本發(fā)明屬于油脂的多不飽和脂肪酸提取和穩(wěn)態(tài)化處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

共軛亞油酸是指一系列含有共軛雙鍵的亞油酸的多種幾何異構(gòu)體與位置異構(gòu)體混合物的總稱，在自然界中含量較少，主要存在于瘤胃動(dòng)物，如牛、羊的乳脂及肉制品中，植物油和其它的非反芻動(dòng)物中也存在一部分，海產(chǎn)食品中含量很少。大量的研究結(jié)果證實(shí)，共軛亞油酸具有抑制癌癥和腫瘤的形成、減肥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善免疫功能、降低膽固醇及促進(jìn)生長(zhǎng)等多種生物活性。同時(shí)，研究表明，多不飽和脂肪酸具有調(diào)節(jié)多種營養(yǎng)代謝性疾病的功能，在預(yù)防和治療代謝綜合癥、肥胖癥及ⅱ型糖尿病等方面有重要作用。如γ-亞麻酸對(duì)降低膽固醇具有特殊功能；二十二碳六烯酸(dha)和二十碳五烯酸(epa)可降低血小板凝聚，減低血脂，改善血液流動(dòng)性，預(yù)防冠心??；dha有健腦功能，對(duì)提高記憶力、防止大腦衰老有特殊作用，并有抗癌效果等。

目前，大多數(shù)富集共軛亞油酸的研究集中在以大豆油、紅花油和蓖麻油等植物油為原料，采用酶解法或堿法異構(gòu)的方式對(duì)共軛亞油酸進(jìn)行富集。乳脂和動(dòng)物脂肪也可以作為共軛亞油酸的天然來源，尤其是乳脂，除共軛亞油酸外，同時(shí)還富含其他多不飽和脂肪酸，脂肪酸結(jié)構(gòu)更加合理。因此，可以考慮從動(dòng)植物油脂、乳脂等不同原料中提取富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸，提取并富集后的共軛亞油酸有顯著降低血脂、預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝等脂代謝紊亂疾病的作用。但由于共軛亞油酸及其他多不飽和脂肪酸含有雙鍵，容易受到光、熱和氧氣等環(huán)境因素的影響而發(fā)生氧化，產(chǎn)生不愉悅的“哈喇味”，從而失去其商業(yè)和營養(yǎng)價(jià)值，甚至產(chǎn)生對(duì)人體有害的反式脂肪酸，損害其生理功效，因此需要采取一定措施將提取后的共軛亞油酸和其他多不飽和脂肪酸進(jìn)行穩(wěn)態(tài)化處理，如微膠囊化和乳狀液的制備等，并同時(shí)提高了多不飽和脂肪酸的生物利用率。

現(xiàn)有的一種從核桃油中提取共軛亞油酸的方法為：170～180℃條件下，加入丙二醇和naoh催化劑，通入高純氮?dú)?，?dāng)堿完全溶解后，用移液管在冷凝管加入核桃油，反應(yīng)2.8h，得到共軛亞油酸，產(chǎn)率大于80％?，F(xiàn)有的一種共軛亞油酸微膠囊制備的方法為：按共軛亞油酸:變性食用淀粉:水＝1:1:3，經(jīng)混合乳化、均質(zhì)、噴霧干燥后得到共軛亞油酸微膠囊。

現(xiàn)有共軛亞油酸提取方法的主要不足為原材料利用率低、共軛亞油酸的提取效率低。此外，在諸多的已有技術(shù)中，尚未見有以不同乳脂為原料制備富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的制備及其應(yīng)用。具體技術(shù)方案為：

一種富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)向油脂中加入脂肪酶進(jìn)行酶解，然后終止反應(yīng)，冷卻至室溫，得到混合脂肪酸；

(2)采用尿素包合法富集上述混合脂肪酸中的多不飽和脂肪酸；

(3)以上述多不飽和脂肪酸為原料，聯(lián)合使用超臨界co2萃取法和堿異構(gòu)法富集共軛亞油酸，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸。

步驟(1)中所述油脂為乳脂、動(dòng)物脂肪或植物油的一種或一種以上。

所述乳脂為牛乳、牦牛乳、山羊乳、綿羊乳、水牛乳、駱駝乳等；動(dòng)物脂肪為豬油、羊油、馬油等；植物油為大豆油、紅花油、茶籽油、玉米油、胡麻油、葵花油、花生油、芝麻油等。

步驟(1)中所述脂肪酶用中性緩沖溶液溶解，脂肪酶的加入量為100-1000u/g油脂。

步驟(1)中所述酶解的條件為：40-60℃恒溫磁力攪拌器中反應(yīng)2-6h；終止反應(yīng)采用離心除去脂肪酶、過濾除去脂肪酶或加入乙醇的方式。

步驟(2)中所述尿素包合法富集多不飽和脂肪酸的具體步驟為：向95％乙醇中加入尿素，在60-90℃條件下攪拌混合均勻，待尿素完全溶解后加入步驟(1)得到的混合脂肪酸，混合均勻，在60-90℃條件下加熱回流15-60min，使溶液呈均勻透明相，然后在-50℃-4℃條件下包合2-24h，完成后真空抽濾，濾液離心除去殘留結(jié)晶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，之后靜置分層，收集油相并水洗至中性，加入食品脫水劑進(jìn)行干燥，過濾后得到多不飽和脂肪酸。

所述95％乙醇與尿素(v/m)的比例為5:1-1:1，尿素與混合脂肪酸(m/m)的比值為1:1-5:1。

步驟(3)中所述聯(lián)合使用超臨界co2萃取法和堿異構(gòu)法富集共軛亞油酸的具體步驟為：使用超臨界co2流體反應(yīng)與萃取裝置，以步驟(2)得到的多不飽和脂肪酸為原料，加入催化劑、溶劑和夾帶劑，在溫度40-100℃，壓力10-40mpa，co2流量5-20l/h的條件下，反應(yīng)2-5h，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸。

所述催化劑為氫氧化鈉或氫氧化鉀，添加量為多不飽和脂肪酸質(zhì)量的20％-40％；溶劑為水，多不飽和脂肪酸與水的質(zhì)量比為1:1-1:3；夾帶劑為無水乙醇，添加量為體系總體積的10％-20％。

一種富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的微膠囊，其制備方法包括如下步驟：

(1)按照質(zhì)量比，阿拉伯膠:酪蛋白:β-環(huán)糊精＝1-10:1-10:1-20、印度樹膠:阿拉伯膠:大豆分離蛋白＝1-5:1-5:3-15、阿拉伯膠:麥芽糊精:脫脂乳粉＝1-5:1-5:2-10或豌豆?jié)饪s蛋白:麥芽糊精＝1:1-1:5，在50-70℃，ph6.0-8.0的條件下制備成質(zhì)量濃度為5％-20％的壁材水溶液；

(2)以富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸為囊芯，按壁材囊芯質(zhì)量比2:1-10:1添加到上述壁材水溶液中，使固形物質(zhì)量含量為20-50％，用高剪切分散乳化機(jī)在8000rpm條件下剪切乳化2-5min，然后在30-50℃，20-45mpa條件下均質(zhì)；

(3)對(duì)上述均質(zhì)后的乳液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度180-250℃，出口溫度80-120℃，保證連續(xù)進(jìn)料，進(jìn)料速率為200-500ml/h，噴霧壓力為0.2-0.5mpa，風(fēng)速為5-30l/min，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的微膠囊。

一種富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的乳狀液，其制備方法包括如下步驟：

(1)將乳化劑溶于水中，在40-60℃恒溫磁力攪拌器中攪拌均勻，4℃水合過夜后恢復(fù)至室溫，得到乳化劑溶液；將多糖溶于水中，充分?jǐn)嚢杷希缓笈c乳化劑溶液混合；

(2)在40-60℃條件下向上述乳化劑和多糖的混合溶液中加入富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸，10000-26000rpm條件下高速剪切乳化2-5min，在5-60mpa條件下均質(zhì)1-3次，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的乳狀液。

步驟(1)中所述乳化劑為單一乳化劑或復(fù)合乳化劑，乳化劑質(zhì)量含量為0.1-5％；所述多糖質(zhì)量含量為0.05-2％；步驟(2)中富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的添加量為乳化劑和多糖混合溶液質(zhì)量的5-40％。

所述單一乳化劑為乳清蛋白、酪蛋白酸鈉、大豆蛋白或脂肪球膜蛋白；復(fù)合乳化劑為乳清蛋白:酪蛋白酸鈉＝1:1(質(zhì)量比)、脂肪球膜蛋白:酪蛋白酸鈉＝1:1(質(zhì)量比)或大豆蛋白:酪蛋白酸鈉＝1:1(質(zhì)量比)；多糖為卡拉膠、黃原膠、羧甲基纖維素、果膠、殼聚糖或巖藻多糖任意一種。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明先使用脂肪酶對(duì)油脂進(jìn)行處理，提高了脂肪酸的含量；然后通過尿素包合法處理，提高了多不飽和脂肪酸的含量；再通過聯(lián)合使用超臨界co2萃取法和堿異構(gòu)法，更大程度富集了共軛亞油酸，最終得到了富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸，其共軛亞油酸含量高達(dá)90％以上，同時(shí)含有其他多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸、dha、epa等，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)更加合理。

2、動(dòng)植物油脂及乳脂都是天然的富含共軛亞油酸的資源，使用這些原料富集共軛亞油酸等多不飽和脂肪酸，營養(yǎng)豐富，安全性高。

3、采用制備微膠囊或乳狀液的方法對(duì)富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸進(jìn)行穩(wěn)定化處理，提高了產(chǎn)品的貯藏穩(wěn)定性，貯藏期可達(dá)24個(gè)月，同時(shí)提高了多不飽和脂肪酸的生物利用率，更有利于人體消化吸收。

4、本發(fā)明制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸具有明顯降低血液中膽固醇含量、甘油三酯含量的作用，可以預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝等脂代謝紊亂疾病，為乳源多不飽和脂肪酸降脂活性的研究和深度開發(fā)利用乳脂資源提供理論基礎(chǔ)，對(duì)于多不飽和脂肪酸作為降脂活性成分生產(chǎn)降脂保肝產(chǎn)品具有實(shí)際意義，為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但不僅限于本發(fā)明。

實(shí)施例1：從牦牛乳稀奶油中提取富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸

(1)取適量的牦牛乳稀奶油固體，在37℃條件下加熱得到液態(tài)的牦牛乳稀奶油；將脂肪酶candidaantarcticalipaseb(novozyme435)用中性緩沖溶液(磷酸氫二鈉磷酸二氫鈉緩沖液，ph＝7.0)溶解，按酶用量1000u·g^-1加入到上述牦牛乳稀奶油中，在50℃恒溫磁力攪拌器中反應(yīng)4h，通過抽濾的方式除去脂肪酶以終止反應(yīng)，冷卻至室溫，得到含有混合脂肪酸的混合物；

(2)按照95％乙醇:尿素＝3:1的比例，在60℃條件下攪拌混合均勻，待尿素完全溶解后按尿素:混合脂肪酸＝3:1的比例加入步驟(1)得到的含有混合脂肪酸的混合物，混合均勻，在60℃條件下加熱回流30min，使溶液呈均勻透明相，冷卻至室溫，在4℃條件下包合20h，取出后真空抽濾，濾液離心除去殘留結(jié)晶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，然后濾液中加入正己烷萃取油相，合并油相并水洗至中性，加入食品脫水劑進(jìn)行干燥，過濾后得到多不飽和脂肪酸；

(3)以步驟(2)得到的多不飽和脂肪酸為原料，在koh:油＝1:3，油水比為1:2的條件下，以無水乙醇作為夾帶劑，夾帶劑用量為15％，在反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)壓力25mpa，co2流量10l/h的條件下，反應(yīng)3h，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸，共軛亞油酸的質(zhì)量含量達(dá)到91.0％，同時(shí)產(chǎn)品中花生四烯酸、dha、epa含量分別為0.21％、0.09％、0.13％。

實(shí)施例2：富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸微膠囊的制備

(1)按阿拉伯膠:酪蛋白:β-環(huán)糊精＝3:1:4的比例，在50℃，ph7.0的條件下制備成濃度為5％-20％的壁材水溶液；

(2)以紅花油為原料，按照實(shí)施例1中的步驟及參數(shù)制備不飽和脂肪酸，將制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸作囊芯，按壁材囊芯質(zhì)量比7:3添加到上述壁材水溶液中，使固形物質(zhì)量含量達(dá)到40％，用高剪切分散乳化機(jī)在8000rpm條件下進(jìn)行剪切乳化2min，然后在45℃，25mpa條件下均質(zhì)；

(3)對(duì)上述均質(zhì)后的乳液進(jìn)行噴霧干燥，進(jìn)口溫度230℃，出口溫度80℃，保證連續(xù)進(jìn)料，進(jìn)料速率為300ml/h，噴霧壓力為0.3mpa，風(fēng)速為15l/min，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸微膠囊。

得到的微膠囊粉末顆粒流動(dòng)性好，無異味，溶解性好。對(duì)上述制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸微膠囊進(jìn)行貯藏期內(nèi)理化指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)24個(gè)月內(nèi)產(chǎn)品的過氧化值均小于0.2g/100g，酸價(jià)值小于2.5mg/gkoh，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，說明其氧化穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例3：富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸乳狀液的制備

(1)選擇乳清蛋白和酪蛋白酸鈉復(fù)合使用作為乳化劑，二者比例為1:1，總添加量為2％，將乳清蛋白和酪蛋白酸鈉溶于水中，在50℃恒溫磁力攪拌器中攪拌均勻，4℃水合過夜，后恢復(fù)至室溫；將卡拉膠按1％質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶于水中，充分?jǐn)嚢杷虾笈c乳化劑溶液混合，攪拌均勻；

(2)以羊油為原料，按照實(shí)施例1中的步驟及參數(shù)制備不飽和脂肪酸，在50℃條件下向乳化劑和多糖的混合溶液中加入制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸，添加量為乳化劑和多糖混合溶液質(zhì)量的10％，16000rpm條件下高速剪切乳化3min，在40mpa條件下均質(zhì)2次，得到富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸乳狀液。

使用納米粒徑及電位分析儀對(duì)得到的乳狀液進(jìn)行測(cè)定，乳狀液平均粒徑為451.20±7.11nm，d50值為355.50±10.06nm，zeta電位為-85.23±0.93mv，粒徑較小且zeta電位的絕對(duì)值遠(yuǎn)大于30mv，說明乳狀液非常穩(wěn)定。在常溫及4℃條件下放置7天，并未發(fā)生分層現(xiàn)象。對(duì)24個(gè)月貯藏期內(nèi)乳狀液中油脂理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)24個(gè)月內(nèi)產(chǎn)品的過氧化值均小于0.2g/100g，酸價(jià)值小于2.5mg/gkoh，符合國家標(biāo)準(zhǔn)，說明其氧化穩(wěn)定性良好。

將乳狀液與胰脂酶、膽汁混合物混合，使胰脂酶和膽汁混合物的終濃度達(dá)到1.6和5.0mg/ml，混合物在37℃放置4小時(shí)，體外模擬腸道吸收，并測(cè)定消化過程中游離脂肪酸的釋放率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳狀液的制備可以提高游離脂肪酸的釋放率，在消化至240min時(shí)可以達(dá)到89.51％，而未經(jīng)乳液包埋的不飽和脂肪酸產(chǎn)品游離脂肪酸釋放率為85.45％。因此，說明乳液的包埋有利于不飽和脂肪酸的消化吸收。

實(shí)施例4：制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸的降脂活性檢測(cè)

1.體外實(shí)驗(yàn)

在3t3-l1前脂肪細(xì)胞0-7天分化過程中，加入100μm富含共軛亞油酸的牦牛乳脂多不飽和脂肪酸，結(jié)果表明，其可以減少分化過程中細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量，減少細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積。使用棕櫚酸(pa)作用于肝癌細(xì)胞hepg2，建立肝細(xì)胞脂肪堆積的細(xì)胞模型。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)50μm富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸預(yù)培養(yǎng)24h的細(xì)胞內(nèi)脂滴變小，脂質(zhì)積累減少。

2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

選用spf級(jí)c57bl/6雌性小鼠60只，體重為20±0.5g，按組間體重均衡原則隨機(jī)分成3組：基礎(chǔ)對(duì)照組、高脂對(duì)照組、富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸干預(yù)組，每組20只。對(duì)基礎(chǔ)對(duì)照組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，對(duì)其余2組小鼠飼喂高脂飼料。6周后，發(fā)現(xiàn)與高脂對(duì)照組相比，富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸干預(yù)組小鼠血清總膽固醇含量、甘油三酯含量分別降低了0.53、0.20mmol/l；低密度脂蛋白膽固醇含量也發(fā)生明顯下降，降低了0.16mmol/l。說明富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清中總膽固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白膽固醇含量升高有抑制作用。此外，富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸干預(yù)組小鼠的體脂肪重、肝臟重均顯著低于高脂對(duì)照組，肝臟指數(shù)變小，且白色脂肪細(xì)胞體積變小。

上述活性檢測(cè)結(jié)果說明，按本發(fā)明制備的富含共軛亞油酸的多不飽和脂肪酸確實(shí)具有顯著降低血液中膽固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白含量的作用，可以預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝等脂代謝紊亂疾病。