種子液接種到復合的碳源和氮源形成的固體培養(yǎng)基上，使成綠肉座菌的快速生長和產(chǎn)孢。將固體發(fā)酵得到的成綠肉座菌培養(yǎng)物進行檢測，產(chǎn)孢子量為80～120億個孢子/g，由此可見，采用本發(fā)明的技術方案最終獲取孢子含量較高的綠肉座菌孢子粉，解決了本發(fā)明的技術問題。
進一步的，本發(fā)明通過溫度與濕度梯度化管理來完成產(chǎn)孢和收集孢子，在剛進行固體培養(yǎng)時，給予高溫高濕的環(huán)境，讓菌絲在固體培養(yǎng)基中迅速適應環(huán)境；在密集發(fā)酵期即進入發(fā)酵第20h～40h時為應對物料溫度將會急速的升高降低環(huán)境溫度，防止燒盤，同時在30h左右將發(fā)酵料翻動，以便于扇熱的同時為菌種更好的提供空氣；在產(chǎn)孢階段，降低房間濕度和溫度，有利于促進菌絲產(chǎn)生孢子；控制在菌絲顏色有變化之時，在50h左右菌絲顏色發(fā)生變化時補液能夠給菌絲充足的葡萄糖和無機鹽以促進產(chǎn)孢子。
保藏說明
成綠肉座菌(Hypocrea virens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為：中國.北京.北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物所，保藏日期為2013年08月13日，其保藏編號為CGMCC No.7995。
具體實施方式
本發(fā)明提供了本發(fā)明提供了一種成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括下列步驟：1)將成綠肉座菌菌種活化，接種到一級種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子液；2)將所述步驟1)得到的一級種子液接種到二級液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到二級種子液；3)將所述步驟2)得到的二級種子液與固體培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，得到成綠肉座菌孢子；所述固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷殼7.80％～13.40％。
本發(fā)明提供了一種成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，將成綠肉座菌菌種活化，在一級種子液體培養(yǎng)基和二級液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)以擴大繁殖，得到強健的菌體和一定量的孢子，將二級種子液接種到復合的碳源和氮源形成的固體培養(yǎng)基上，使成綠肉座菌的快速生長和產(chǎn)孢。
本發(fā)明將成綠肉座菌菌種活化，得到活化的成綠肉座菌菌種。本發(fā)明對所述活化的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員熟知的活化的技術方案即可。在本發(fā)明的實施例中，所述成綠肉座菌菌種為江西天人生態(tài)股份有限公司提供。
在本發(fā)明中，所述活化時的培養(yǎng)基優(yōu)選為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(根據(jù)公司之前的專利確定的)。
得到活化的成綠肉座菌，本發(fā)明將所述活化的成綠肉座菌接種到一級種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到一級種子液。
在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的時間優(yōu)選為35～50h，更優(yōu)選為40～45h。所述的培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25～32℃，更優(yōu)選為30℃。所述的培養(yǎng)優(yōu)選在光照條件下進行，光照培養(yǎng)的強度為2000～3000lx。
在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)優(yōu)選在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/20min，每次攪拌的時間為1～2min，所述攪拌的頻率為150～300r/min。
在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)過程進行通氣，所述通氣的程序具體優(yōu)選為：進入培養(yǎng)的24h內(nèi)，通氣量優(yōu)選為10～16m3/h，更優(yōu)選為15m3/h；進入培養(yǎng)24h后，通氣量優(yōu)選為15～24m3/h，更優(yōu)選為20m3/h。
在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為1～5％。
在本發(fā)明中，所述一級液體培養(yǎng)基的初始pH值優(yōu)選為5.5～6.5，更優(yōu)選為6.0。
在本發(fā)明中，所述一級種子液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括下列質(zhì)量百分含量的組分：葡萄糖0.50％～2.00％、白砂糖0.50％～2.00％、黃豆粉0.10％～0.30％、硫酸銨0.10％～0.30％、磷酸氫二鉀0.05％～0.10％、氯化鉀0.05％～0.10％、硫酸鎂0.01％～0.04％、硫酸鐵0.00％～0.004％，余量為水；更優(yōu)選包括下列質(zhì)量百分含量組分，葡萄糖1％、白砂糖1％、黃豆粉1％、硫酸銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、氯化鉀0.08％、硫酸鎂0.02％、硫酸鐵0.0002％，余量為水。本發(fā)明對上述藥品的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的用于制備培養(yǎng)基的藥品即可。
得到一級種子液后，本發(fā)明將所述一級種子液接種到二級液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到二級種子液。
本發(fā)明對所述接種的方法沒有特殊限制，采用本領域技術人員所述熟知的接種的技術方案即可。
在本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為8～15％，更優(yōu)選為10％。
在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的時間優(yōu)選為55～70h，更優(yōu)選為60～64h。
在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28～32℃，更優(yōu)選為30℃。
在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)需在光照條件下進行，所述光照培養(yǎng)的強度為3000～4000lx。
在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選在通氣條件下進行，所述通氣的程序具體優(yōu)選為：接種到二級液體培養(yǎng)基后的24h之內(nèi)，通氣量為100～180m3/h，更優(yōu)選為120～160m3/h，最優(yōu)選為150m3/h；培養(yǎng)24h后，通氣量為200～260m3/h，更優(yōu)選為220～250m3/h，最優(yōu)選為240m3/h。
在本發(fā)明中，，所述步驟2)中的培養(yǎng)在攪拌的條件下進行，所述攪拌的頻率為1～2次/20min，每次攪拌的時間為1～2min，攪拌頻率為150～300r/min。
在本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)的過程中發(fā)酵液的pH值不進行調(diào)控，自然pH值即可。
在本發(fā)明中，所述的二級種子液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括下列質(zhì)量百分含量組分：葡萄糖1％～3％、白砂糖1％～3％、馬鈴薯粉0.5％～1.5％、黃豆粉0.5％～1.5％、玉米粉0.3％～1.0％、磷酸氫二鉀0.01％～0.02％，余量為水；更優(yōu)選包括下列質(zhì)量百分含量組分：葡萄糖2％、白砂糖2％、馬鈴薯粉1％、黃豆粉1％、玉米粉0.5％、磷酸氫二鉀0.01％，余量為水。
得到的二級種子液后，本發(fā)明將所述二級種子液與固體培養(yǎng)基混合形成菌料。本發(fā)明對混合優(yōu)選為將所述二級種子液噴灑在固體培養(yǎng)基上，然后混合均勻。在本發(fā)明中，所述噴灑的體積優(yōu)選為占固體培養(yǎng)基體積的12～20％，更優(yōu)選為15％。
在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)基優(yōu)選包括下列質(zhì)量百分含量組分：麥麩65.00％～75.00％、豆粕7.00％～12.00％、玉米粉7.60％～13.50％、谷殼7.80％～13.40％，更優(yōu)選為包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩70％、豆粕10％、玉米粉10％、谷殼10％。
在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)基的含水量為55～65％，更優(yōu)選為60％。
在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)基的厚度優(yōu)選為2.5～3.5cm，更優(yōu)選為3cm。
得到菌料后，本發(fā)明對所述菌料進行培養(yǎng)，得到成綠肉座菌孢子。
本發(fā)明對所述固體培養(yǎng)過程的環(huán)境溫度、菌料溫度和環(huán)境濕度控制。在本發(fā)明中，所述溫度和濕度的控制程序具體優(yōu)選為：在進入固體培養(yǎng)1～3d之內(nèi)控制環(huán)境濕度優(yōu)選為85～90％，更優(yōu)選為88％，環(huán)境溫度優(yōu)選為25～26℃，菌料溫度控制為28～30℃；在進入固體培養(yǎng)4～5d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為40～60％，環(huán)境溫度為30℃；6～7d之內(nèi)環(huán)境溫度優(yōu)選為30～35℃；所述固體培養(yǎng)32～36h時優(yōu)選翻盤散熱；所述固體培養(yǎng)48～55h時優(yōu)選將營養(yǎng)液噴灑到菌料上。
在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)的時間優(yōu)選為7d。
在本發(fā)明中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)在光照條件下進行，所述光照的強度為2000～3000lx。
本發(fā)明對所述固體培養(yǎng)過程優(yōu)選在微生物固態(tài)發(fā)酵氣流循環(huán)設備上進行。在本發(fā)明實施例中所述微生物固態(tài)發(fā)酵氣流循環(huán)設備購自江西天人生態(tài)股份有限公司。
在本發(fā)明中，所述營養(yǎng)液優(yōu)選包括質(zhì)量濃度為3～6％葡萄糖和質(zhì)量分數(shù)為0.0005～0.002％的ZnCl2，更優(yōu)選為包括質(zhì)量濃度為5％葡萄糖和質(zhì)量分數(shù)為0.001％的ZnCl2。本發(fā)明對所述葡萄糖和ZnCl2的來源沒有特殊限制，采用本領域技術人員所熟知的來源即可。
在本發(fā)明中，所述營養(yǎng)液的噴灑體積優(yōu)選為菌料體積的5～10％，更優(yōu)選為6％。
所述固體發(fā)酵后，本發(fā)明優(yōu)選對得到孢子粉的進行收集，得到成綠肉座菌包子。在本發(fā)明實施例中，所述孢子粉的收集具體采用微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設備的儀器進行。所述微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設備的儀器購自江西天人生態(tài)股份有限公司。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的成綠肉座菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。
實施例1
江西天人生態(tài)股份有限公司提供的成綠肉座菌菌種在PDA固體斜面培養(yǎng)基上接種1％，28℃條件下進行培養(yǎng)3d，完成菌種活化。活化后的成綠肉座菌菌種按照1％的接種量接種到裝有一級種子培養(yǎng)基的250L發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)40h，培養(yǎng)溫度為27℃，初始pH值為6.0，一級種子培養(yǎng)基配方包括葡萄糖1％、白砂糖1％、黃豆粉1％、硫酸銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、氯化鉀0.08％、硫酸鎂0.02％、硫酸鐵0.0002％，余量為水，進入培養(yǎng)后24h按照15m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照24m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在30℃，光照強度為2000lx，攪拌頻率為1次/20min，1min/次，攪拌強度為150r/min得到一級種子液。將得到的一級種子液按照10％的接種量接種到裝有二級種子培養(yǎng)基的2500L二級種子罐中，在30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)64d，初始pH值為自然pH值，二級種子培養(yǎng)基配方包括下列百分含量組分，葡萄糖2％、白砂糖2％、馬鈴薯粉1％、黃豆粉1％、玉米粉0.5％、磷酸氫二鉀0.01％，進入培養(yǎng)后24h按照150m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照200m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在30℃，光照強度為4000lx，攪拌頻率為1次/20min，1min/次，攪拌強度為300r/min得到二級種子液。將得到的二級種子液按照15％的接種量接種到盛有固體培養(yǎng)基的淺盤中，將淺盤放置在微生物固態(tài)發(fā)酵氣流循環(huán)設備上置于發(fā)酵房中進行發(fā)酵培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，所述的固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩70％、豆粕10％、玉米粉10％、谷殼10％，固體培養(yǎng)基的含水量為60％，淺盤裝成固體培養(yǎng)基的厚度為3cm，增加光照，光照強度為2500lx；固體發(fā)酵培養(yǎng)第1天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制28℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第2天將環(huán)境溫度設置為26℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)32h時進行翻盤以便于散熱，并且更好的為生長提供氧氣；固體發(fā)酵培養(yǎng)第3天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在85％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)55h時將5％葡萄糖、0.001％ZnCl2的營養(yǎng)液按照固體培養(yǎng)基質(zhì)量的6％噴灑到發(fā)酵料上，給菌絲通過更加充足的營養(yǎng)和促進作用；固體發(fā)酵培養(yǎng)第4天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在60％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第5天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在40％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第6天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第7天將環(huán)境溫度設置為35℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)。
將固體發(fā)酵后的菌料采用微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設備收集成綠肉座菌孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為成綠肉座菌孢子。
實施例2
江西天人生態(tài)股份有限公司提供的成綠肉座菌菌種在PDA固體斜面培養(yǎng)基上接種0.8％，30℃條件下進行活化培養(yǎng)4d，完成菌種活化。活化后的成綠肉座菌菌種按照1.5％的接種量接種到裝有一級種子培養(yǎng)基的250L發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)50h，培養(yǎng)溫度為28℃，初始pH值為6.5，一級種子培養(yǎng)基配方包括葡萄糖0.5％、白砂糖2.0％、黃豆粉0.3％、硫酸銨0.1％、磷酸氫二鉀0.2％、氯化鉀0.05％、硫酸鎂0.04％、硫酸鐵0.0008％，余量為水，進入培養(yǎng)后24h按照10m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照15m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在30℃，光照強度為3000lx，攪拌頻率為1次/20min，1.5min/次，攪拌強度為300r/min得到一級種子液。將得到的一級種子液按照15％的接種量接種到裝有二級種子培養(yǎng)基的2500L二級種子罐中，在30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)55d，初始pH值為自然pH值，二級種子培養(yǎng)基配方包括下列百分含量組分，葡萄糖1％、白砂糖3％、馬鈴薯粉0.5％、黃豆粉1.5％、玉米粉0.3％、磷酸氫二鉀0.02％，進入培養(yǎng)后24h按照150m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照260m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在30℃，光照強度為3500lx，攪拌頻率為1次/20min，2min/次，攪拌強度為200r/min得到二級種子液。將得到的二級種子液按照20％的接種量接種到盛有固體培養(yǎng)基的淺盤中，將淺盤放置在微生物固態(tài)發(fā)酵氣流循環(huán)設備上置于發(fā)酵房中進行發(fā)酵培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩65.00％、豆粕12.00％、玉米粉7.60％、谷殼13.40％，固體培養(yǎng)基的含水量為65％，淺盤裝成固體培養(yǎng)基的厚度為3.5cm，增加光照，光照強度為2000lx；固體發(fā)酵培養(yǎng)第1天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制28℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第2天將環(huán)境溫度設置為26℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)32h時進行翻盤以便于散熱，并且更好的為生長提供氧氣；固體發(fā)酵培養(yǎng)第3天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在85％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)55h時將3％葡萄糖、0.002％ZnCl2的營養(yǎng)液按照固體培養(yǎng)基質(zhì)量的10％噴灑到發(fā)酵料上，給菌絲通過更加充足的營養(yǎng)和促進作用；固體發(fā)酵培養(yǎng)第4天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在60％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第5天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在40％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第6天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第7天將環(huán)境溫度設置為35℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)。將固體發(fā)酵后的菌料采用微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設備收集成綠肉座菌孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為成綠肉座菌孢子。
實施例3
江西天人生態(tài)股份有限公司提供的成綠肉座菌菌種在PDA固體斜面培養(yǎng)基上接種1.0％，30℃條件下進行活化培養(yǎng)3d，完成菌種活化?；罨蟮某删G肉座菌菌種按照1％的接種量接種到裝有一級種子培養(yǎng)基的250L發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)35h，培養(yǎng)溫度為32℃，初始pH值為5.5，一級種子培養(yǎng)基配方包括葡萄糖2.00％、白砂糖0.50％、黃豆粉0.10％、硫酸銨0.30％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鉀0.10％、硫酸鎂0.01％、硫酸鐵0.0008％，余量為水，進入培養(yǎng)后24h按照12m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照15m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在30℃，光照強度為2500lx，攪拌頻率為2次/h，15min/次，攪拌強度為250r/min得到一級種子液。將得到的一級種子液按照15％的接種量接種到裝有二級種子培養(yǎng)基的2500L二級種子罐中，在30℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)70h，初始pH值為自然pH值，二級種子培養(yǎng)基配方包括下列百分含量組分，包括下列質(zhì)量百分含量組分，葡萄糖3％、白砂糖1％、馬鈴薯粉1.5％、黃豆粉0.5％、玉米粉1.0％、磷酸氫二鉀0.01％，余量為水，進入培養(yǎng)后24h按照180m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照260m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)過程的溫度控制在32℃，光照強度為3000lx，攪拌頻率為2次/20min，1min/次，攪拌強度為150r/min得到二級種子液。將得到的二級種子液按照12％的接種量接種到盛有固體培養(yǎng)基的淺盤中，將淺盤放置在微生物固態(tài)發(fā)酵氣流循環(huán)設備上置于發(fā)酵房中進行發(fā)酵培養(yǎng)，所述固體培養(yǎng)基包括下列質(zhì)量百分含量組分，包括下列質(zhì)量百分含量組分，麥麩75.00％、豆粕7.00％、玉米粉13.50％、谷殼7.80％，淺盤裝成固體培養(yǎng)基的厚度為2.5cm，增加光照，光照強度為3000lx；固體發(fā)酵培養(yǎng)第1天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制28℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第2天將環(huán)境溫度設置為26℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在90％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)35h時進行翻盤以便于散熱，并且更好的為生長提供氧氣；固體發(fā)酵培養(yǎng)第3天將環(huán)境溫度設置為25℃，物料溫度控制30℃條件下，環(huán)境濕度控制在85％的條件下進行培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)55h時將4％葡萄糖、0.0001％ZnCl2的營養(yǎng)液按照固體培養(yǎng)基質(zhì)量的5％噴灑到發(fā)酵料上，給菌絲通過更加充足的營養(yǎng)和促進作用；固體發(fā)酵培養(yǎng)第4天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在65％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第5天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度控制在45％的條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第6天將環(huán)境溫度設置為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體發(fā)酵培養(yǎng)第7天將環(huán)境溫度設置為33℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)。將固體發(fā)酵后的菌料采用微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設備收集成綠肉座菌孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為成綠肉座菌孢子。
采用血球計數(shù)板法計算實施例1、2和3中得到的孢子收率分別為90億個孢子/g、120億個孢子/g和100億個孢子/g。
由以上實施例可知，采用合適的碳氮比，在一級種子液制備中以高的氮含量，促使菌種集中的菌體生產(chǎn)上，生長出更加強健的菌體，在二級種子液產(chǎn)生中，碳氮比菌體生產(chǎn)適宜，有強健的菌絲可以產(chǎn)生出更多的孢子，同時孢子萌發(fā)在菌液中，可以在固體發(fā)酵階段中更加大量的菌體；提供最適宜的非生物影響因子，復合的碳源和氮源在生產(chǎn)中更加適宜成綠肉座菌的生成和產(chǎn)孢。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。