氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及氨基寡糖素原藥的定性定量檢測(cè)方法，其特征在于包括氨基寡糖素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)、聚合度的檢測(cè)、pH值的檢測(cè)、水不溶物的檢測(cè)、灰分的檢測(cè)、水分的檢測(cè)。氨基寡糖素原藥以蝦蟹蝦殼為原料，經(jīng)去鈣、去蛋白、脫色、脫乙酰、分檢、粉碎制成的工業(yè)級(jí)氨基寡糖素，鑒別方法采用質(zhì)譜法、紅外光譜法和離子色譜法進(jìn)行。氨基寡糖素原藥聚合度測(cè)定采用樣品的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)法進(jìn)行檢測(cè)，氨基寡糖素含量的檢測(cè)方法包括淋洗液制備、標(biāo)樣溶液配制、樣品溶液配制和計(jì)算。該測(cè)定方法有效保證氨基寡糖素原藥產(chǎn)品質(zhì)量，維護(hù)生產(chǎn)、銷售和消費(fèi)者三方的權(quán)益。本發(fā)明的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度、靈敏度高，便于管理部門(mén)和用戶對(duì)氨基寡糖素原藥的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督和控制。
【專利說(shuō)明】氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氨基寡糖素作為一類重要的植物誘導(dǎo)抗病劑，來(lái)源于植物的寡聚糖的研究，是當(dāng)今糖生物學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，研究表明，氨基寡糖素在抵御病原菌侵蝕的過(guò)程中，能誘導(dǎo)激發(fā)植物產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng):1、產(chǎn)生一些合成抗毒素的蛋白酶，并積累對(duì)病原菌起拮抗作用的低分子量的次生物代謝產(chǎn)物，如植保素；2、誘導(dǎo)一些具有抗性的水解酶類和病程相關(guān)蛋白，這些蛋白直接抑制病原物生長(zhǎng)或釋放一些寡聚糖素(具有活性的寡聚糖)；3、積累一些特殊的，作為結(jié)構(gòu)組分的蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合在細(xì)胞表面并參與對(duì)病原物的限制作用。這些防御反應(yīng)協(xié)同作用阻止病原菌的傳播和入侵，達(dá)到防病治病的作用。同時(shí)，氨基寡糖素也是一類新的植物激素，具有調(diào)節(jié)和控制植物生長(zhǎng)發(fā)育等作用，它能發(fā)出調(diào)節(jié)特定植物功能的信息，這些功能包括促生長(zhǎng)、抗寒、抗旱等。
[0003]本檢測(cè)方法可有效保證產(chǎn)品質(zhì)量，維護(hù)生產(chǎn)、銷售和消費(fèi)者三方的權(quán)益，便于管理部門(mén)和用戶對(duì)氨基寡糖素原藥的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督和控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為有效保證氨基寡糖素原藥產(chǎn)品質(zhì)量，維護(hù)生產(chǎn)、銷售和消費(fèi)者三方的權(quán)益，本發(fā)明提供了氨基寡糖素原藥檢測(cè)方法，準(zhǔn)確度、靈敏度高，便于管理部門(mén)和用戶對(duì)氨基寡糖素原藥的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)督和控制。氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法，其特征在于包括氨基寡糖素聚合度的檢測(cè)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)、PH值的檢測(cè)、水不溶物的檢測(cè)、灰分的檢測(cè)、水分的檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明的氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法，其特征在于氨基寡糖素原藥以蝦蟹殼為原料，經(jīng)去鈣、去蛋白、脫色、脫乙酰、分檢、粉碎制成的工業(yè)級(jí)氨基寡糖素。
[0006]本發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于氨基寡糖素的鑒別采用質(zhì)譜法、紅外光譜法和離子色譜法進(jìn)行。
[0007]本發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于聚合度的測(cè)定采用樣品基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜儀自帶Bruker PolyTools數(shù)據(jù)處理軟件，進(jìn)行樣品數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(pd)和平均聚合度(DP)統(tǒng)計(jì)分析。
[0008]本發(fā)明的的檢測(cè)方法，其特征在于，氨基寡糖素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)方法包括試材:離子色譜儀、含醋酸鈉溶液作淋洗液、D-鹽酸氨基葡萄糖作標(biāo)樣。
[0009]本發(fā)明的檢測(cè)方法，其特征在于離子色譜法中，色譜儀為ICS-3000離子色譜儀，包含在線脫氣裝置的四元梯度泵、柱溫箱、ED3000電化學(xué)檢測(cè)器、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、Chrome I eon6.80色譜工作站。離子色譜法中的色譜條件為，分析柱為CarboPacTMPAlO,保護(hù)柱為CarboPacTMPAIOBioLCTM ;采用ED3000脈沖安培檢測(cè)，Au工作電極，Ag/AgCl參比電極模式，糖標(biāo)準(zhǔn)四電位，淋洗液為IOOmM NaOH和NaAc/H20=10:90，流速為1.0mL/min。[0010]離子色譜法的測(cè)定步驟如下:
[0011]1、淋洗液制備方法:在2L塑料試劑瓶中加入約ImL經(jīng)過(guò)0.4 μ m尼龍濾膜過(guò)濾的超純水，加入無(wú)水NaAcl6.4g，再移入50%Na0H溶液10.5mL至水面以下，然后加入超純水至2L,通氣氣保護(hù)后搖勾備用；
[0012]2、標(biāo)樣溶液配制方法:準(zhǔn)確稱取D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣2.8mg，置于IOmL容量瓶中，用超純水溶解并定容，用超純水對(duì)上述標(biāo)樣液進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋，配制系列濃度標(biāo)樣溶液，做為樣品水解后氨基葡萄糖含量檢測(cè)定量線繪制溶液；
[0013]3、樣品溶液配制方法:取IOmL帶聚四氟乙烯襯墊螺旋蓋的厚壁耐壓管I支，準(zhǔn)確稱取氨基寡糖原藥樣品約25mg加入其中,然后用移液管加入6.0mol/L鹽酸3.0mL,充分混勻后在管子里充入高純度氮?dú)獠⒐茏用芊?，然?00°C油浴下攪拌水解24h。冷卻到室溫后打開(kāi)螺旋蓋，將水解液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，用6mL蒸餾水分3次洗滌水解管的內(nèi)壁，合并到相應(yīng)蒸發(fā)皿中，在70°C烘箱中揮發(fā)至干。加5.0mL雙蒸水將蒸發(fā)皿中的固體溶解，并轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用5mL雙蒸水洗滌蒸發(fā)皿，液體并入到相應(yīng)的容量瓶中，再重復(fù)此步驟2次，用雙蒸水定容到50mL，稀釋100倍，得到待測(cè)氨基寡糖素水解溶液。
[0014]樣品溶液的計(jì)算方法，其特征在于，待儀器充分穩(wěn)定后，連續(xù)進(jìn)樣數(shù)針D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣溶液，計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值，待相鄰兩針的相對(duì)響應(yīng)值變化小于1.5%，進(jìn)行標(biāo)樣溶液的檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線做為氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線，當(dāng)線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.995，即進(jìn)行樣品溶液檢測(cè)。
[0015]氨基寡糖素樣品水解后溶液中氨基葡萄糖的濃度用方程I進(jìn)行計(jì)算:
[0016]方程1:C氨基葡萄糖=(峰面積_b) /a
[0017]其中:C氨基葡萄糖:樣品溶液中氨基葡萄糖的濃度；
[0018]峰面積:樣品溶液中氨基葡萄糖平行檢測(cè)峰面積的平均值；
[0019]a:氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線的斜率；
[0020]b:氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線的截距；
[0021]樣品中氨基寡糖素的質(zhì)量百分含量X (%)用方程2進(jìn)行計(jì)算:
[0022]方程2:
[0023]
【權(quán)利要求】
1.氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法，其特征在于包括氨基寡糖素聚合度的檢測(cè)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)、pH值的檢測(cè)、水不溶物的檢測(cè)、灰分的檢測(cè)、水分的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的氨基寡糖素原藥的檢測(cè)方法，其特征在于氨基寡糖素原藥以蝦蟹殼為原料，經(jīng)去鈣、去蛋白、脫色、脫乙酰、分檢、粉碎制成的工業(yè)級(jí)氨基寡糖素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其特征在于氨基寡糖素的鑒別采用質(zhì)譜法、紅外光譜法和離子色譜法進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的檢測(cè)方法，其特征在于聚合度的測(cè)定采用樣品基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF-MS)法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)質(zhì)譜儀自帶BrukerPolyTools數(shù)據(jù)處理軟件，進(jìn)行樣品數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、多分散性(pd)和平均聚合度(DP)統(tǒng)計(jì)分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的檢測(cè)方法，其特征在于，氨基寡糖素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)方法包括試材:離子色譜儀、含醋酸鈉溶液作淋洗液、D-鹽酸氨基葡萄糖作標(biāo)樣。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的檢測(cè)方法，其特征在于離子色譜法中，色譜儀為ICS-3000離子色譜儀，包含在線脫氣裝置的四元梯度泵、柱溫箱、ED3000電化學(xué)檢測(cè)器、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、Chrome I eon6.80色譜工作站。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的檢測(cè)方法，其特征在于離子色譜法中的色譜條件為，分析柱為CarboPacTMPAlO,保護(hù)柱為 CarboPacTMPAIOBioLCTM ;采用 ED3000 脈沖安培檢測(cè)，Au 工作電極，Ag/AgCl參比電極模式，糖標(biāo)準(zhǔn)四電位，淋洗液為IOOmM NaOH和NaAc/H20=10:90，流速為 1.0mT,/miη。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的檢測(cè)方法，其特征在于步驟如下: 淋洗液制備方法:在2L塑料試劑瓶中加入約ImL經(jīng)過(guò)0.4 μ m尼龍濾膜過(guò)濾的超純水，加入無(wú)水NaAcl6.4g,再移入50%Na0H溶液10.5mL至水面以下,然后加入超純水至2L,通氮?dú)獗Ｗo(hù)后搖勻備用； 標(biāo)樣溶液配制方法:準(zhǔn)確稱取D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣2.8mg,置于IOmL容量瓶中，用超純水溶解并定容，用超純水對(duì)上述標(biāo)樣液進(jìn)行準(zhǔn)確稀釋，配制系列濃度標(biāo)樣溶液，做為樣品水解后氨基葡萄糖含量檢測(cè)定量線繪制溶液； 樣品溶液配制方法:取IOmL帶聚四氟乙烯襯墊螺旋蓋的厚壁耐壓管I支，準(zhǔn)確稱取氨基寡糖原藥樣品約25mg加入其中,然后用移液管加入6.0mol/L鹽酸3.0mL,充分混勻后在管子里充入高純度氮?dú)獠⒐茏用芊猓缓?00°C油浴下攪拌水解24h。冷卻到室溫后打開(kāi)螺旋蓋，將水解液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，用6mL蒸餾水分3次洗滌水解管的內(nèi)壁，合并到相應(yīng)蒸發(fā)皿中，在70°C烘箱中揮發(fā)至干。加5.0mL雙蒸水將蒸發(fā)皿中的固體溶解，并轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中，用5mL雙蒸水洗滌蒸發(fā)皿，液體并入到相應(yīng)的容量瓶中，再重復(fù)此步驟2次，用雙蒸水定容到50mL，稀釋100倍，得到待測(cè)氨基寡糖素水解溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的檢測(cè)方法，其特征在于，待儀器充分穩(wěn)定后，連續(xù)進(jìn)樣數(shù)針D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣溶液，計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值，待相鄰兩針的相對(duì)響應(yīng)值變化小于1.5%，進(jìn)行標(biāo)樣溶液的檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線做為氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線，當(dāng)線性相關(guān)系數(shù)R2 > 0.995，即進(jìn)行樣品溶液檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的檢測(cè)方法，其特征在于，氨基寡糖素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法如下: 樣品溶液計(jì)算方法:制備D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣，計(jì)算回收率，作為原藥含量檢測(cè)的校正因子K ;在前述操作條件下，待儀器充分穩(wěn)定后，連續(xù)進(jìn)樣數(shù)針D-鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)樣溶液，計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值，待相鄰兩針的相對(duì)響應(yīng)值變化小于1.5%，進(jìn)行標(biāo)樣溶液的檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線做為氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線，當(dāng)線性相關(guān)系數(shù)R2 ^ 0.995，即進(jìn)行樣品溶液檢測(cè)； 氨基寡糖素樣品水解后溶液中氨基葡萄糖的濃度用方程I進(jìn)行計(jì)算: 方程1:c氨基葡萄糖=(峰面積_b) /a 其中:C氨基葡萄糖:樣品溶液中氨基葡萄糖的濃度； 峰面積:樣品溶液中氨基葡萄糖平行檢測(cè)峰面積的平均值； a:氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線的斜率； b:氨基寡糖素含量檢測(cè)定量線的截距； 樣品中氨基寡糖素的質(zhì)量百分含量X (%)用方程2進(jìn)行計(jì)算: 方程2:
【文檔編號(hào)】G01N27/64GK103913507SQ201310571452
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月16日
【發(fā)明者】曹立冬, 張善學(xué), 黃啟良, 吳軍, 文香玲 申請(qǐng)人:海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司, 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所