本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶法生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸。

背景技術(shù)：

5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-methylpyrazine-2-carboxylicacid)是一種重要的藥物中間體，主要用于合成第二代磺脲類降血糖藥格列吡嗪(glipizide)，新一代長(zhǎng)效降血脂藥阿昔莫司(acipimox)和治療結(jié)核病的有效藥物(pae)。

現(xiàn)有5-甲基吡嗪-2-羧酸的制備方法包括化學(xué)合成法、電化學(xué)合成法和生物合成法，其中化學(xué)合成法已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。

現(xiàn)行的化學(xué)合成法較多的是采用2,5-二甲基吡嗪為原料，經(jīng)雙氧水氧化得到n-氧代-2,5-二甲基吡嗪后與乙酸酐反應(yīng)生成2-乙酰氧甲基-5-甲基吡嗪，然后堿水解得到2-羥甲基-5-甲基吡嗪，最后通過(guò)高錳酸鉀氧化得到目標(biāo)產(chǎn)物。該方法收率較低且操作安全性低。

cn1141299c《用kmno4一步氧化制備5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法》公開(kāi)了一種用kmno4一步氧化制備5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。該方法以2.5-二甲基吡嗪為原料，在抑制劑的存在下，加入kmno4溶液反應(yīng)，熱過(guò)濾除去mno2的濾液經(jīng)濃縮，酸析，過(guò)濾得到部分5-甲基吡嗪-2-羧酸。這種方法由于制備過(guò)程中使用大量的高價(jià)金屬鹽，容易生成大量廢水，不符合現(xiàn)代化工的環(huán)保要求。

本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的高效生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種酶法生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸。

本發(fā)明首先保護(hù)特定蛋白質(zhì)在制備5-甲基吡嗪-2-羧酸中的應(yīng)用；

所述特定蛋白質(zhì)為如下(a1)或(a2)：

(a1)醛脫氫酶；

(a2)在(a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

所述標(biāo)簽見(jiàn)表1。

表1標(biāo)簽的序列

本發(fā)明還保護(hù)特定蛋白質(zhì)在以5-甲基-2-吡嗪醛為原料制備5-甲基吡嗪-2-羧酸中的應(yīng)用；

所述特定蛋白質(zhì)為如下(a1)或(a2)：

(a1)醛脫氫酶；

(a2)在(a1)的n端或/和c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。

以上任一所述醛脫氫酶是如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還保護(hù)一種5-甲基吡嗪-2-羧酸的制備方法，包括如下步驟：采用所述特定蛋白質(zhì)催化5-甲基-2-吡嗪醛轉(zhuǎn)化為5-甲基吡嗪-2-羧酸。

所述催化反應(yīng)體系由緩沖液、底物、特定蛋白質(zhì)和nad+組成。

所述緩沖液為0.5mtris-hcl(ph為8.0)。

所述底物為5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反應(yīng)體系中的濃度為20mm。

所述特定蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中的濃度為1000u/l。

所述nad+在反應(yīng)體系中的濃度為20mm。

所述催化反應(yīng)條件為30℃、200rpm反應(yīng)12h。

本發(fā)明還保護(hù)一種5-甲基吡嗪-2-羧酸的制備方法，包括如下步驟：

(1)將重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后收集菌體并進(jìn)行菌體破碎，然后收集上清液；所述重組菌為具有編碼所述特定蛋白質(zhì)的基因的重組菌；

(2)從步驟(1)得到的上清液中純化所述特定蛋白質(zhì)；

(3)采用步驟(2)得到的特定蛋白質(zhì)催化5-甲基-2-吡嗪醛轉(zhuǎn)化為5-甲基吡嗪-2-羧酸。

所述“編碼所述特定蛋白質(zhì)的基因”為如下(c1)-(c3)中任一所述的dna分子：

(c1)編碼區(qū)如序列表中序列1所示的dna分子；

(c2)在嚴(yán)格條件下與(c1)限定的dna序列雜交且編碼權(quán)醛脫氫酶的dna分子；

(c3)與(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼醛脫氫酶的dna分子。

所述重組菌是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)菌株得到的；所述重組質(zhì)粒為將pet21a(+)載體的ndei和xhoi酶切位點(diǎn)間的小片段替換為了序列表的序列1所示的雙鏈dna分子得到的重組質(zhì)粒；所述出發(fā)菌為大腸桿菌。所述出發(fā)菌具體可為大腸桿菌bl21(de3)。

所述步驟(1)中，所述“將重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)”具體為：將所述重組菌在含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液od600nm＝1-2；向培養(yǎng)體系中加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)。所述lb液體培養(yǎng)基中，氨芐青霉素的濃度為50μg/ml。所述培養(yǎng)條件為37℃、220rpm培養(yǎng)。所述iptg的濃度為30ppm。所述誘導(dǎo)的條件為30℃、220rpm誘導(dǎo)16h。

所述步驟(1)中，所述“收集菌體并進(jìn)行菌體破碎，然后收集上清液”具體為：收集菌體，用磷酸緩沖液重懸所述重組菌菌體后超聲，將超聲破碎產(chǎn)物離心后收集上清液。所述磷酸緩沖液為20mm(ph7.5)磷酸緩沖液。所述超聲的功率為250w，超聲時(shí)間為20min(超聲5s，停10s)。所述離心的條件為4℃、12000×g離心1h。

所述步驟(2)中，純化采用鎳柱(gehealthcarebio-scienceab，貨號(hào)：17-5248-01)和脫鹽柱(gehealthcarebio-scienceab，貨號(hào)：17-1408-01)實(shí)現(xiàn)。

所述步驟(3)中，所述催化反應(yīng)體系由緩沖液、底物、特定蛋白質(zhì)和nad+組成。

所述緩沖液為0.5mtris-hcl(ph為8.0)。

所述底物為5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反應(yīng)體系中的濃度為20mm。

所述特定蛋白質(zhì)在反應(yīng)體系中的濃度為1000u/l。

所述nad+在反應(yīng)體系中的濃度為20mm。

所述催化反應(yīng)條件為30℃、200rpm反應(yīng)12h。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括以上任一所述特定蛋白質(zhì)和5-甲基-2-吡嗪醛；所述試劑盒的用途為制備5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述試劑盒中還包括0.5mtris-hcl(ph為8.0)。所述試劑盒中還包括nad+。

本發(fā)明還保護(hù)一種試劑盒，包括以上任一所述重組菌和5-甲基-2-吡嗪醛；所述試劑盒的用途為制備5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述試劑盒中還包括0.5mtris-hcl(ph為8.0)。所述試劑盒中還包括nad+。

本發(fā)明首次利用特定的酶高效地實(shí)現(xiàn)了5-甲基吡嗪-2-羧酸的一步化生產(chǎn)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，所有原料和酶在一個(gè)反應(yīng)器內(nèi)一步反應(yīng)即可制備5-甲基-2-吡嗪酸，不涉及中間步驟和反應(yīng)，極大地簡(jiǎn)化了工藝流程，催化氧化反應(yīng)基本上不受產(chǎn)物5-甲基-2-吡嗪酸的抑制，高濃度的轉(zhuǎn)化可以獲得高收率，簡(jiǎn)化了提取工藝，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為pet21a-xylc質(zhì)粒圖譜。

圖2為5-甲基-2-吡嗪羧酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。

圖3為5-甲基-2-吡嗪羧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4為核磁共振碳譜(cnmr)圖。

圖5為核磁共振氫譜(hnmr)圖。

圖6為產(chǎn)物5-甲基-2-吡嗪羧酸結(jié)構(gòu)式。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

假單胞菌pseudomonasputida來(lái)源的xylc基因如序列表的序列1所示。假單胞菌pseudomonasputida來(lái)源的醛脫氫酶蛋白如序列表的序列2所示。序列1所示的基因編碼序列2所述的蛋白質(zhì)。

5-甲基-2-吡嗪醛：北京伊諾凱科技有限公司，cas：50866-30-3。

pet21a(+)質(zhì)粒：novagen，產(chǎn)品目錄編號(hào)：69740-3cn。

大腸桿菌bl21(de3)：天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)：cb105-02。

實(shí)施例1、高表達(dá)假單胞菌pseudomonasputida來(lái)源xylc基因的重組表達(dá)載體

采用序列表的序列1所示的雙鏈dna分子取代pet21a(+)質(zhì)粒的ndei和xhoi酶切位點(diǎn)間的小片段，得到重組表達(dá)載體pet21a-xylc(質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1)。

實(shí)施例2、醛脫氫酶的制備

1、將實(shí)施例1制備的重組表達(dá)載體pet21a-xylc轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌。重組菌表達(dá)可以得到c端融合有his6標(biāo)簽的醛脫氫酶蛋白。

2、將步驟1得到的重組菌接種于含有50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm培養(yǎng)至菌液od600nm＝1-2，向培養(yǎng)體系中加入30ppmiptg，30℃、220rpm誘導(dǎo)16h。

3、完成步驟2后，將培養(yǎng)體系8000rpm離心，收集菌體沉淀。

4、完成步驟3后，采用20mm(ph7.5)磷酸緩沖液重懸菌體后超聲，超聲功率為250w，超聲時(shí)間為20min(超聲5s，停10s)。

5、完成步驟4后，將超聲破碎產(chǎn)物4℃、12000×g離心1h后收集上清液。

6、對(duì)步驟5得到的上清采用鎳柱(gehealthcarebio-scienceab，貨號(hào)：17-5248-01)進(jìn)行純化，將上清液加載到鎳柱，依次采用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b洗脫，收集流動(dòng)相b的洗脫液；再對(duì)洗脫液采用脫鹽柱(gehealthcarebio-scienceab，貨號(hào)：17-1408-01)進(jìn)行脫鹽處理，采用流動(dòng)相c洗脫，最終得到純化后的蛋白溶液。

流動(dòng)相a：20mm(ph7.5)磷酸緩沖液(含20mm咪唑和0.5mnacl)；流動(dòng)相b：20mm(ph7.5)磷酸緩沖液(含200mm咪唑和0.5mnacl)；流動(dòng)相c：20mm(ph7.5)磷酸緩沖液。

7、對(duì)步驟6得到的純化后的蛋白溶液進(jìn)行蛋白定量，蛋白濃度為6.4mg/ml。

8、對(duì)步驟6得到的純化后的蛋白溶液進(jìn)行醛脫氫酶酶活力檢測(cè)；反應(yīng)體系中加入5-甲基-2-吡嗪醛、nad+和待測(cè)蛋白溶液1μl，h2o定容至1ml。5-甲基-2-吡嗪醛在反應(yīng)體系中的濃度為10mm，nad+在反應(yīng)體系中的濃度為5mm。

待測(cè)蛋白溶液：采用20mm(ph7.5)磷酸緩沖液將步驟6得到的蛋白溶液稀釋至濃度為1mg/ml。

采用分光光度計(jì)(儀器型號(hào)：uv-1800pc型)在線監(jiān)測(cè)5min后，根據(jù)nadh在340nm的消光系數(shù)(6.22cm^-1·mmol^-1)計(jì)算得到酶的比活力為5u/mg。

酶的比活力(u/mg)＝(od340nm×1000)/(6.22cm^-1·mmol^-1×1cm×5min×1mg·ml^-1×0.001ml)

實(shí)施例3、醛脫氫酶制備5-甲基-2-吡嗪羧酸

反應(yīng)體系(1ml)由緩沖液、底物、醛脫氫酶和nad+組成；緩沖液：0.5mtris-hcl(ph為8.0)；底物：5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反應(yīng)體系中的濃度為20mm；醛脫氫酶：實(shí)施例2步驟6得到的醛脫氫酶蛋白溶液，醛脫氫酶在反應(yīng)體系中的濃度為1000u/l；nad+在反應(yīng)體系中的濃度為20mm。

反應(yīng)條件：30℃、200rpm反應(yīng)12h。

反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系稀釋10倍后hplc檢測(cè)產(chǎn)物濃度。

hplc色譜條件：儀器型號(hào)：agilent1200series；色譜柱：nucleosil100c18，4.6×250mm，5μm；柱溫：25℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；采集時(shí)間：10min；進(jìn)樣量：5μl；流速：1.00ml/min；流動(dòng)相由a相和b相組成，a相為0.1％(體積百分含量)tfa水溶液，b相為乙腈，a相和b相的體積比為80:20。

采用5-甲基-2-吡嗪羧酸作為標(biāo)準(zhǔn)品(上海百舜生物科技有限公司，cas：5521-55-1)。

標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖2，5-甲基-2-吡嗪羧酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為3.776min；在相同條件下出峰位置為±0.5min以內(nèi)，可以認(rèn)定為同一物質(zhì)。

5-甲基-2-吡嗪羧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

收集5-甲基-2-吡嗪羧酸對(duì)應(yīng)的洗脫峰，通過(guò)核磁一步驗(yàn)證產(chǎn)物表征。

核磁共振碳譜(cnmr)圖見(jiàn)圖4。核磁共振氫譜(hnmr)圖見(jiàn)圖5。

經(jīng)過(guò)上述檢測(cè)，結(jié)果表明，產(chǎn)物為5-甲基-2-吡嗪羧酸(結(jié)構(gòu)式如圖6所示)；每個(gè)反應(yīng)體系底物消耗量為88％(約17.60mm)，得到產(chǎn)物5-甲基-2-吡嗪羧酸的量為17.02mm。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所

<120>一種酶法生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸

<160>2

<210>1

<211>1461

<212>dna

<213>假單胞菌(pseudomonasputida)

<400>1

atgcgggaaacaaaagagcagcctatctggtacgggaaggtgtttagttctaattgggta60

gaggcgcggggaggtgttgccaatgttgtcgatccgtccaatggagacattcttggcatt120

acgggtgttgctaacggcgaagatgtcgatgctgctgtgaacgcagctaagagagcgcaa180

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aaactaaaggagcgcgagtatgagttcgccgattggaacgtacgggaatgcggcgcaatt300

cgtccgaagggcttatgggaggccggaattgcgtatgagcaaatgcatcaagctgcgggt360

ctagcttctttgcctaacggtacattgtttccatcggcagttccagggcgcatgaatctt420

tgtcagcgcgttccagttggcgtggtcggcgtaattgcaccttggaatttcccgttgttt480

ctagcaatgcgttcggtagcaccagccttagcgttgggtaatgcggtgatcttaaagccc540

gaccttcagactgctgtcaccgggggggcgctcattgccgaaatcttttccgacgctggc600

atgccggacggtgttcttcacgttcttcctggtggagcggacgtaggagagtcaatggtt660

gcgaactccggaattaacatgatttcttttaccgggtccacacaggtgggccggttgatc720

ggagagaaatgcgggagaatgctgaaaaaggttgcgcttgaactgggtggtaataatgtc780

cacatcgtgttgcctgacgccgatttagaaggggctgtcagctgcgctgcttggggtacg840

tttttgcatcagggccaagtgtgcatggccgccggacgtcatttagtacatagggacgtt900

gctcagcaatatgcagagaaactggcgctacgtgccaagaacttagtggtgggggaccca960

aactcggatcaagtgcatctcggcccgcttatcaatgagaaacaggtagttcgcgtccac1020

gcgctcgttgaatctgcgcaaagggccggtgctcaggttttggcgggaggtacgtatcaa1080

gatcgctactaccaagctaccgtaatcatggatgtgaagccggagatggaggttttcaaa1140

tctgaaattttcggcccggtggctccgatcactgtatttgacagtattgaagaggcgatt1200

gaattggcaaactgttcggagtatgggttggccgcatctatccatactagggcgttggcg1260

actggtctagacatcgcaaagcgtctaaataccggtatggtccatattaatgaccagcca1320

attaactgtgagccgcatgttcccttcggaggaatgggtgcctcgggtagcggaggccgg1380

tttggcggacctgcaagtattgaagaatttactcaatctcaatggattagtatggttgag1440

aagccagctaattacccattt1461

<210>2

<211>487

<212>prt

<213>假單胞菌(pseudomonasputida)

<400>2

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151015

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202530

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354045

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65707580

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859095

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100105110

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145150155160

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

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355360365

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450455460

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465470475480

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485