本發(fā)明屬于細(xì)胞治療領(lǐng)域，涉及一種能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

cik(cytokine-inducedkillercells)中文全稱為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，是將人外周血單核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。其既具有t淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有nk細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非mhc(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。cik細(xì)胞具有腫瘤殺傷活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，臨床上已經(jīng)有大量的病例證實(shí)其腫瘤殺傷活性。

pd-1(程序性死亡受體)是一種表達(dá)于t細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)分子，當(dāng)pd-1與其配體pd-l1或pd-l2結(jié)合時(shí)可抑制下游nf-κb基因的轉(zhuǎn)錄，抑制干擾素-γ的分泌，從而抑制t細(xì)胞的殺傷活性。pd-l1或pd-l2表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌以及尿路上皮癌等腫瘤組織。t細(xì)胞表面的pd-1與表達(dá)于腫瘤細(xì)胞上的pd-l1或pd-l2結(jié)合所引起的t細(xì)胞細(xì)胞毒活性抑制是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視和殺傷的重要機(jī)制之一。采用pd-1抗體或pd-l1抗體阻斷pd-1與pd-l1、pd-l2的結(jié)合，可使t細(xì)胞的腫瘤殺傷活性不受抑制，從而提高t細(xì)胞殺腫瘤的效果。研究證實(shí)，采用pd-1單抗靜脈輸注治療惡性黑色素瘤、肺鱗癌、霍奇金氏淋巴瘤、結(jié)腸癌及腎癌等腫瘤收到良好的治療效果。然而，靜脈輸注pd-1抗體所需抗體量大，成本很高；同時(shí)血液成分、淋巴組織微環(huán)境等成分會影響pd-1抗體與t細(xì)胞表面pd-1的結(jié)合。

rna干擾(rnainterference,rnai)是真核細(xì)胞中存在的一種rna降解機(jī)制。當(dāng)病原感染真核細(xì)胞或者采用人為的方法將雙鏈rna(doublestrandrna,dsrna)導(dǎo)入到真核細(xì)胞后，這些雙鏈rna被rnaseiii家族的成員dicer加工成21-23bp的雙鏈干擾rna(shortinterferingrna,sirna)。每個(gè)sirna隨后被整合到rna誘導(dǎo)的干擾復(fù)合體中(risc)，該蛋白復(fù)合體可以將sirna靶向到與其互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄本的響應(yīng)序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的切割、降解或者轉(zhuǎn)錄抑制。小rna(microrna,mirna)是一種可以誘導(dǎo)基因沉默的內(nèi)源性rna，它大概22bp長，可以通過rnai通路來誘導(dǎo)基因沉默。不同于短發(fā)夾rna(shrna)，mirna經(jīng)常以簇的形式被一個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼，該轉(zhuǎn)錄本可能有幾kb長并含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其表達(dá)由rna聚合酶ii啟動。柄環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-mirna由核rnaseiiidrosha降解成70bp左右的前體mirna(pre-mirna)，該前體mirna由exportin-5從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿。隨后前體mirna被dicer處理成22bp左右的成熟mirna，然后被整合入含有mirna的ran誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體。成熟的mirna通過對mrna切割或者翻譯抑制來調(diào)控基因的表達(dá)。靶基因的切割可以通過人為改變靶基因或者mirna的序列來完全互補(bǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的制備能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞制劑的方法，具體可包括如下步驟：

(a)利用細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)pbmc分化為cik；

(b)向步驟(a)所得cik中轉(zhuǎn)入能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體，培養(yǎng)后收獲細(xì)胞，從而制得所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞制劑；

所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體上含有多個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因；所述多個(gè)為2-30個(gè)。

進(jìn)一步，所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體為慢病毒載體。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體上含有13個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因；所述13個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因具體分別如下：

(1)mirna-pd1-244：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；

(2)mirna-pd1-373：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；

(3)mirna-pd1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；

(4)mirna-pd1-791：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；

(5)mirna-pd1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；

(6)mirna-pd1-811：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；

(7)mirna-pd1-818：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；

(8)mirna-pd1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；

(9)mirna-pd1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；

(10)mirna-pd1-1466：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；

(11)mirna-pd1-1483：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；

(12)mirna-pd1-1697：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；

(13)mirna-pd1-1960：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示。

更加具體的，所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體的序列為序列表中序列1或序列2所示。

在所述方法的步驟(a)中，所述“利用細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)pbmc分化為cik”為利用cd3mab/cd28mab磁珠、ifn-γ和il-2誘導(dǎo)pbmc分化為cik。所述cd3mab/cd28mab磁珠的用量為1-2個(gè)磁珠/個(gè)pbmc；所述ifn-γ的用量為400-1200iu/ml體系；所述il-2的用量為250-900iu/ml體系。

在所述方法的步驟(b)中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為自轉(zhuǎn)入所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體后培養(yǎng)12天。

在本發(fā)明中，所述方法具體可包括如下步驟：

(1)將pbmc用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整濃度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成pbmc細(xì)胞懸液；所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中含有終濃度為300iu/ml的il-2，以及終濃度為1000iu/ml的ifn-γ。

(2)將步驟(1)的pbmc細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有cd3mab/cd28mab磁珠的t-175培養(yǎng)瓶中，總體積50ml，并添加ifn-γ、il-2。

進(jìn)一步，所述cd3mab/cd28mab磁珠的用量為1-2個(gè)磁珠/個(gè)pbmc。所述cd3mab/cd28mab磁珠為invitrogen公司產(chǎn)品，貨號為402.03d。

進(jìn)一步，添加后，所述ifn-γ的終濃度為1000iu/ml；所述il-2的終濃度為300iu/ml。

(3)培養(yǎng)第3天，將所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體(全載體序列如序列表中序列1或序列2所示)電轉(zhuǎn)入細(xì)胞；電轉(zhuǎn)之后，添加含有ifn-γ和il-2的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

其中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)時(shí)，細(xì)胞濃度為10⁷-10⁹/ml，所用載體量為1-10μg/100μl細(xì)胞。所述含有ifn-γ和il-2的無血清培養(yǎng)基中ifn-γ的終濃度為1000iu/ml，il-2的終濃度為300iu/ml。

(4)培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加200ml所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，并加入與細(xì)胞數(shù)量相同的所述cd3mab/cd28mab磁珠。

(5)每隔兩天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并補(bǔ)加相應(yīng)體積的所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液，使得細(xì)胞密度基本不變。

(6)培養(yǎng)第15天，離心收獲細(xì)胞，即為所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik。

利用所述方法制備得到的能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞制劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述cik細(xì)胞制劑在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(1)制備治療腫瘤的產(chǎn)品；

(2)制備用于殺傷腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。

本發(fā)明還保護(hù)能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體。

本發(fā)明所提供的能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體為含有多個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因的慢病毒載體；所述多個(gè)為2-30個(gè)。

具體的，所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體上含有13個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因；所述13個(gè)串聯(lián)的靶向pd-1的mirna的編碼基因具體分別如下：

(1)mirna-pd1-244：核苷酸序列如序列表中序列1的第2391-2449位或序列2的第3146-3204位所示；

(2)mirna-pd1-373：核苷酸序列如序列表中序列1的第2529-2587位或序列2的第3284-3342位所示；

(3)mirna-pd1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第2667-2725位或序列2的第3422-3480位所示；

(4)mirna-pd1-791：核苷酸序列如序列表中序列1的第2805-2863位或序列2的第3560-3618位所示；

(5)mirna-pd1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第2943-3001位或序列2的第3698-3756位所示；

(6)mirna-pd1-811：核苷酸序列如序列表中序列1的第3081-3039位或序列2的第3836-3894位所示；

(7)mirna-pd1-818：核苷酸序列如序列表中序列1的第3219-3277位或序列2的第3974-4032位所示；

(8)mirna-pd1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第3357-3415位或序列2的第4112-4170位所示；

(9)mirna-pd1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第3495-3553位或序列2的第4250-4308位所示；

(10)mirna-pd1-1466：核苷酸序列如序列表中序列1的第3633-3691位或序列2的第4388-4446位所示；

(11)mirna-pd1-1483：核苷酸序列如序列表中序列1的第3771-3829位或序列2的第4526-4584位所示；

(12)mirna-pd1-1697：核苷酸序列如序列表中序列1的第3909-3967位或序列2的第4664-4722位所示；

(13)mirna-pd1-1960：核苷酸序列如序列表中序列1的第4047-4105位或序列2的第4802-4860位所示。

更加具體的，所述能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的載體的序列為序列表中序列1或序列2所示。

所述載體在制備所述cik細(xì)胞制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明采用pcdh-mir質(zhì)粒表達(dá)人工設(shè)計(jì)的13個(gè)靶向pd-1的串聯(lián)mirna，并將該質(zhì)粒導(dǎo)入cik細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該質(zhì)粒可以大大降低cik細(xì)胞中內(nèi)源pd-1的表達(dá)水平，從而顯著的提高了cik細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。

附圖說明

圖1為pcdh-mirna-pd1及pcdh-mirna-pd1-gfp載體在cik細(xì)胞中對pd1的干擾作用。

圖2為流式檢測pcdh-mirna-pd1載體對cik細(xì)胞中pd1的敲低作用。

圖3為流式檢測pcdh-mirna-pd1-gfp載體對cik細(xì)胞中pd1的敲低作用。

圖4為流式驗(yàn)證cik、cik-pcdh-mirna-pd1、cik-pcdh-mirna-pd1-gfp三組細(xì)胞。

圖5為cik-pcdh-mirna-pd1及cik-pcdh-mirna-pd1-gfp細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞的制備與鑒定

一、能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞的制備

1、淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：含有終濃度為300iu/ml的il-2、終濃度為1000iu/ml的ifn-γ的無血清培養(yǎng)基。其中，所述無血清培養(yǎng)基為lonza公司產(chǎn)品，貨號為04-418q；所述il-2為peprotech公司產(chǎn)品，貨號為200-02；所述ifn-γ為peprotech公司產(chǎn)品，貨號為300-02。

2、采集健康人外周血(當(dāng)然如果采用絕大多數(shù)腫瘤患者的外周血也可以)，經(jīng)檢測無污染后，等體積生理鹽水稀釋，利用ficoll淋巴細(xì)胞分離液(所述ficoll淋巴細(xì)胞分離液的密度為1.077g/ml)將稀釋的外周血進(jìn)行單核細(xì)胞分離；分離得到的pbmc用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整濃度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成pbmc細(xì)胞懸液。

3、將步驟2的pbmc細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有cd3mab/cd28mab磁珠的t-175培養(yǎng)瓶中，總體積50ml，cd3mab/cd28mab磁珠的用量為1-2個(gè)磁珠/個(gè)pbmc，并向培養(yǎng)瓶中添加ifn-γ至其終濃度為1000iu/ml，添加il-2至其終濃度為300iu/ml。其中，所述cd3mab/cd28mab磁珠為invitrogen公司產(chǎn)品，貨號為402.03d。

4、培養(yǎng)第3天，采用celetrix公司的電轉(zhuǎn)儀將pd-1干擾質(zhì)粒(pcdh-mirna-pd1或者pcdh-mirna-pd1-gfp)電轉(zhuǎn)入細(xì)胞，電轉(zhuǎn)操作按照公司推薦的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行(進(jìn)行電轉(zhuǎn)時(shí)，細(xì)胞濃度為10⁷-10⁹/ml，所用載體量為1-10μg/100μl細(xì)胞)。電轉(zhuǎn)之后，添加含有終濃度為1000iu/ml的ifn-γ和終濃度為300iu/ml的il-2的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

其中，兩個(gè)pd-1干擾質(zhì)粒，pcdh-mirna-pd1和pcdh-mirna-pd1-gfp均含有13個(gè)靶向pd-1的串聯(lián)mirna的編碼基因。

pcdh-mirna-pd1載體的全序列如序列表中序列1所示。序列1的第234-414位為5’ltr；第458-583位為hiv-1ψ；第2004-2007位為cmvpromoter；第2391-2449位為mirna-pd1-244；第2529-2587位為mirna-pd1-373；第2667-2725位為mirna-pd1-716；第2805-2863位為mirna-pd1-791；第2943-3001位為mirna-pd1-801；第3081-3039位為mirna-pd1-811；第3219-3277位為mirna-pd1-818；第3357-3415位為mirna-pd1-904；第3495-3553位為mirna-pd1-988；第3633-3691位為mirna-pd1-1466；第3771-3829位為mirna-pd1-1483；第3909-3967位為mirna-pd1-1697；第4047-4105位為mirna-pd1-1960；第4238-4825位為wpre；第5193-5373位為3’ltr；第6940-7800位為ampr。

pcdh-mirna-pd1-gfp載體的全序列如序列表中序列2所示。第234-414位為5’ltr；第458-583位為hiv-1ψ；第2004-2007位為cmvpromoter；第2339-3058位為emgfp；第3146-3204位為mirna-pd1-244；第3284-3342位為mirna-pd1-373；第3422-3480位為mirna-pd1-716；第3560-3618位為mirna-pd1-791；第3698-3756位為mirna-pd1-801；第3836-3894位為mirna-pd1-811；第3974-4032位為mirna-pd1-818；第4112-4170位為mirna-pd1-904；第4250-4308位為mirna-pd1-988；第4388-4446位為mirna-pd1-1466；第4526-4584位為mirna-pd1-1483；第4664-4722位為mirna-pd1-1697；第4802-4860位為mirna-pd1-1960；第4993-5580位為wpre；第5948-6128位為3’ltr；第7695-8555位為ampr。

5、培養(yǎng)第7天，補(bǔ)加200ml所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(配方同上)，并加入與細(xì)胞數(shù)量相同的所述cd3mab/cd28mab磁珠。

6、每隔兩天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并補(bǔ)加相應(yīng)體積的所述淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(配方同上)，使得細(xì)胞密度基本不變。

7、培養(yǎng)第15天，離心收獲cik細(xì)胞。cik轉(zhuǎn)染了pcdh-mirna-pd1或者pcdh-mirna-pd1-gfp質(zhì)粒之后，分別記為cik-pcdh-mirna-pd1和cik-pcdh-mirna-pd1-gfp。

二、能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞的鑒定

1、驗(yàn)證步驟一最終所得細(xì)胞能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)

(1)westernblot檢測步驟一所獲得的cik細(xì)胞內(nèi)源pd-1表達(dá)。1500rpm離心收集未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的cik細(xì)胞、分別轉(zhuǎn)染pcdh-mirna-pd1和pcdh-mirna-pd1-gfp質(zhì)粒的cik細(xì)胞(即cik-pcdh-mirna-pd1和cik-pcdh-mirna-pd1-gfp)上清，細(xì)胞沉淀按照每10⁵個(gè)細(xì)胞加入100μlripa裂解液(配方：50mmtris，150mmnacl，1％(v/v)tritonx-100，1％(w/v)sodiumdeoxycholate，0.1％(w/v)sds)并吹打均勻，室溫裂解15分鐘，然后12000g離心5分鐘，取上清并加入sds-page上樣緩沖液，然后進(jìn)行sds-page電泳及westernblot分析，所用一抗為小鼠抗pd-1抗體(santacruzbiotechnology公司，貨號sc-73402)，二抗為hrp標(biāo)記兔抗小鼠igg(santacruzbiotechnology公司，貨號sc-358914)。

結(jié)果如圖1所示，由圖可見：cik轉(zhuǎn)染了pcdh-mirna-pd1或者pcdh-mirna-pd1-gfp質(zhì)粒之后，與cik對照相比，內(nèi)源性pd-1蛋白表達(dá)水平至少下降了95％以上。

(2)取上述步驟一收獲的cik、cik-pcdh-mirna-pd1、cik-pcdh-mirna-pd1-gfp各300μl放入1.5mlep管中，300g離心5分鐘，棄上清，加入500μl含有0.5％多聚甲醛的pbs懸浮細(xì)胞并室溫保持10分鐘。然后300g離心5分鐘，棄上清，加入300μlpbs，用移液器吹打并懸浮細(xì)胞，然后加入5μl相應(yīng)的熒光抗體，室溫避光孵育20分鐘之后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。所用熒光抗體apc-anti-humanpd-1antibody為biolegend公司產(chǎn)品，貨號為329953。

結(jié)果如圖2和圖3所示，由圖可見：cik轉(zhuǎn)染了pcdh-mirna-pd1或者pcdh-mirna-pd1-gfp質(zhì)粒之后，與cik對照相比，細(xì)胞表面表達(dá)的內(nèi)源性內(nèi)源性pd-1蛋白表達(dá)水平至少下降到了檢測不到的水平。

2、驗(yàn)證步驟一最終所得細(xì)胞為cik細(xì)胞

處理細(xì)胞步驟同上述1(2)中所述，所用熒光抗體pe-anti-cd8antibody、fitc-anticd4antibody、apc-anti-cd56antibody及percp-anti-cd3antibody為biolegend公司產(chǎn)品，貨號分別為300907、357405、362503、300325。

結(jié)果如圖4所示，cik、cik-pcdh-mirna-pd1、cik-pcdh-mirna-pd1-gfp三組細(xì)胞培養(yǎng)都獲得了成功，cd8⁺細(xì)胞超過80％，cd4⁺細(xì)胞不超過20％，cd56⁺細(xì)胞超過50％。三組細(xì)胞的分子表型類似，因此只給出了cik-pcdh-mirna-pd1的結(jié)果。

實(shí)施例2、實(shí)施例1制備的能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果檢測

首先將人腫瘤細(xì)胞系skov3接種到艾森活細(xì)胞檢測站的細(xì)胞培養(yǎng)板上，12小時(shí)之后，待細(xì)胞貼壁生長，加入一定數(shù)量的cik、cik-pcdh-mirna-pd1、cik-pcdh-mirna-pd1-gfp細(xì)胞，形成不同的效靶比。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，檢測各種cik細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。

結(jié)果如圖5所示，由圖可見：轉(zhuǎn)染了pcdh-mirna-pd1或pcdh-mirna-pd1-gfp質(zhì)粒的cik細(xì)胞對腫瘤的殺傷活性顯著提高。

<110>北京瑞健科技有限公司

<120>能敲低內(nèi)源性pd-1表達(dá)的cik及其制備方法與應(yīng)用

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