專利名稱：一種褐藻膠寡糖的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類的制備及其應(yīng)用，特別涉及的是一種以褐藻膠為原料制備作為抑菌劑的褐藻膠寡糖的方法。
背景技術(shù)：
聚合度在2～20之間的糖基聚合體定義為寡糖，與褐藻膠高聚物相比，寡糖具有溶解性強、穩(wěn)定性好、易被機體吸收等優(yōu)點。近年來，不少專家學(xué)者對制備褐藻膠寡糖進行了研究，例2004年8月11日公告的CN1161368C的中國發(fā)明專利說明書中公開的“一種褐藻膠寡糖的制造方法”，該方法采用的是褐藻膠在氧化劑存在下的酸水解，存在需要在強酸環(huán)境中進行，工藝條件不易控制的不足；2004年12月29日公告的CN1182146C的中國發(fā)明專利說明書中公開的“一種利用化學(xué)氧化制備褐藻膠寡糖的方法”，由于過氧化氫的使用，存在化學(xué)殘留和去除問題；2003年11月12日公開的CN1454992的中國發(fā)明專利說明書公開的“一種新的褐藻膠裂合酶及其制備方法和應(yīng)用”，利用制得的褐藻膠裂合酶將褐藻膠酶解生產(chǎn)褐藻膠寡糖。雖然容易獲得分子量集中的寡糖，但是，由于酶制備方法麻煩，成本偏高而受到限制。
近年來，由于抗菌素的大量使用，使環(huán)境受到污染，細菌基因突變而產(chǎn)生耐藥性，并且耐藥率逐漸提高，幾乎所有細菌都獲得耐藥基因，這一問題已日趨嚴(yán)重。對付細菌耐藥性除了合理運用抗生素外，主要對策就是研制開發(fā)對耐藥菌株有效的新藥和新制劑。近年來，褐藻膠的生理活性不斷被揭示，尤其在促生長作用、增強機體免疫功能、抗腫瘤和對神經(jīng)元損傷的保護作用等方面的研究，日益引起人們的關(guān)注，從而使褐藻膠得到進一步的應(yīng)用。而褐藻膠寡糖的用途只在2004年8月4日公告的CN1160080C的中國發(fā)明專利說明書所公開的“褐藻膠寡糖作為制備預(yù)防因東莨菪堿所致癡呆藥物的應(yīng)用”中提出，是用作抗衰老和抗癡呆的藥物。然而，褐藻膠寡糖作為天然的具有高效抑菌活性的抑菌劑，到目前為止，國內(nèi)外還沒有相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中工藝條件不易控制、成本較高、化學(xué)物質(zhì)殘留等方面的不足，本發(fā)明提供一種操作及工藝路線簡單，設(shè)備少，成本低的具有高效抑菌活性的褐藻膠寡糖的制備方法。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種褐藻膠寡糖的制備方法，特點是用超聲波對1-5％的褐藻膠溶液，在溫度40-80℃、pH值為2-5下降解7-10小時后，降解液加入無水乙醇進行醇析，抽濾，烘干，研磨即得褐藻膠寡糖，其平均聚合度10以下。
上述的超聲波的頻率為150Hz。
上述的褐藻膠溶液是由褐藻膠固體與2.5％的醋酸溶液配制而成。
本發(fā)明還提出上述制備的褐藻膠寡糖，可用作細菌或真菌的抑菌劑。該褐藻膠寡糖作為天然的具有高效抑菌活性能彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。
所述的細菌可為藤黃微球菌或金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌或大腸桿菌。
所述的真菌可為啤酒酵母。
所述的對藤黃微球菌或金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的最低抑菌濃度僅為0.2-0.7％，對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度為0.5-2.5％，所述的對啤酒酵母的最低抑菌濃度則為1-10％。
本發(fā)明的制備方法具有操作及工藝路線簡單，設(shè)備少，成本低等優(yōu)點。本發(fā)明通過抑菌實驗，證明褐藻膠寡糖無論對革蘭氏陰性菌或陽性菌，都能有效抑制其生長，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性；通過動物急性炎癥實驗，證明褐藻寡糖具有抗炎作用和一定的鎮(zhèn)痛作用。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例1褐藻膠寡糖按下列方法制備的取粘均分子量為12.8萬的褐藻膠固體5.0g，用2.5％的醋酸溶液配成1.25％的褐藻膠溶液400mL，當(dāng)溫度在60℃、pH值為4.0值時，用150Hz的超聲波在功率為80％的條件下，進行超聲波降解8小時，其降解液加入無水乙醇進行醇析，抽濾，烘干，研磨即得褐藻膠寡糖4.6g。其平均聚合度為8。
實施例2褐藻膠寡糖按下列方法制備的取粘均分子量為12.8萬的褐藻膠固體12.0g，用2.5％的醋酸溶液配成3.0％的褐藻膠溶液400mL，當(dāng)溫度為80℃，pH值為3.0時，用150Hz的超聲波在功率為80％的情況下，進行超聲波降解10小時，其降解液加入無水乙醇進行醇析，抽濾，烘干，研磨即得褐藻膠寡糖10.5g。其平均聚合度為10。
下面通過對實驗方法和實驗結(jié)果說明褐藻膠寡糖可作為天然的具有高效抑菌活性的抑菌劑使用做詳細敘述。
制備的褐藻膠寡糖抑菌實驗的篩選及效果評價方法如下以2.5％褐藻膠，2.5％苯甲酸鈉及生理鹽水為對照，研究2.5％褐藻膠寡糖溶液對枯草芽孢桿菌等細菌的抑菌效果。經(jīng)24h或72h培養(yǎng)后，觀察樣品液對不同菌種的抑制效果，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小，具體數(shù)值如下表褐藻膠寡糖對細菌的抑制效果(抑菌圈直徑，mm)

由表中可知，藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌圈次之。說明，褐藻膠寡糖對藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制作用最強，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長抑制作用次之。由此可看出褐藻膠寡糖對細菌的生長均有抑制作用。其中，對藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌抑制效果較明顯，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長抑制效果較次之。
同樣，以5％苯甲酸鈉和生理鹽水為對照，研究5％褐藻膠寡糖溶液對青霉等真菌的抑制作用，實驗數(shù)據(jù)如下表褐藻膠寡糖對真菌的抑制效果(抑菌圈直徑，mm)

由表中表明褐藻膠寡糖溶液對啤酒酵母稍有抑制作用外，對曲霉和青霉則無抑制效果。而對照組褐藻膠、苯甲酸鈉溶液和生理鹽水對細菌和真菌的生長均無抑制效果。
同時也考察了褐藻膠寡糖抑菌劑對細菌和真菌的最低抑菌濃度，實驗數(shù)據(jù)如下表褐藻膠寡糖對幾種微生物的最低抑菌濃度

得出對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的最低抑菌濃度僅為0.2-0.7％，對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度為0.5-2.5％，而對啤酒酵母的最低抑菌濃度則為1-10％。
總而言之，無論是革蘭氏陰性還是陽性菌，本發(fā)明中的褐藻膠寡糖作為抑菌劑都能有效抑制其生長，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。
通過建立以血管通透性為主要改變的動物急性炎癥模型來進一步說明褐藻膠寡糖對急性炎癥的抑制作用及效果。
1、褐藻膠寡糖對二甲苯致小鼠耳腫脹的消炎效果取小鼠50只，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只，暫養(yǎng)一段時間，待適應(yīng)環(huán)境后開始實驗。第1組頸背部皮下注射無菌生理鹽水，作為陰性對照組；第2組注射劑量為25mg/kg鼠體重的氫化可的松稀乙醇溶液，作為陽性對照組；第3、4、5組分別注射劑量為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg鼠體重的褐藻膠寡糖溶液，注射量為每只0.5ml。各組分別在實驗前一天給藥，實驗當(dāng)天各組給藥1.5h后，在每只小鼠右耳前后兩面分別均勻涂布二甲苯0.02ml致炎。致炎約1h后，將小鼠頸椎脫臼致死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑6mm打孔器分別在兩耳的同一部位打下圓耳片，稱重，精確到0.0001g。右耳片與左耳片的重量差即為腫脹度，腫脹抑制率計算公式如下抑制率(％)＝100×(對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/對照組平均腫脹度。腫脹厚度經(jīng)方差分析，比較給藥組和生理鹽水組組間差異。
2、褐藻膠寡糖對雞蛋清致大鼠足爪腫脹的消炎效果評價取大鼠21只，雌雄各半，隨機分為3組，每組7只，暫養(yǎng)一段時間。第1組右腹部皮下注射無菌生理鹽水，作為陰性對照組；第2組注射劑量為25ml/kg鼠體重的氫化可的松稀乙醇溶液，作為陽性對照組；第3組注射劑量為80mk/kg鼠體重的褐藻膠寡糖溶液，注射量為每只1.3ml。各組分別在實驗前一天給藥，實驗當(dāng)天各組給藥約2h后，在每只大鼠右后足跖注射10％新鮮雞蛋清0.1ml(生理鹽水配制)。于致炎后30min，1.5h，2.5h，4.5h用游標(biāo)卡尺測量足爪厚度，觀察厚度達到高峰時間和消退時間。以致炎前后足爪厚度的差值為腫脹厚度，厚度減少百分率作為抑制率，計算公式如下抑制率(％)＝100×(對照組平均腫脹厚度-給藥組平均腫脹厚度)/對照組平均腫脹厚度。腫脹厚度經(jīng)方差分析，比較給藥組和生理鹽水組間差異。
實驗結(jié)果表明所制備的褐藻膠寡糖能明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥反應(yīng)，對腫脹的抑制率呈明顯的劑量依賴關(guān)系，抑制作用隨劑量的增加而增加。當(dāng)褐藻膠寡糖劑量為100mg/kg時，抑制二甲苯致小鼠耳腫脹作用優(yōu)于劑量為25mg/kg的氫化可的松。褐藻膠寡糖對雞蛋清致大鼠足爪腫脹有抑制作用，總體效果低于氫化可的松，當(dāng)時間達到4.5h時，抑制率與氫化可的松相當(dāng)，抑制作用較持久。
總之，褐藻膠寡糖對動物急性炎癥模型具有抗炎作用和一定的鎮(zhèn)痛作用，為臨床研究提供了實驗依據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種褐藻膠寡糖的制備方法，其特征在于用超聲波對1-5％的褐藻膠溶液，在溫度40-80℃、pH值為2-5下降解7-10小時后，降解液加入無水乙醇進行醇析，抽濾，烘干，研磨即得褐藻膠寡糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種褐藻膠寡糖的制備方法，其特征在于所述的超聲波的頻率為150Hz。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種褐藻膠寡糖的制備方法，其特征在于所述的褐藻膠溶液是由褐藻膠固體與2.5％的醋酸溶液配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種褐藻膠寡糖的制備方法，其特征在于用該方法制備的褐藻膠寡糖，用作細菌或真菌的抑菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種褐藻膠寡糖的應(yīng)用，其特征在于所述的細菌可為藤黃微球菌或金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌或大腸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種褐藻膠寡糖的應(yīng)用，其特征在于所述的真菌為啤酒酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種褐藻膠寡糖的應(yīng)用，其特征在于所述的藤黃微球菌或金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的最低抑菌濃度僅為0.2-0.7％，對枯草芽孢桿菌最低抑菌濃度為2.5-0.5％。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種褐藻膠寡糖的應(yīng)用，其特征在于所述的啤酒酵母的最低抑菌濃度則為1-10％。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖類的制備及其應(yīng)用，特別涉及的是一種以褐藻膠為原料制備作為抑菌劑的褐藻膠寡糖的方法，特點是用超聲波對1－5％的褐藻膠溶液，在溫度40－80℃、pH值為2－5下降解7－10小時后，降解液加入無水乙醇進行醇析，抽濾，烘干，研磨即得褐藻膠寡糖，其平均聚合度10以下。本發(fā)明還提出將制備的褐藻膠寡糖，用作細菌或真菌的抑菌劑應(yīng)用。本發(fā)明通過抑菌實驗，證明褐藻膠寡糖無論對革蘭氏陰性菌或陽性菌，都能有效抑制其生長，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性；通過動物急性炎癥實驗，證明褐藻寡糖具有抗炎作用和一定的鎮(zhèn)痛作用。本發(fā)明的制備方法具有操作及工藝路線簡單，設(shè)備少，成本低等優(yōu)點。
文檔編號C08B37/04GK101074246SQ200610069060
公開日2007年11月21日 申請日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者張淑平, 胡佩紅, 卞永平, 李長青 申請人:尋山集團有限公司, 張淑平