專利名稱：與有義構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)期望多核苷酸的表達(dá)的用途相組合的、sirna實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因的減量調(diào)節(jié) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組合的用途，S卩，靶向基因的SiRNA敲低或敲除該內(nèi)源基因的表達(dá)的用途以及編碼外源基因的多核苷酸影響該基因的表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
相對(duì)近來地，研究人員注意到雙鏈RNA( “dsRNA”)可以用于抑制蛋白質(zhì)表達(dá)。沉默基因的這種能力具有用于治療人類疾病的廣大潛力，當(dāng)前許多研究人員和商業(yè)實(shí)體在開發(fā)基于這種技術(shù)的治療方面投注了相當(dāng)大的資源。雙鏈的RNA誘導(dǎo)的基因沉默可以在至少三種不同的水平上發(fā)生(i)轉(zhuǎn)錄滅活，這是指RNA指導(dǎo)的DNA或組蛋白甲基化；(ii) siRNA誘導(dǎo)的mRNA降解；和(iii)mRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄減弱。一般認(rèn)為的是，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA誘導(dǎo)的沉默(RNA干擾，或RNAi)的主要機(jī)制是mRNA降解。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中利用RNAi的初步嘗試集中于利用dsRNA的長鏈。然而， 誘導(dǎo)RNAi的這些嘗試獲得有有限的成功，部分是由于干擾素應(yīng)答的誘導(dǎo)，這引起蛋白質(zhì)合成的一般性抑制，與目標(biāo)特異性抑制相反。因而，長dsRNA不是哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中RNAi的可行的選擇。更近一些，已經(jīng)顯示的是，當(dāng)短(18_30bp)RNA雙螺旋被導(dǎo)入培養(yǎng)物中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA的序列特異性抑制而不誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答。這些短dsRNA 中的某一些，被稱為小抑制性RNA( “siRNA”)的，可以在亞摩爾濃度下催化性地起作用來裂解細(xì)胞中超過 95% 的目標(biāo)mRNA。在 Provost et al. (2002)Ribonuclease Activity and RNA Binding of Recombinant Human Dicer, EMBO J.21(21) :5864-5874 ；Tabara et al. (2002)The dsRNA Binding Protein RDE-4 Interacts with RDE-I, DCR-I and a DexH-box Helicase to Direct RNAi in C. elegans, Cell 109(7) :861-71 ；Ketting et al. (2002)Dicer Functions in RNA Interference and in Synthesis of Small RNA Involved in Developmental Timing in C. elegans ；Martinez et al. , Single-Stranded Antisense siRNAs Guide Target RNA Cleavage in RNAi,Cell 110(5) 563 ；Hutvagner & Zamore(2002)A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex,Science 297 2056中描述了 siRNA活性的機(jī)制的說明以及它的一些應(yīng)用。從機(jī)制的角度，長雙鏈RNA向植物和無脊椎動(dòng)物細(xì)胞中的導(dǎo)入被稱為Dicer的 III 型核酸內(nèi)切酶分解成 siRNA。Sharp, RNA interference-2001, Genes Dev. 2001,15 485. Dicer，一種核糖核酸酶-III樣酶，將dsRNA加工成19-23堿基對(duì)的短干擾RNA，其具有特征性的兩個(gè)堿基的 3'突出。Bernstein，Caudy，Hammond，& HannonQ001)Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference, Nature 409:363。siRNA然后摻入到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，其中一種或更多種解旋酶展開siRNA雙螺旋，允許互補(bǔ)的反義鏈來指導(dǎo)目標(biāo)識(shí)別。Nykanen，Haley, & Zamore (2001) ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interferencepathway, Cell 107 :309.在結(jié)合到合適的目標(biāo)mRNA時(shí)，RISC內(nèi)的一種或更多種核酸內(nèi)切酶裂解目標(biāo)來誘導(dǎo)沉默。Elbashir，Lendeckel，& Tuschl QOO1)RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs, Genes Dev. 15 188, FIG. 1.干擾作用可以是長久持續(xù)的，可以在許多次細(xì)胞分裂之后檢測到。此外，RNAi展現(xiàn)了序列特異性。Kisielow，M. et al. (2002) Isoform-specific knockdown and expression of adaptor protein ShcA using small interfering RNA, J. Biochem. 363 :1-5.因而， RNAi機(jī)制可以特異性地敲低一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而不影響緊密相關(guān)的mRNA。這些性質(zhì)使得 siRNA成為抑制基因表達(dá)和研究基因功能和藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證的潛在有價(jià)值的工具。此外，對(duì)于(1)由基因的過量表達(dá)或錯(cuò)誤表達(dá)所引起的疾??；和( 由含有突變的基因的表達(dá)所導(dǎo)致的疾病，siRNA作為治療試劑是可能有用的。成功的siRNA依賴性基因沉默取決于許多因素。在RNAi中最具爭議的問題之一是siRNA設(shè)計(jì)、即，考慮使用的siRNA的序列的必需性的問題。在C. elegans和植物中的早期工作通過引入長的dsRNA繞過了設(shè)計(jì)的問題(參見，例如，F(xiàn)ire，A. et al. (1998)Nature 391 =806-811)。在這種原始的生物體中，長dsRNA分子被Dicer裂解成siRNA，從而產(chǎn)生可以潛在地覆蓋全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的雙螺旋的各種群體。雖然這些分子的一些部分是非功能性的(即，不誘導(dǎo)或很少誘導(dǎo)沉默)，一種或更多種可能具有潛力成為高度功能性的，從而沉默感興趣的基因并減少siRNA設(shè)計(jì)的必要性。令人遺憾地，由于干擾素應(yīng)答，這種相同的方法對(duì)于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)不是可用的。雖然這種效應(yīng)可以通過回避Dicer裂解步驟并直接導(dǎo)入 siRNA來繞過，這種策略帶有風(fēng)險(xiǎn)，即所選的siRNA序列可能是無功能的或半功能的。許多研究表述了 siRNA設(shè)計(jì)不是RNAi的關(guān)鍵要素的觀點(diǎn)。另一方面，本領(lǐng)域中的其它人開始探索通過注意siRNA的設(shè)計(jì)來使得RNAi更有效率的可能性。為了治療各種疾病或病癥，某些蛋白質(zhì)的增量調(diào)節(jié)是期望的，但這可能不是所需的全部。例如，可能需要SiRNA的組合使用來敲低或敲除內(nèi)源蛋白或不同蛋白質(zhì)的表達(dá)。本發(fā)明將滿足這種需求，并提供了治療癌癥、特別是多發(fā)性骨髓瘤的方法。癌癥，包括多發(fā)性骨髓瘤，是將會(huì)受益于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力的疾病。多發(fā)性骨髓瘤的常規(guī)的療法包括化學(xué)治療、干細(xì)胞移植、伴有干細(xì)胞移植的高劑量化學(xué)治療以及補(bǔ)救(salvage)療法?；瘜W(xué)治療包括用Thalomid (沙利度胺)、bortezomib、Aredia (pamidronate)、類固醇和hmeta (唑來膦酸)治療。然而，許多化學(xué)治療藥物對(duì)于活躍地分裂的非癌細(xì)胞，例如骨髓、胃和腸的粘膜和毛囊的細(xì)胞是有毒的。因此，化學(xué)治療可能引起血細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低、惡心、嘔吐、腹瀉和脫發(fā)。常規(guī)的化學(xué)治療或標(biāo)準(zhǔn)劑量的化學(xué)治療一般是用于多發(fā)性骨髓瘤患者的主要的或初步的治療?；颊咭部赡芙邮芑瘜W(xué)治療作為高劑量化學(xué)治療和干細(xì)胞移植的預(yù)備。誘導(dǎo)療法(在干細(xì)胞移植之前的常規(guī)的化學(xué)治療)可以用于在移植之前降低腫瘤負(fù)荷。某些化學(xué)治療藥物比其它的更適合于誘導(dǎo)療法，因?yàn)樗鼈儗?duì)于骨髓細(xì)胞是較低毒性的，產(chǎn)生來自骨髓的更大的干細(xì)胞產(chǎn)量。適合于誘導(dǎo)療法的化學(xué)治療藥物的實(shí)例包括地塞米松、沙利度胺/地塞米松、VAD (組合的長春新堿、Adriamycin (多柔比星)和地塞米松)以及 DVd(組合的聚乙二醇化的脂質(zhì)體多柔比星(Doxil ，Caelyx⑧)、長春新堿和降低的日程地塞米松)。多發(fā)性骨髓瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療是與潑尼松(皮質(zhì)類固醇藥物)組合的米爾法蘭，實(shí)現(xiàn)50%的響應(yīng)率。令人遺憾地，米爾法蘭是烷化劑，不太適合于誘導(dǎo)療法。皮質(zhì)類固醇(特別是地塞米松)有時(shí)單獨(dú)用于多發(fā)性骨髓瘤治療，特別是在年長的患者和不能耐受化學(xué)治療的患者中。單獨(dú)地或與其它試劑組合地，地塞米松也用于誘導(dǎo)療法。VAD是最常用的誘導(dǎo)療法，但是DVd近年來顯示了在誘導(dǎo)療法中是有效的。近來Bortezomib已經(jīng)被批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療，但是它是非常有毒的。然而，現(xiàn)有療法都沒有提供治愈的顯著可能性。因而，仍然需要尋找用于癌癥和多發(fā)性骨髓瘤的適合的治療。本發(fā)明滿足了這種需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及靶向內(nèi)源基因的SiRNA來敲除或敲低宿主中內(nèi)源基因的表達(dá)、以及處在遞送運(yùn)載體/表達(dá)載體中編碼基因的多核苷酸向宿主遞送來提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主中的表達(dá)的組合用途。編碼正常(非缺陷的)蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)本身)的多核苷酸被施用給宿主，或被表達(dá)(對(duì)于所述多核苷酸來說)，從而所述正常蛋白質(zhì)可以進(jìn)行它的必需的功能。siRNA優(yōu)選地被設(shè)計(jì)以靶向基因的區(qū)域，從而它敲低或敲除缺陷蛋白質(zhì)的內(nèi)源表達(dá)，但同時(shí)不影響所施用的編碼正常蛋白質(zhì)的多核苷酸的外源表達(dá)。本發(fā)明提供了一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3'末端的eIF5Al siRNA、包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸的表達(dá)載體的復(fù)合物，其中所述突變體eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，和其中所述siRNA和所述表達(dá)載體復(fù)合到聚乙烯亞胺來形成復(fù)合物。本發(fā)明提供了包含靶向目標(biāo)基因來抑制受試者中目標(biāo)基因的內(nèi)源表達(dá)的siRNA、 以及編碼能夠在受試者中表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的組合物。在某些實(shí)施方式中，所述多核苷酸處在RNAI抗性質(zhì)粒中(將不被siRNA抑制)。所述siRNA和所述質(zhì)粒優(yōu)選地復(fù)合到聚乙烯亞胺來形成復(fù)合物。在某些實(shí)施方式中，所述siRNA具有附圖25中所示的序列，其中編碼突變體 eIF5Al的多核苷酸是eIF5AlK5°K。所述表達(dá)載體包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸和可操作連接的啟動(dòng)子，來提供在受試者中所述多核苷酸的表達(dá)。所述啟動(dòng)子優(yōu)選地是組織特異性的或全身性的。例如，如果所述組合物被用于治療癌癥，則優(yōu)選的，所述啟動(dòng)子是對(duì)癌癥存在的組織是組織特異性的。例如，對(duì)于治療多發(fā)性骨髓瘤，優(yōu)選的是使用B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，例如B29。在某些實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體包含pCpG質(zhì)粒。在某些實(shí)施方式中，eIF5Al siRNA和包含突變體eIF5Al多核苷酸的表達(dá)載體獨(dú)立地復(fù)合到聚乙烯亞胺，例如，in vivo JetPEI 。在其它實(shí)施方式中，eIF5Al siRNA和包含突變體eIF5Al多核苷酸的表達(dá)載體一起復(fù)合到聚乙烯亞胺。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含靶向eIF5Al的3'末端的eIF5Al siRNA和表達(dá)載體的組合物，所述表達(dá)載體包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸，其中所述突變體eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，其中所述siRNA和所述表達(dá)載體被遞送給受試者來治療癌癥。所述癌癥可以是任何癌癥，包括多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療癌癥的方法，包括向受試者(包括但不限于哺乳動(dòng)物和人類)施用本發(fā)明的組合物。所述組合物可以以任何可接受的途徑施用，例如但不限于，靜脈內(nèi)地、腹膜內(nèi)地、 皮下地或腫瘤內(nèi)地。siRNA和表達(dá)載體可以在不同的時(shí)間和經(jīng)由不同的途徑施用，或可以同時(shí)地經(jīng)由相同的途徑一起施用。例如，但不限于，siRNA可以裸露地或復(fù)合到載體如in vivo jetPEI經(jīng)由IV來遞送，表達(dá)載體可以腫瘤內(nèi)地施用，或者siRNA和表達(dá)載體可以都IV或腫瘤內(nèi)地施用，等等。本發(fā)明提供了抑制癌細(xì)胞生長和/或殺死癌細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了抑制或減慢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力的方法。抑制癌癥生長包括腫瘤的大小的降低、腫瘤的生長方面的降低，也可以包括腫瘤的完全緩解。癌癥可以是任何癌癥或腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸腺癌、膀胱癌、子宮頸腺癌和肺癌。優(yōu)選的，所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，eIF_5A是不能被羥丁賴氨酸化的突變體。在此描述了示范性的突變體。除了向受試者提供eIF_5A或編碼eIF_5A的多核苷酸(來提供eIF_5A的表達(dá)) 之外，提供siRNA來敲除或敲低eIF-5A的內(nèi)源表達(dá)。本發(fā)明還提供了 eIF5A、編碼eIF5Al的多核苷酸、針對(duì)eIF5Al的siRNA來制造治療患有多發(fā)性骨髓瘤的受試者中的acner殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的藥物的用途。優(yōu)選的， 編碼突變體eIF-5A的多核苷酸不能被羥丁賴氨酸化。本發(fā)明還提供了治療鐮狀細(xì)胞貧血的方法。編碼健康血紅蛋白基因(例如HBB)的多核苷酸被施用給患有鐮狀細(xì)胞貧血的患者。結(jié)合地，所述患者也施用siRNA，所述siRNA 靶向編碼缺陷血紅蛋白基因的基因(例如，編碼突變體HbS的基因)來敲低或敲除缺陷蛋白質(zhì)的表達(dá)。治療可以進(jìn)一步包括通常用于治療鐮狀細(xì)胞貧血的其它已知的藥物或治療的施用。附圖的簡要說明附

圖1提供了人類eIF_5Al的氨基酸序列，顯示了各個(gè)重要的位點(diǎn)。附圖2顯示了 eIF_5Al在K50和K67處的突變提高了轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)的積累。參見實(shí)施例1。附圖3顯示了 eIF5Al在K47、K50和K67處的突變提高了轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)的積累。 參見實(shí)施例2。附圖4顯示了在K50和K67處的eIF5Al的突變當(dāng)轉(zhuǎn)染到KAS細(xì)胞中時(shí)引起了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。參見實(shí)施例3。附圖5顯示了在K50和K67處的eIF5Al的突變當(dāng)轉(zhuǎn)染到KAS細(xì)胞中時(shí)引起了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。參見實(shí)施例4。附圖6顯示了在K60和K67處的eIF5Al的突變當(dāng)轉(zhuǎn)染到KAS細(xì)胞中時(shí)引起了細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。參見實(shí)施例5。附圖7A顯示了用siRNA轉(zhuǎn)染和用被修飾以表達(dá)eIF_5Al的腺病毒處理引起了 KAS 細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。參見實(shí)施例6A。附圖7B顯示了用eIF5Al siRNA(針對(duì)靶#1 (SEQ ID NO :1))(附圖25中顯示的siRNA構(gòu)建體的序列)的預(yù)處理降低了內(nèi)源eIF5Al的表達(dá)，但是容許腺病毒表達(dá)的RNAi抗性eIF5Ak5°A&積累。參見實(shí)施例6B。附圖7C顯示了在腺病毒感染之前用針對(duì)靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理降低人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中磷酸化的NF-κ B 的表達(dá)。參見實(shí)施例6C。附圖7D顯示了在腺病毒感染之前用針對(duì)靶#1的eIF5Al siRNA 預(yù)處理降低人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中磷酸化的NF- κ B和ICAM-I的表達(dá)。參見實(shí)施例6D。 附圖7E顯示了在人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中siRNA介導(dǎo)的eIF5A的抑制抑制了 LPS介導(dǎo)的 NF κ B DNA結(jié)合活性的誘導(dǎo)。eIF5A siRNA對(duì)NF κ B活性的抑制作用可以解釋當(dāng)與eIF5AK5°K 的過量表達(dá)組合時(shí)它提高細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的能力，因?yàn)镹F- κ B調(diào)節(jié)許多促-存活和抗細(xì)胞凋亡途徑。附圖7F顯示了用siRNA預(yù)處理KAS細(xì)胞通過在存在IL-6的情況下的eIF5AlK5°K 基因遞送提高了細(xì)胞凋亡。參見實(shí)施例6E。附圖8顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。參見實(shí)施例7。附圖9顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。參見實(shí)施例7。附圖10顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用降低了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的重量。參見實(shí)施例7。附圖11顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起了腫瘤收縮。參見實(shí)施例8。附圖12 顯示了靜脈內(nèi)(i. v.)的 eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)(i. t.)的 PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮。參見實(shí)施例9。附圖13A顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的治療延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起了腫瘤收縮。附圖1 顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用引起了腫瘤皺縮。附圖13C顯示了靜脈內(nèi)(i.v.)的eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)(i. t.)的PEI/ eIF5AlK5°K質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮。附圖14顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的靜脈內(nèi)共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。參見實(shí)施例10。附圖15顯示了靜脈內(nèi)(i. v.)的eIF5Al siRNA和靜脈內(nèi)(i. v.)或腹膜內(nèi)(i. p.) 的PEI/eIF5AlK5°K質(zhì)粒復(fù)合物的施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。參見實(shí)施例11。附圖16顯示了用eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA治療延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。附圖17顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起了腫瘤收縮。參見實(shí)施例12。附圖18 顯示了靜脈內(nèi)(i. v.)的 eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)(i. t.)的 PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮。參見實(shí)施例13。附圖19顯示了由EFl或似9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eIF5AlK5°K質(zhì)粒、與eIF5Al siRNA的共同施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起腫瘤收縮(KAS-SQ-5)。參見實(shí)施例14。附圖20顯示了 eIF5Al siRNA的共同施用提高了由EFl或B29啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eIF5AlK5°K質(zhì)粒對(duì)多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的抗腫瘤作用并產(chǎn)生了降低的腫瘤負(fù)荷 (KAS-SQ-5)。參見實(shí)施例15。附圖21顯示了 eIF5Al siRNA協(xié)同地提高肺腺癌細(xì)胞中源自Ad_eIF5A的感染的細(xì)胞凋亡。參見實(shí)施例16。附圖22顯示了 pExp5A的圖譜，其構(gòu)建在實(shí)施例17中描述。附圖23顯示了 pExp5A(3371bp)的預(yù)測的序列。參見實(shí)施例17。附圖M顯示了 6正5々^在各種細(xì)胞系中的重新表達(dá)。參見實(shí)施例18。附圖25顯示了優(yōu)選的eIF5Al siRNA的目標(biāo)序列和序列。附圖沈提供了多發(fā)性骨髓瘤中的效力研究的結(jié)果。參見實(shí)施例21。附圖27提供了多發(fā)性骨髓瘤中的效力研究的結(jié)果。參見實(shí)施例21。
附圖觀提供了 eIF5AlK5°K cDNA的序列。附圖四提供了人類eIF5Al相對(duì)于人類eIF5AlK5°K的比對(duì)。附圖30顯示了 DNA siRNA比例對(duì)HA-eIF5AK5°K表達(dá)的影響。參見實(shí)施例23。附圖31顯示了 DNA siRNA比例對(duì)納米顆粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。參見實(shí)施例對(duì)。附圖32 顯示了含有 eIF5AlK5°K 質(zhì)粒和 eIF5Al siRNA(siSTABLE 或非 siSTABLE)的 PEI復(fù)合物(N/P = 6或8)的施用抑制多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起腫瘤收縮。參見實(shí)施例25。附圖33顯示了 JET PEI 納米顆粒正被腫瘤組織有效地吸收，以及納米顆粒正將質(zhì)粒和siRNA遞送給同一細(xì)胞。參見實(shí)施例26。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及靶向內(nèi)源基因的SiRNA來敲除或敲低受試者中內(nèi)源基因的表達(dá)、以及處在遞送運(yùn)載體/表達(dá)載體中編碼所述基因的多核苷酸向受試者提供來提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在受試者中的表達(dá)的組合用途。這種組合在治療患有由于缺陷的或突變體蛋白質(zhì)的存在所引起的疾病或狀況的受試者中是有用的，即，其中在所述受試者中產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)不能進(jìn)行它必需的功能，或作為選擇，由于它的缺陷的結(jié)構(gòu)破壞代謝途徑或生物分子相互作用。所述siRNA被設(shè)計(jì)以靶向編碼缺陷蛋白質(zhì)的基因，并敲低或敲除該缺陷蛋白質(zhì)的表達(dá)。編碼正常(非缺陷)蛋白質(zhì)的多核苷酸被施用給該受試者，在該受試者中表達(dá)，從而可獲得正常蛋白質(zhì)來進(jìn)行它的必需的功能。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與施用編碼期望的蛋白質(zhì)的多核苷酸不同，所述蛋白質(zhì)被施用給受試者。術(shù)語蛋白質(zhì)、肽和多肽在此可互換地使用。SiRNA優(yōu)選地被設(shè)計(jì)以靶向基因的某些區(qū)域，從而它敲低或敲除缺陷蛋白質(zhì)的內(nèi)源表達(dá)，但同時(shí)不影響所施用的編碼正常蛋白質(zhì)的多核苷酸的外源表達(dá)。例如，siRNA可以靶向3' UTR，從而它不影響所施用的正義構(gòu)建體(編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸)的外源表達(dá)。 通過敲低或敲除缺陷基因的內(nèi)源表達(dá)，將有很少的或沒有缺陷蛋白質(zhì)與從外源多核苷酸表達(dá)的正常蛋白質(zhì)競爭。這種應(yīng)用將會(huì)有用的疾病狀態(tài)的一個(gè)實(shí)例涉及鐮狀細(xì)胞貧血。鐮狀細(xì)胞貧血是一種影響血紅蛋白的血液病癥，血紅蛋白是在紅細(xì)胞(RBC)中存在的、幫助攜帶氧氣貫穿身體的蛋白質(zhì)。當(dāng)人遺傳有引起突變體血紅蛋白(Hbs)的表達(dá)的兩個(gè)異常基因(每個(gè)親本獲得一個(gè))時(shí)，發(fā)生鐮狀細(xì)胞貧血。突變體血紅蛋白引起RBC改變形狀。具有正常血紅蛋白(血紅蛋白A，或HbA)的紅細(xì)胞容易在血流中移動(dòng)，將氧氣遞送給身體的所有細(xì)胞。它們可以容易地“擠”過甚至非常小的血管。由于血紅蛋白(HbQ的異常形狀傾向于凝集在一起，使得紅細(xì)胞有粘性、僵硬和更為脆性，使得它們形成彎曲的鐮刀形狀，發(fā)生鐮狀細(xì)胞貧血。雖然已知幾百種HBB基因變體，鐮狀細(xì)胞貧血最通常地由血紅蛋白變體HbS引起。 在這種變體中，疏水性的氨基酸纈氨酸代替了 HBB多肽鏈的第六氨基酸位置處的親水性的谷氨酸。這種取代產(chǎn)生了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的外側(cè)的疏水性部位，其粘附到鄰近的血紅蛋白分子的β鏈的疏水性區(qū)域上。HbS分子的這種凝集在一起(聚合化)成為剛性的纖維導(dǎo)致紅細(xì)胞的“鐮狀化”。僅在紅細(xì)胞釋放了它們攜帶到身體中的各個(gè)組織的氧氣分子之后發(fā)生聚合化。一旦紅細(xì)胞回到血紅蛋白可以結(jié)合氧氣的肺部，HbS分子的長纖維解聚或破裂成為單獨(dú)的分子。聚合化和解聚之間的循環(huán)導(dǎo)致紅細(xì)胞膜變得剛硬。這些紅細(xì)胞的剛性和它們不攜帶氧氣時(shí)的扭曲的形狀可能引起小的血管的阻塞。這種阻塞可能導(dǎo)致疼痛的發(fā)作并可能損傷器官。鐮狀細(xì)胞貧血是一種常染色體的隱性遺傳病癥。該疾病要表達(dá)，人必需遺傳有兩個(gè)HbS變體的拷貝，或HbS的一個(gè)拷貝和另一種變體的一個(gè)拷貝。具有正常的HBB基因 (HbA)的一個(gè)拷貝和HbS的一個(gè)拷貝的攜帶者被稱為具有鐮狀細(xì)胞性狀但是不表達(dá)疾病癥狀。因而，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了治療患有鐮狀細(xì)胞貧血的受試者的方法。靶向HBB基因的siRNA被施用給患者。所述siRNA被設(shè)計(jì)以敲低和優(yōu)選地敲除血紅蛋白的Hbs 變體的表達(dá)。編碼正常血紅蛋白的多核苷酸被提供給受試者，從而該受試者表達(dá)正常血紅蛋白。還設(shè)計(jì)了 siRNA，使得它不會(huì)影響編碼正常血紅蛋白的外源多核苷酸的表達(dá)。因而， 受試者不再產(chǎn)生變體血紅蛋白(或產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上很少的)，而是產(chǎn)生正常的健康血紅蛋白，產(chǎn)生正常地起作用的更為正常的紅細(xì)胞。在蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾，其引起或?qū)е录膊顟B(tài)的情況下，本發(fā)明也是有用的。 siRNA被用于敲低內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而沒有或很少的蛋白質(zhì)可用于翻譯后修飾。然后， 向患者提供編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸用于外源表達(dá)。蛋白質(zhì)被修飾，從而它不能被翻譯后修飾。然后，身體可獲得這種蛋白質(zhì)用于其合適的用途，但是將不導(dǎo)致疾病狀態(tài)，因?yàn)樗荒鼙环g后修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解不同的翻譯后修飾。例如，在翻譯之后，通過向蛋白質(zhì)附著其它生物化學(xué)官能團(tuán)，例如乙酸、磷酸、各種脂質(zhì)和碳水化合物，通過改變氨基酸的化學(xué)性質(zhì)(例如，瓜氨酸化)或通過產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變，例如形成二硫鍵，氨基酸的翻譯后修飾延伸了蛋白質(zhì)的功能范圍。同時(shí)，酶可以從蛋白質(zhì)的氨基末端除去氨基酸，或在中間切割肽鏈。例如，肽激素胰島素在二硫鍵形成之后被切割兩次，原肽從鏈的中部除去；產(chǎn)生的蛋白質(zhì)由通過二硫鍵連接的兩條多肽鏈組成。同樣，大多數(shù)初生的多肽以氨基酸甲硫氨酸開始， 因?yàn)閙RNA上的“起始”密碼子也編碼這個(gè)氨基酸。這個(gè)氨基酸通常在翻譯后修飾期間被除掉。其它修飾，如磷酸化，是控制蛋白質(zhì)的行為的常見機(jī)制的一部分，例如，活化或滅活一種酶。其它翻譯后修飾包括通過脫氧羥丁賴氨酸合酶(DHS)的真核起始因子5A(eIF5A)的羥丁賴氨酸化。因而，本發(fā)明提供了改變受試者中基因表達(dá)的方法，其中編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸被提供給患者并在所述患者中表達(dá)。所述蛋白質(zhì)可以是正常的/野生型蛋白質(zhì)或突變的蛋白質(zhì)。相應(yīng)的內(nèi)源基因的表達(dá)用施用給所述受試者的siRNA來抑制。所述方法進(jìn)一步包括提供包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的構(gòu)建體，其中所述多核苷酸在所述受試者中表達(dá)來產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。在內(nèi)源的基因表達(dá)缺陷蛋白質(zhì)的某些實(shí)施方式中，多核苷酸被設(shè)計(jì)以編碼正常的/健康的蛋白質(zhì)。施用siRNA來抑制缺陷內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)。在內(nèi)源基因表達(dá)正常的健康蛋白質(zhì)的某些實(shí)施方式中，多核苷酸被設(shè)計(jì)以編碼不能被翻譯后修飾的突變體蛋白質(zhì)，所述翻譯后修飾將對(duì)正常的/健康的或非突變體蛋白質(zhì)發(fā)生。施用siRNA來抑制內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而很少的這種蛋白質(zhì)可用于翻譯后
9修飾。在某些實(shí)施方式中，選擇或設(shè)計(jì)SiRNA來靶向基因的區(qū)域，從而不影響外源多核苷酸的表達(dá)。例如，siRNA可以靶向3' UTR或3'末端。SiRNA可以作為裸露的SiRNA或?qū)τ谘宸€(wěn)定化的裸露siRNA來遞送給患者。 siRNA可以全身地地注射，S卩，IP或IV。做為選擇，siRNA可以局部地注射或遞送到身體的期望的區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，siRNA可以在遞送運(yùn)載體中施用，例如但不限于枝狀聚合物、脂質(zhì)體或聚合物。編碼期望的蛋白質(zhì)的多核苷酸可以通過任何遞送方式施用，所述遞送方式提供或容許核苷酸的表達(dá)。術(shù)語多核苷酸和核苷酸在此可互換地使用。遞送可以通過任何病毒或非病毒的機(jī)制，例如，但不限于，質(zhì)粒、表達(dá)載體、病毒構(gòu)建體、腺病毒構(gòu)建體、枝狀聚合物 (dendrimer)、脂質(zhì)體或聚合物。在某些實(shí)施方式中，具有降低的CpG 二核苷酸的表達(dá)質(zhì)粒被用于表達(dá)所述多核苷酸?？梢允褂媚軌虼龠M(jìn)多核苷酸的表達(dá)的任何啟動(dòng)子，其可以根據(jù)治療所期望的應(yīng)用來選擇。例如，為了殺死多發(fā)性骨髓瘤，特異于B細(xì)胞的啟動(dòng)子可能是期望的，例如，人類B^啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。在其它實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以是其它組織特異性啟動(dòng)子，或可以是系統(tǒng)啟動(dòng)子。編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸可以通過IV或皮下注射或任何其它生物學(xué)適合的遞送機(jī)制來遞送。做為選擇，多核苷酸可以在脂質(zhì)體或提供了 DNA (或質(zhì)?；虮磉_(dá)載體)向目標(biāo)腫瘤或癌細(xì)胞的遞送的任何其它適合的“載體”或“運(yùn)載體”中遞送。合成的DNA遞送系統(tǒng)的綜述參見，例如，Luo，Dan，et al· ,Nature Biotechnology, Vol. 18, January 2000，pp. 33-37。 因而，可能優(yōu)選的是通過納米大小的運(yùn)載體，例如脂質(zhì)體、枝狀聚合物或類似的無毒的納米顆粒來遞送核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體。當(dāng)遞送有效量的核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體給受試者、 腫瘤或癌細(xì)胞時(shí)，運(yùn)載體優(yōu)選地保護(hù)所述核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體免于過早清除或引起免疫反應(yīng)。示范性的運(yùn)載體范圍可以從與核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體締合的簡單的納米顆粒到更復(fù)雜的聚乙二醇化的運(yùn)載體，例如，具有附著于其表面的配體以靶向特定細(xì)胞受體的聚乙二醇化的脂質(zhì)體。脂質(zhì)體和聚乙二醇化的脂質(zhì)體是本領(lǐng)域已知的。在常規(guī)的脂質(zhì)體中，要遞送的分子(即，小的藥物、蛋白質(zhì)、核苷酸或質(zhì)粒)被包含在脂質(zhì)體的中央腔中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，也存在某些對(duì)分子遞送有用的“秘密”，靶向的和陽離子的脂質(zhì)體。參見，例如， Hortobagyi, Gabriel N. , et al. , J. Clinical Oncology, Vol. 19, Issue 14(July)2001 3422-3433 and Yu, Wei, et al, Nucleic Acids Research. 2004,32(5) ；e48。脂質(zhì)體可以靜脈內(nèi)地注射，可以被修飾以使得它們的表面更具親水性(通過向雙分子層添加聚乙二醇 (“聚乙二醇化”)，這提高了它們在血流中的循環(huán)時(shí)間。這些被稱為“秘密”脂質(zhì)體，作為親水性(水溶性的)抗癌藥物例如多柔比星和米托蒽醌的載體是特別有用的。為促進(jìn)攜帶藥物的脂質(zhì)體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合性質(zhì)、特定分子如抗體、蛋白質(zhì)、肽等等可以附著到脂質(zhì)體表面上。例如，針對(duì)癌細(xì)胞上存在的受體的抗體可以用于將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞。對(duì)于靶向多發(fā)性骨髓瘤來說，例如，葉酸鹽、IL-6或轉(zhuǎn)鐵蛋白可以用于將脂質(zhì)體靶向到多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
枝狀聚合物也是本領(lǐng)域已知的，提供了優(yōu)選的遞送運(yùn)載體。枝狀聚合物的論述參見，例如，Marjoros, Istvan, J. , et al. , “ PAMAM Dendrimer-Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy :Synthesis,Characterization,禾口Functionality,〃 Bio macromolecules,Vol. 7, No. 2,2006 ；572-579,禾口Majoros,Istvan J. ,et al. , J. Med. Chem, 2005.48,5892-5899 ο在優(yōu)選的實(shí)施方式中，遞送運(yùn)載體包括聚乙烯亞胺納米顆粒。示范性的聚乙烯亞胺納米顆粒是 in vivo-jetPEI ，當(dāng)前由 Polyplus Transfection, Inc 生產(chǎn)。in vivo jetPEI 是作為DNA和siRNA遞送試劑有用的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑。來自Polyplus Transfection的in vivo-jetPEI 是提供了動(dòng)物中的可靠的核酸遞送的線性聚乙烯亞胺試劑。它被用于基因治療(Ohana et al. ,2004. Gene Ther Mol Bio 8:181-192 ；Vernejoul et al,2002. Cancer Research 62 :6124-31)、RNA 干擾(Urbain—Klein et al,2004. Gene therapy 23 1~6 ；Grezelinski et al. , 2006. Human Gene Therapy 17:751-66)禾口遺傳免疫接種(Garzon et al. ,2005. Vacine 23:1384-92)。in vivo JET-PEI 當(dāng)前作為癌癥基因治療的遞送載體在人類臨床試驗(yàn)中使用(Lemkine et al, 2002. Mol. Cell. Neurosci. 19 165-174)。in vivo-jetPEI 將核酸濃縮成大約50nm的納米顆粒，其是幾個(gè)小時(shí)穩(wěn)定的。作為這種獨(dú)特的保護(hù)機(jī)制的結(jié)果，與其它試劑相比，在注射之后的血細(xì)胞聚集被降低，從而防止了組織內(nèi)的有限擴(kuò)散、紅血球聚集和微栓化。這些納米顆粒是足夠小的以擴(kuò)散到組織中和通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。in vivo-jetPEI 有利于核酸從內(nèi)涵體釋放并轉(zhuǎn)移跨越核膜。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，siRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)粒通過in vivo-jetPEI 復(fù)合物施用給受試者。siRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)?？梢酝ㄟ^聚合物復(fù)合物，例如聚乙烯亞胺或in vivo jetPEI 復(fù)合物來復(fù)合在一起，或可以分別地復(fù)合到聚合物上。例如， 當(dāng)siRNA和包含多核苷酸的載體/質(zhì)粒要單獨(dú)地施用給受試者時(shí)(在時(shí)間上和/或遞送位點(diǎn)上單獨(dú)地)，優(yōu)選的是使siRNA和多核苷酸復(fù)合到不同的載體上。當(dāng)施用將是同時(shí)和同一位點(diǎn)時(shí)，可能優(yōu)選的是將siRNA和多核苷酸復(fù)合在一起。在另一個(gè)實(shí)施方式中，與施用質(zhì)?；蜉d體來遞送將要在受試者中表達(dá)的多核苷酸不同的是，蛋白質(zhì)本身被遞送給受試者。蛋白質(zhì)可以是分離的或可以是合成的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了在受試者，包括哺乳動(dòng)物和人類中治療癌癥的方法。治療癌癥包括但不限于誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡、殺死癌細(xì)胞、降低癌細(xì)胞的數(shù)量和降低腫瘤體積/重量。所述方法包括施用包含eIF5Al siRNA和編碼突變體eIF5Al的多核苷酸的組合物。組合物和eIF5Al siRNA和編碼突變體eIF5Al的多核苷酸將在下文討論。所有的細(xì)胞產(chǎn)生真核的起始因子5A( ‘‘eIF_5A”)(或在此也稱為“因子5A”)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生eIF-5Al的兩種同種型(eIF-5Al和eIF_5A2)。eIF_5Al被稱為細(xì)胞凋亡特異性eIF-5A，因?yàn)樗诮?jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)。人類eIF-5Al具有登記號(hào)碼NM 001970，在附圖1中示出。相信的是，eIF-5Al對(duì)編碼細(xì)胞凋亡所必需的蛋白質(zhì)的mRNA的核子集的穿出負(fù)責(zé)。eIF-5A2被稱為增殖eIF_5A，因?yàn)樗徽J(rèn)為對(duì)編碼細(xì)胞增殖所必需的蛋白質(zhì)的mRNA 的核子集的穿出負(fù)責(zé)。參見Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell,8,426a. Abstract No. 2476,37th American Society for Cell Biology Annual Meeting, and Rosorius et al. (1999)J. Cell Science,112,2369—2380。
兩種因子5A都被脫氧羥丁賴氨酸合酶(“DHS”)翻譯后修飾。DHS將eIF_5A羥丁賴氨酸化。羥丁賴氨酸，一種獨(dú)特的氨基酸，在所有檢查過的真核生物和古細(xì)菌中存在，但是不存在于真細(xì)菌中，eIF-5A是已知僅有的含有羥丁賴氨酸的蛋白質(zhì)。Park (1988) J. Biol. Chem.，263，7447-7449 ；Schumann & Klink(1989)System. Appl. Microbiol,11,103-107 ； Bartig et al. (1990)System. Appl. Microbiol, 13, 112-116 ；Gordon et al. (1987a) J. Biol. Chem. ,262,16585-16589。羥丁賴氨酸化的eIF_5A在兩個(gè)翻譯后步驟中形成第一步驟是由脫氧羥丁賴氨酸合酶催化的、亞精胺的4-氨基丁基部分向前體eIF-5A的特定賴氨酸的α-氨基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移形成脫氧羥丁賴氨酸殘基。第二步驟涉及這個(gè)4-氨基丁基部分被脫氧羥丁賴氨酸羥化酶羥基化形成羥丁賴氨酸。eIF5A的氨基酸序列在物種之間是充分保守的，在eIF_5A中圍繞羥丁賴氨酸殘基的氨基酸序列有嚴(yán)格的保守性，這表明這個(gè)修飾對(duì)于存活可能是重要的。Park et al. (1993)Biofactors,4,95-104.這種假說進(jìn)一步由以下觀察結(jié)果得到支持，迄今為止在酵母中發(fā)現(xiàn)的eIF-5A的兩種同種型的滅活，或催化它們的活化的第一步驟的DHS 基因的滅活阻斷了細(xì)胞分裂。Schnier et al. (1991)Mol Cell. Biol, 11,3105-3114 ； Sasaki et al. (1996)FEBS Lett. ,384,151-154 ；Park et al. (1998)J. Biol. Chem.，273， 1677-1683.然而，在酵母中eIF_5A蛋白質(zhì)的缺失僅導(dǎo)致總蛋白合成方面的小的下降，表明 eIF-5A可能是mRNA的特定子集的翻譯所需的，而不是蛋白質(zhì)全局合成所需的。Kang et al. (1993), “ Effect of initiation factor eIF_5A depletion on cell proliferation and protein synthesis, " in Tuite, M. (ed.)，Protein Synthesis and Targeting in Yeast,NATO Series H.新近的發(fā)現(xiàn)是，結(jié)合eIF_5A的配體共有高度地保守的基序，也支持了 eIF-5A 的重要性。Xu & Chen Q001) J. Biol. Chem.，276，2555-2561.此外，修飾的 eIF_5A 的羥丁賴氨酸殘基被發(fā)現(xiàn)對(duì)與RNA的序列特異性結(jié)合是必需的，結(jié)合不提供對(duì)核酶的防護(hù)。本發(fā)明人顯示了，當(dāng)編碼eIF_5A的多核苷酸被施用給細(xì)胞時(shí)，在那些細(xì)胞的細(xì)胞凋亡方面存在提高。他們顯示了，通過施用隨后在癌細(xì)胞中表達(dá)的eIF-5Al多核苷酸，他們能推動(dòng)癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡。參見共同待決申請10/200, 148 ；11/287, 460 ；11/293, 391 ；和 11/637，835，所有這些通過完全引用來合并在此。本發(fā)明人已經(jīng)另外確定了，當(dāng)細(xì)胞具有因子5A的羥丁賴氨酸化形式的建成時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入存活模式，不經(jīng)歷它們通常將會(huì)隨著時(shí)間的過去而遭遇的細(xì)胞凋亡。特別是，在癌細(xì)胞中，存在顯著數(shù)量的羥丁賴氨酸化的因子5A，因而，細(xì)胞不進(jìn)入細(xì)胞凋亡(不死亡)。因而，為了通過殺死癌細(xì)胞來治療癌癥(推動(dòng)癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡途徑)，編碼eIF-5Al的多核苷酸被施用給受試者或癌細(xì)胞或腫瘤，來提供eIF5Al的提高的表達(dá)，其轉(zhuǎn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腫瘤收縮。然而，如果人們僅提供編碼eIF-5Al蛋白質(zhì)的多核苷酸來增量調(diào)節(jié)eIF-5Al的基因表達(dá)，不使用siRNA來敲低eIF_5Al的內(nèi)源表達(dá)， 存在著兩派間的較量指導(dǎo)細(xì)胞朝向細(xì)胞凋亡途徑的eIF-5Al表達(dá)，與指導(dǎo)細(xì)胞朝向細(xì)胞存活途徑的羥丁賴氨酸化的因子5A的存在相競爭。本發(fā)明消除了這種較量，是對(duì)僅提高 eIF-5Al的表達(dá)的改進(jìn)。施用給受試者或細(xì)胞的多核苷酸被突變，從而產(chǎn)生的表達(dá)的蛋白質(zhì)不能被羥丁賴氨酸化。此外，因子5A的內(nèi)源表達(dá)用靶向eIF-5A的siRNA敲除或敲低，從而周圍沒有/很少的內(nèi)源eIF-5Al被羥丁賴氨酸化。因而，由于在細(xì)胞中沒有(或有基本上很少的)羥丁賴氨酸化eIF_5A，它們不被推入存活模式。突變的eIF_5Al的多核苷酸優(yōu)選地被突變，從而它不能被羥丁賴氨酸化，因而將不可用于驅(qū)動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入存活模式。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼eIF-5A的多核苷酸被突變，從而通常被DHS羥丁賴氨酸化的在位置50的賴氨酸(K)，被改變成丙氨酸(A)(其不能被羥丁賴氨酸化)。這個(gè)突變體被稱為K50A。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在位置67處的賴氨酸被改變成精氨酸(R)。這個(gè)突變體被稱為(K67R)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在位置67處的賴氨酸(K)被改變成丙氨酸(A)，被稱為(K67A)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在位置50處的賴氨酸(K)被改變成精氨酸(K50R)，另一個(gè)實(shí)施方式提供了位置47處的賴氨酸(K)被改變成精氨酸的突變體(K47R)。在其它實(shí)施方式中，使用雙突變體。一種雙突變體是其中在位置50處的賴氨酸 (K)被改變成精氨酸(R)，在位置67處的賴氨酸(K)被改變成精氨酸(R)。這個(gè)雙突變體被稱為K50R/K67R。這種雙突變體類似地不會(huì)被羥丁賴氨酸化，但是在氨基酸中的改變不會(huì)象單一突變(K50A) —樣那么多地改變eIF-5Al的3-D結(jié)構(gòu)。因而雙突變提供了一種在3-D形狀和折疊方面與野生型非常類似的蛋白質(zhì)，因而比單突變體更為穩(wěn)定。更為穩(wěn)定后，它在身體中存在更長時(shí)間來提供更久的治療效益。因而，身體將具有它為正常細(xì)胞功能所需的因子5A，但是將不能被羥丁賴氨酸化，從而細(xì)胞不被鎖定在細(xì)胞存活模式中而逃避細(xì)胞凋亡。另一種雙突變體是在位置47的賴氨酸(K)被改變成精氨酸(R)，在位置50處的賴氨酸被改變成精氨酸(R)。這個(gè)突變體被稱為(K47R/K50R)。本發(fā)明提供了另一種雙突變體，其中在位置50處的賴氨酸(L)被改變成丙氨酸(A)，在位置67處的賴氨酸被改變成丙氨酸(A)。這個(gè)突變體被稱為(K50A/K67A)。由于身體為了正常的細(xì)胞存活和健康的細(xì)胞增殖需要因子5A，優(yōu)選的是，如果 siRNA被全身地遞送，不使用siRNA完全關(guān)閉受試者中的表達(dá)。通過利用在關(guān)閉表達(dá)方面不那么好的siRNA (即，關(guān)小或降低表達(dá)，但不完全關(guān)閉表達(dá))，或作為選擇，利用給藥和/或治療方案來平衡表達(dá)水平，可以實(shí)現(xiàn)eIF-5A表達(dá)的控制，以容許健康細(xì)胞的正常生長和起作用，但是也推動(dòng)癌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡。做為選擇，人們可以利用siRNA的局部遞送。如果siRNA被局部地遞送給癌細(xì)胞或腫瘤，則優(yōu)選地，表達(dá)被敲除。通過敲除表達(dá)，周圍沒有可被羥丁賴氨酸化的因子5A，因而沒有羥丁賴氨酸化eIF-5A來鎖定細(xì)胞進(jìn)入存活模式。由于siRNA被局部地遞送給癌癥或腫瘤，不需要有eIF-5A可用于規(guī)則細(xì)胞的生長。在某些實(shí)施方式中，內(nèi)源基因是eIF5Al。靶向eIF5Al的siRNA被施用給受試者來抑制內(nèi)源eIF-5Al的表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，所述siRNA包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2，或是將會(huì)抑制內(nèi)源eIF-5Al的表達(dá)的、靶向eIF5Al的任何siRNA。在某些實(shí)施方式中，eIF5Al是人類eIF-5Al(在附圖1中示出)，受試者是人類。靶向人類eIF_5Al的其它 siRNA 是已知的，在共同待決申請 11/134，445 ； 11/287, 460 ；11/184, 982 ；11/293, 391 ； 11/725, 520 ；11/725, 470 ；11/637, 835中公開了。在其它實(shí)施方式中，受試者是哺乳動(dòng)物， eIF5Al是特異于所述哺乳動(dòng)物的。例如，受試者是狗，eIF5Al是犬eIF5Al。在某些實(shí)施方式中，siRNA基本上由附圖25中所示的siRNA構(gòu)建體組成。例如，所述siRNA含有靶向 eIF5Al的核酸，但是也含有突出物，例如U或T核酸，或還含有標(biāo)簽，例如his標(biāo)簽(常稱為 HA標(biāo)簽，其通常用于體外研究)。附著在5'或3'末端(或甚至如附圖25所示的核酸的連續(xù)串內(nèi)部，例如)的分子或其它核酸可以被包括，并且落入“基本上由……組成”之內(nèi)，只要siRNA構(gòu)建體能夠降低目標(biāo)基因的表達(dá)。優(yōu)選的，siRNA靶向eIF5Al基因的區(qū)域，從而不影響外源多核苷酸的表達(dá)。例如，eIF5Al siRNA靶向3' UTR或3'末端。附圖25中所示的siRNA是示范性的eIF5Al siRNA。多核苷酸編碼eIF5Al，其中所述多核苷酸被突變來編碼eIF5Al變體。設(shè)計(jì)突變的 eIF5Al，從而變體eIF5Al不能被翻譯后修飾(不能被羥丁賴氨酸化)。此處的上文中討論了示范性的突變體。對(duì)于涉及實(shí)體腫瘤的癌癥來說，期望的是直接將siRNA遞送到腫瘤。相對(duì)于多核苷酸的遞送時(shí)間和位點(diǎn)，siRNA可以單獨(dú)地施用，或可以在同時(shí)和/或在同一遞送位點(diǎn)一起施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，siRNA施用的時(shí)機(jī)可能必需是當(dāng)內(nèi)源蛋白質(zhì)被翻譯時(shí)施用， 而不是在內(nèi)源蛋白質(zhì)已經(jīng)產(chǎn)生之后。雖然本發(fā)明人早先顯示了 eIF5Al對(duì)正常的組織是無毒的(參見2005年11月觀日提交的待審申請No. 11/293, 391，通過完全引用將其合并在此)，遞送復(fù)合物(與 eIF5A多核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體的直接施用相比)可能是優(yōu)選的。優(yōu)選的遞送系統(tǒng)向受試者、腫瘤或癌細(xì)胞的群體提供有效量的eIF5Al，以及優(yōu)選地提供向腫瘤或癌細(xì)胞群體的靶向的遞送。因而，在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的是通過納米大小的運(yùn)載體，例如，脂質(zhì)體、枝狀聚合物或類似的無毒的納米顆粒，如聚乙烯亞胺聚合物(例如，in vivo JetPEI 復(fù)合物)來遞送eIF5Al核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體。eIF5Al蛋白質(zhì)也可以直接遞送到腫瘤的位點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定用于遞送eIF5Al蛋白質(zhì)的治療方案的劑量和時(shí)長。以下討論eIF5Al的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的分子基礎(chǔ)。死亡受體信號(hào)傳導(dǎo)用Ad_eIF5Al (具有野生型eIF5Al的腺病毒)或Ad_eIF5Al (K50A)處理癌細(xì)胞誘導(dǎo)了胱天蛋白酶8的活化，其是由死亡受體配體結(jié)合啟動(dòng)的，以及劊子手胱天蛋白酶——胱天蛋白酶3的活化。這些可能是eIF5Al的間接效應(yīng)，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶3在用不能被羥丁賴氨酸化的eIF5Al(K50A)處理之后也被活化的事實(shí)，表明所述效應(yīng)歸因于賴氨酸5QeIF5Al。如早先TNFRl的增量調(diào)節(jié)所顯示的，用Ad_eIF5Al處理似乎也產(chǎn)生死亡受體的增量調(diào)節(jié)。線粒體途徑賴氨酸5(leIF5Al在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中的直接或間接牽連得到許多觀察結(jié)果的支持，包括，胱天蛋白酶9通過用eIF5Al或eIF5Al (K50A)處理癌細(xì)胞被活化的發(fā)現(xiàn)。 同樣，在線粒體細(xì)胞凋亡途徑的活化中起作用的P53看起來受到eIF5Al的調(diào)節(jié)。例如，用放線菌素D處理癌細(xì)胞增量調(diào)節(jié)p53，這種p53的增量調(diào)節(jié)受到eIF5AlsiRNA的抑制。與這一致地，用Ad-eIF5Al處理癌細(xì)胞增量調(diào)節(jié)p53mRNA。用eIF5Al處理癌細(xì)胞也誘導(dǎo)Bax從胞質(zhì)液到線粒體的遷移，結(jié)果產(chǎn)生線粒體膜電勢的損失和細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)間隙向胞質(zhì)液的釋放。此外，這種處理引起裂解的Bcl2、Bim和剪接的Bim的增量調(diào)節(jié)，它們都是促細(xì)胞凋亡的。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)此外，本發(fā)明人獲得了 eIF5Al涉及與細(xì)胞凋亡相關(guān)的MAH(信號(hào)傳導(dǎo)的證據(jù)。例如，用Ad-eIF5Al處理癌細(xì)胞增量調(diào)節(jié)P-JNK，其隨后抑制抗細(xì)胞凋亡的Bcl2。此外， Ad-eIF5Al和Ad_eIF5Al (K50A)都誘導(dǎo)P_p38的形成，其隨后通過影響多種促細(xì)胞凋亡試劑，包括TNFRl & TNF;FAS & FASL ；胱天蛋白酶8 ;Bid ；細(xì)胞色素C和Capase3來啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。NF- κ B信號(hào)傳導(dǎo)有證據(jù)表明，NF-K B信號(hào)傳導(dǎo)支持了骨髓瘤生長。例如，骨髓瘤細(xì)胞對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的附著誘導(dǎo)IL-6的NF-K B依賴性轉(zhuǎn)錄的增量調(diào)節(jié)，其是多發(fā)性骨髓瘤中的生長和抗細(xì)胞凋亡因子[Chauhan et al. (1996)Blood 87，1104.]此外，骨髓瘤細(xì)胞分泌的TNF-α 活化骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的NF-K B，從而增量調(diào)節(jié)IL-6轉(zhuǎn)錄和分泌。TNF-α還活化骨髓瘤細(xì)胞中的NF-κ B，引起細(xì)胞內(nèi)粘附分子-KICAM-I ；⑶54)和血管細(xì)胞粘附分子_1 (VCAM-1 ； CD 106)在骨髓瘤細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞上的增量調(diào)節(jié)[Hideshima et al. (2001)Oncogene 20,4519]。這隨后增強(qiáng)了骨髓瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的締合[Hideshima et al. (2001) Oncogene 20,4519]。反之，這些效應(yīng)通過阻斷TNF α誘導(dǎo)的NF-κ B活化被抑制 [Hideshima et al. (2001) Oncogene 20，4519]。實(shí)際上，看起來可能的是，NF-κ B 介導(dǎo)了骨髓瘤細(xì)胞中針對(duì)TNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)[Hideshima et al. (2002) JBC 277,16639]。 這些和其它觀察結(jié)果提示了一種觀點(diǎn)，NF-K B信號(hào)傳導(dǎo)可能是多發(fā)性骨髓瘤治療的吸引人的靶點(diǎn)。發(fā)明人顯示了，eIF5Al siRNA抑制人類骨髓瘤細(xì)胞中NF-κ B的活化和ICAM-I的形成。這些觀察結(jié)果表明，eIF5Al在NF-K B活化中起到作用，由于NF-κ B活化的隨后的效應(yīng)天然是促存活的，我們預(yù)計(jì)這種活化由羥丁賴氨酸化的eIF5Al直接或間接地介導(dǎo)。IL-I骨髓瘤細(xì)胞的促炎癥性細(xì)胞因子IL-I的過量產(chǎn)生是導(dǎo)致骨組織的退化的多發(fā)性骨髓瘤的特征。已經(jīng)顯示了 eIF5Al siRNA在小鼠中顯著地降低LPS攻擊所誘導(dǎo)的IL-I的
過量產(chǎn)生。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。多發(fā)性骨髓瘤(“MM”) 是漸進(jìn)性的和致命的疾病，其特征在于骨髓中惡性的漿細(xì)胞的擴(kuò)增和溶骨性病變的存在。 多發(fā)性骨髓瘤是不可治愈的、但可治療的漿細(xì)胞癌癥。漿細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要部分，產(chǎn)生幫助對(duì)抗感染和疾病的免疫球蛋白(抗體)。多發(fā)性骨髓瘤的特征在于在骨髓中過多數(shù)量的異常漿細(xì)胞和完整的單克隆免疫球蛋白(IgG、IgA、IgD或IgE ;“M-蛋白質(zhì)”)或 Bence-Jones蛋白(游離的單克隆輕鏈)的過量產(chǎn)生。低血鈣、貧血、腎損害、對(duì)細(xì)菌性感染的提高的敏感性和正常免疫球蛋白的受損的生產(chǎn)是多發(fā)性骨髓瘤的常見的臨床表現(xiàn)。通常多發(fā)性骨髓瘤的特征還有彌散性骨質(zhì)疏松癥，通常在骨盆、脊柱、肋骨和顱骨中。由于在多發(fā)性骨髓瘤中存在的刺激反饋環(huán)路，本發(fā)明看起來非常適合于治療多發(fā)性骨髓瘤。例如，多發(fā)性骨髓瘤在骨髓中產(chǎn)生低濃度的IL-1。IL-I隨后刺激基質(zhì)細(xì)胞來產(chǎn)生IL-6，其然后刺激多發(fā)性骨髓瘤的生長。發(fā)明人早先顯示了(參見待審申請11/725，539 和11/184，982)，針對(duì)eIF-5Al的siRNA能夠抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，例如，IL-1 ； TNF-α和IL-8。因而，siRNA將不僅敲低eIF_5A的表達(dá)使得其更少的可以用于羥丁賴氨酸化，它還將切斷或降低IL-1/IL-6反饋環(huán)路。靶向人類eIF5A的siRNA被用于抑制腫瘤中內(nèi)源的羥丁賴氨酸化eIF5A的水平，而表達(dá)不能被羥丁賴氨酸化的eIF5A的突變體(eIF5AK5°K)的RNAi抗性質(zhì)粒被用于提高體內(nèi)未修飾的eIF5A的水平。含有eIF5A siRNA的PEI納米復(fù)合物的腫瘤內(nèi)注射與含有對(duì)照 siRNA的復(fù)合物相比抑制MM腫瘤生長超過80% = 0. 0003)，表明抑制羥丁賴氨酸化的eIF5A的水平具有抗腫瘤作用。含有eIF5AK5°K表達(dá)質(zhì)粒的PEI復(fù)合物具有相似的作用， 并且與含有對(duì)照質(zhì)粒的復(fù)合物相比抑制腫瘤生長超過70% (**p = 0. 001)。因而，匪腫瘤生長可以通過抑制生長促進(jìn)性羥丁賴氨酸化eIF5A，或通過提高eIF5A的促細(xì)胞凋亡的未羥丁賴氨酸化的形式的水平來抑制。含有eIF5A siRNA和RNAi抗性eIF5AK5°K質(zhì)粒的復(fù)合物的腫瘤內(nèi)遞送對(duì)腫瘤生長具有協(xié)同效應(yīng)，引起顯著的腫瘤收縮，抑制腫瘤生長達(dá)94% (***p = 0. 0002)。eIF5A siRNA/eIF5AK50E PEI復(fù)合物的靜脈內(nèi)遞送也有效地降低腫瘤生長達(dá)95% (**p = 0. 002)表明治療劑的全身遞送是可行的。eIF5A siRNA/eIF5AK50E pDNA PEI復(fù)合物的局部和全身性遞送在多發(fā)性骨髓瘤中引起顯著的抗腫瘤應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在癌癥，包括多發(fā)性骨髓瘤的治療中有用的組合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述組合物是編碼不能被羥丁賴氨酸化的點(diǎn)突變的eIF5Al的質(zhì)粒DNA， 與選擇性抑制內(nèi)源的人類eIF5Al、但對(duì)所述質(zhì)粒編碼的點(diǎn)突變的eIF5Al無效的eIF5Al siRNA的復(fù)合物。eIF5Al siRNA和編碼突變體eIF5Al的多核苷酸是以上討論的。質(zhì)粒DNA 和siRNA優(yōu)選地都復(fù)合到PEI (聚乙烯亞胺)納米顆粒。它們可以單獨(dú)地復(fù)合并單獨(dú)地或一起地施用，或它們可以復(fù)合在一起。DNA和RNA結(jié)合到PEI的帶正電的氨基基團(tuán)上，當(dāng)納米顆粒被吸收到細(xì)胞中時(shí)被釋放。已經(jīng)展現(xiàn)的是，PEI核酸復(fù)合物被有效地吸收到分裂的和非分裂的細(xì)胞中。質(zhì)粒DNA優(yōu)選地編碼eIF5Al (K50R)，其象eIF5Al (K50A) 一樣，不能被羥丁賴氨酸化，因而是強(qiáng)烈的致凋亡的。eIF5Al(K50R)的表達(dá)優(yōu)選地由B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)。eIF5Al siRNA優(yōu)選地特異于內(nèi)源的人類eIF5Al的3'末端，對(duì)反式eIF5Al (K50R) 的表達(dá)沒有作用。示范性的優(yōu)選的eIF5Al siRNA包含，或基本上由、或由附圖25中所示的 siRNA組成。包括eIF5Al siRNA的原理是(1)耗盡內(nèi)源的eIF5Al，其幾乎全被羥丁賴氨酸化由此處于促存活形式；(2)抑制NF-K B的活化，從而降低IL-6的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)粘附分子的形成；和(3)抑制IL-I的形成。eIF5Al siRNA協(xié)同地與eIF5Al (K50R)作用來誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡。由于上述的(2)和(3)是促存活事件，它們可能由羥丁賴氨酸化 eIF5Al介導(dǎo)，因此不受不能被羥丁賴氨酸化的eIF5Al (K50R)的作用。這種方法產(chǎn)生了導(dǎo)致癌細(xì)胞包括多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的未羥丁賴氨酸化的eIF5A的更大的庫，其具有對(duì)健康細(xì)胞的很少的作用。優(yōu)選的組合物在此被稱為SNS01。SNSOl是一種復(fù)合物，所述復(fù)合物含有編碼 eIF5AK50E的RNAi抗性質(zhì)粒DNA，其由為了增強(qiáng)安全性將表達(dá)限制到B細(xì)胞來源的細(xì)胞(包括骨髓瘤細(xì)胞)的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，和含有靶向人類eIF5A的具有用于增強(qiáng)核酸酶抗性的dTdT 3'突出物的siRNA，所述siRNA和所述質(zhì)粒被復(fù)合到in vivo JetPEI 。
實(shí)施例實(shí)施例1 用eIF_5Al的野生型和變體轉(zhuǎn)染HeLaS3細(xì)胞使用表達(dá)HA標(biāo)簽化的eIF5Al變體，包括野生型eIF5Al (WT)、eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK67R(K67R)、eIF5AlK67A(K67A)、eIF5AlK47R/K50R(K4750R)、eIF5AlK50R/ K67R(K5067R)或 eIF5AlK50A/K67A(K5067A)的質(zhì)粒利用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染HeLa S3 細(xì)胞。表達(dá)LacZ的質(zhì)粒被用作對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后M和48小時(shí)(A)或28和52小時(shí)(B)，收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，通過SDS-PAGE分級(jí)分離。轉(zhuǎn)染的eIF5Al的表達(dá)水平用針對(duì)HA的抗體來檢測。結(jié)果，eIF5Al在推定的遍在蛋白化位點(diǎn)(K67R)的賴氨酸處的突變提高了高于野生型的eIF5Al轉(zhuǎn)基因的積累(A)。在羥丁賴氨酸化所需的賴氨酸處的eIF5Al的突變(K50R) 也提高了 eIF5Al轉(zhuǎn)基因高于野生型eIF5Al的積累(B)。當(dāng)與未突變的野生型eIF5Al轉(zhuǎn)基因相比較時(shí)，雙突變體形式的eIF5Al(K50A/K67A)特別好地表達(dá)(A+B)。參見附圖2。實(shí)施例2 用eIF_5Al的野生型和變體轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞使用表達(dá)HA標(biāo)簽化的eIF5Al變體，包括野生型eIF5Al(5Al)，eIF5AlK67A(K67A)、 eIF5AlK50A/K67A(K50A K67A)、e IF5A1K50R(K50R)、e IF5A1K47R(K47R)、 eIF5AlK67R(K67R)、eIF5AlK47R/K50R(K47R K50R)或 eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)的質(zhì)粒利用PAMAM枝狀聚合物(FMD44)轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞。表達(dá)LacZ的質(zhì)粒被用作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后 48小時(shí)，收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，通過SDS-PAGE分級(jí)分離。轉(zhuǎn)染的eIF5Al的表達(dá)水平用針對(duì) HA的抗體來檢測。利用針對(duì)肌動(dòng)蛋白的抗體驗(yàn)證相等的加載。結(jié)果，eIF5Al在推定的遍在蛋白化位點(diǎn)的賴氨酸處的突變(K67A或K67R)提高了高于野生型的eIF5Al轉(zhuǎn)基因的積累。 在羥丁賴氨酸化所需的賴氨酸處(K50R)或在乙?；稽c(diǎn)(K47R)處的eIF5Al的突變也提高了高于野生型eIF5A的eIF5Al轉(zhuǎn)基因的積累。當(dāng)與未突變的野生型eIF5Al轉(zhuǎn)基因比較時(shí)，雙突變體形式的eIF5Al(K50A/K67A)也以更高的水平表達(dá)。參見附圖3。實(shí)施例3 利用PAMAM枝狀聚合物轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞使用表達(dá)HA 標(biāo)簽化的 eIF5Al 變體，包括 eIF5AlK50R(K50R)、eIF5AlK50A/ K67A (K50A/K67A)、或 eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)的質(zhì)粒，使用 PAMAM 枝狀聚合物 (FMD45-2)轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞。表達(dá)LacZ的質(zhì)粒被用作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后七十二小時(shí)，細(xì)胞用 Annexin/PI染色，通過FACS來分析。對(duì)Armexin V陽性染色的、對(duì)PI (碘化丙錠)陰性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的早期階段(Arm+/PI-)，對(duì)Armexin V和PI都是陽性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的晚期階段(Arm+/PI+)。結(jié)果eIF5Al在羥丁賴氨酸化位點(diǎn) (K50R)中或在推定的遍在蛋白化位點(diǎn)(K67R)中的賴氨酸處的突變，以及雙突變體(K50A/ K67A)產(chǎn)生顯著高于LacZ對(duì)照的水平的KAS細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。參見附圖4。實(shí)施例4 用表達(dá)eIF_5Al和eIF_5Al變體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞用表達(dá)HA-標(biāo)簽化的 eIF5Al 變體，包括 eIF5AlK50A (K50A)、eIF5AlK50R(K50R)、 eIF5AlK67R(K67R)、eIF5AlK50A/K67A(K50A/K67A)或 eIF5AlK50R/K67R(K50R K67R)的質(zhì)粒，使用Lipof ectamine 2000轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞。表達(dá)LacZ的質(zhì)粒被用作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后七十二小時(shí)，細(xì)胞用Annexin/PI染色，通過FACS來分析。對(duì)Annexin V陽性染色的、對(duì)PI (碘化丙錠)陰性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的早期階段(Arm+/PI-)，對(duì)Armexin V和PI都是陽性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的晚期階段(Arm+/PI+)。結(jié)果eIF5Al在羥丁賴氨酸化位點(diǎn)(K50R)中或在推定的遍在蛋白化位點(diǎn)(K67R)中的賴氨酸處的突變，以及雙突變體(K50A/K67A)產(chǎn)生顯著高于LacZ對(duì)照的水平的KAS細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。參見附圖5。實(shí)施例5 使用突變的eIF_5Al處理KAS細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡利用表達(dá)HA-標(biāo)簽化的 eIF5Al 變體 eIF5AlK50R(K50R)或 eIF5AlK50A/K67A(K50A/K67A)的質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞。表達(dá)LacZ的質(zhì)粒被用作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后七十二小時(shí)，細(xì)胞用Annexin/PI染色，通過FACS來分析。對(duì)Annexin V陽性染色的、對(duì)PI (碘化丙錠)陰性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的早期階段(Arm+/PI-)， 對(duì)Armexin V和PI都是陽性染色的細(xì)胞被認(rèn)為處于細(xì)胞凋亡的晚期階段(Arm+/PI+)。結(jié)果eIF5Al在羥丁賴氨酸化位點(diǎn)(K50R)中賴氨酸的突變、或在羥丁賴氨酸化位點(diǎn)和在推定的遍在蛋白化位點(diǎn)(K50A/K67A)兩處的eIF5Al的突變，產(chǎn)生顯著高于LacZ對(duì)照的水平的 KAS細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。參見附圖6。實(shí)施例6A 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的siRNA/腺病毒介導(dǎo)的殺傷KAS(人類多發(fā)性骨髓瘤)細(xì)胞維持在SlO培養(yǎng)基[具有^g/ml IL-6U0 % 胎兒牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素(P/S)的RPMI 1640]中。利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)用58. 7pmoles的siRNA轉(zhuǎn)染KAS細(xì)胞。模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不存在siRNA 的情況下用Lipofectamine 2000處理。在無抗生素的SlO培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。a)靴向人類 eIF5Al 的 siRNA eIF5Al siRNA靴#1 (該siRNA靴向人類eIF5Al的這個(gè)區(qū)域
5‘ -AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3‘ (SEQ ID NO _)。該 siRNA 序列在附圖 25 中示出，在此
常常稱為h5Al。eIF5Al siRNA 靶 #2 eIF5Al (該 siRNA 靶向人類 eIF5Al 的這個(gè)區(qū)域 5 ‘ -AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3 (SEQ ID NO:_)。(該 siRNA 序列在此常常稱為 h5Al_ALT)b)對(duì)照siRNA:對(duì)照siRNA具有以下序列正義鏈， 5' -ACACAUCCUCCUCAG⑶CGdTdT-3‘；反義鏈，3' -dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5‘“。已經(jīng)使用的其它對(duì)照包括來自Dharmacon的非靶向的證實(shí)的siRNA，因?yàn)樗鼈儽晃㈥嚵袦y試來限制不需要的脫靶效應(yīng)。例如，對(duì)于研究NFkB的體外工作，使用的對(duì)照是Dharmacon的非靶向siRNA，s (序列D-001700-01)，對(duì)于體內(nèi)工作，使用的對(duì)照是 Dharmacon' s (序列 D-001810-01)。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)行團(tuán)化，重懸浮在Iml的SlO培養(yǎng)基中。起始的siRNA轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)染的KAS細(xì)胞計(jì)數(shù)，以300，000細(xì)胞/孔播種到M孔平板中，用相同的 siRNA第二次轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后四小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)行團(tuán)化，重懸浮在含有3000ifu的Ad-LacZ (表達(dá)β -半乳糖苷酶的腺病毒)或Ad-5A1M(表達(dá)人類eIF5AlK5°A&腺病毒)的Iml SlO培養(yǎng)基(沒有 IL-6)中。72小時(shí)后，收獲細(xì)胞，通過用Annexin V-FITC^PPI(BD Bioscience)染色，隨后通過FACS分析來分析細(xì)胞凋亡。a)早期細(xì)胞凋亡被定義為Armexin-FITC陽性染色，PI染色為陰性(Arm+/PI-)的細(xì)胞。b)總的細(xì)胞凋亡被定義為處于早期細(xì)胞凋亡(Arm+/PI-)或晚期細(xì)胞凋亡/壞死 (Ann+/PI+)的細(xì)胞的總和。5AlsiRNA靶向#1靶向人類eIF5Al的3' UTR，因而將不影響來自腺病毒的eIF5Al 的表達(dá)。5A1 siRNA靶向#2靶向人類eIF5Al的開放閱讀框內(nèi)部，因而它可能潛在地干擾 eIF5Al從腺病毒的表達(dá)。
結(jié)果與未處理的和僅用SiRNA處理的細(xì)胞相比，用SiRNA處理和用表達(dá)eIF_5Al K50A變體的腺病毒感染的細(xì)胞經(jīng)歷更大數(shù)量的細(xì)胞凋亡。參見附圖7。實(shí)施例6B 用針對(duì)eIF5Al靶#1的eIF5Al siRNA(附圖25中所示的)預(yù)處理，降低了內(nèi)源的eIF5Al的表達(dá)，但容許由腺病毒表達(dá)的RNAi抗性eIF5AlK5°A的積累。 KAS細(xì)胞使用對(duì)照siRNA (C)或兩種靶向eIF5Al的siRNA (#1和#2)之一用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染。eIF5Al siRNA #1 靴向 eIF5Al 的 3‘ UTR，因而不影響來自腺病毒的eIF5Al的表達(dá)，因?yàn)樗鼉H含有eIF5Al的開放閱讀框。siRNA的序列在附圖25中示出。eIF5Al #2 siRNA靶向eIF5Al的開放閱讀框，因而將影響內(nèi)源和外源表達(dá)的eIF5Al兩者的表達(dá)。起始的轉(zhuǎn)染之后72小時(shí)，細(xì)胞用相同的siRNA第二次轉(zhuǎn)染。四小時(shí)后，從細(xì)胞中除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用含有Ad-LacZ (L)或Ad-eIF5AlK5°A(5M)的生長培養(yǎng)基(_)IL6替換。 72小時(shí)之后，收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，利用針對(duì)eIF5A和肌動(dòng)蛋白的抗體通過flfestern印跡來分析。參見附圖7B?？梢杂^察到病毒表達(dá)的eIF5Al的積累(泳道1對(duì)比泳道幻，eIF5Al siRNA靶向#1和#2的eIF5A表達(dá)的降低是明顯可見的(泳道5和7對(duì)比泳道幻。如所預(yù)計(jì)的，eIF5Al siRNA #1不影響病毒表達(dá)的eIF5AlK5°A的積累(泳道6對(duì)比泳道4)，而eIF5Al siRNA #2僅中度地影響病毒表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(泳道8對(duì)比泳道4)。實(shí)施例6C 在腺病毒感染之前用針對(duì)靶#1的eIF5Al siRNA預(yù)處理降低人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中磷酸化的NF- κ B的表達(dá)。KAS 細(xì)胞使用對(duì)照 siRNA (hC)或靶向 eIF5Al 的 siRNA (#1)用 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染。eIF5Al siRNA #1靶向eIF5Al的3' UTR,因而不影響來自腺病毒的eIF5Al的表達(dá)， 因?yàn)樗鼉H含有eIF5Al的開放閱讀框。起始的轉(zhuǎn)染之后72小時(shí)，細(xì)胞用相同的siRNA第二次轉(zhuǎn)染。四小時(shí)后，從細(xì)胞中除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用含有Ad-LacZ(L)或Ad-eIF5AlK5°A(5M)的生長培養(yǎng)基⑴IL6替換。二十四小時(shí)后，收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，利用針對(duì)磷酸-NF- κ B p65 (Ser 536)和eIF5A的抗體通過Western印跡來分析。如所預(yù)計(jì)的，eIF5Al siRNA #1不影響病毒表達(dá)的eIF5AlK5°A&積累。NF-kB p65在絲氨酸536處的磷酸化調(diào)節(jié)活化、核定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄活性。參見附圖7C。實(shí)施例6D 在腺病毒感染之前用eIF5Al siRNA #1預(yù)處理降低人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中磷酸化的NF- κ B和ICAM-I的表達(dá)。KAS細(xì)胞使用對(duì)照siRNA (C)或兩種靶向eIF5Al的siRNA (#1和#2)之一用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染。起始的轉(zhuǎn)染之后72小時(shí)，細(xì)胞用相同的siRNA第二次轉(zhuǎn)染。四小時(shí)后，從細(xì)胞中除去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用生長培養(yǎng)基(+)IL6替換。第二次轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)， 細(xì)胞用40ng/ml的TNF-α刺激，在0、4或?qū)πr(shí)收獲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，利用針對(duì)磷酸-NF-κ B p65(Ser 536)、ICAM-I和肌動(dòng)蛋白的抗體通過^festern印跡來分析。在用兩種eIF5Al特異性siRNAs轉(zhuǎn)染之后，觀察到TNF-α誘導(dǎo)的NF-κ B ρ65磷酸化(ser 536)和ICAM-I表達(dá)的降低。NF-kB p65在絲氨酸536處的磷酸化調(diào)節(jié)活化、核定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄活性。ICAM-I是細(xì)胞內(nèi)的粘附表面糖蛋白，其被認(rèn)為涉及多發(fā)性骨髓瘤的病理。參見附圖7D。實(shí)施例6E 用siRNA預(yù)處理KAS細(xì)胞通過在存在IL_6的情況下的eIF5AlK5°K基因遞送提高了細(xì)胞凋亡。KAS 細(xì)胞用對(duì)照 siRNA(hcon)或人類 eIF5Al siRNA(h5Al)使用 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染。72小時(shí)后，細(xì)胞用siRNA重新轉(zhuǎn)染。在siRNA轉(zhuǎn)染介質(zhì)的去除之后4小時(shí)，空載體(mcs)或eIF5AlK5°K(K50R)質(zhì)粒的PEI復(fù)合物添加到細(xì)胞。整個(gè)研究中使用的生長培養(yǎng)基含有IL-6。在72小時(shí)后通過用Armexin/PI染色細(xì)胞和FACS分析來測量細(xì)胞凋亡。 參見附圖7F。實(shí)施例7 :eIF_5Al質(zhì)粒和eIF_5Al siRNA的共同施用延遲了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長(附圖8-10)。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。六只3_5周齡SCID/CB17小鼠在它們的右肋注射200 μ IPBS中的1千萬個(gè)KAS-6/1骨髓瘤細(xì)胞，當(dāng)腫瘤達(dá)到4mm3的最小尺寸時(shí)啟動(dòng)治療。對(duì)照小鼠用含有pCpG-mcs (空載體)和對(duì)照siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(對(duì)照組由3只小鼠組成C-1、C-2和C-3)。治療的小鼠用含有RNAi抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5AlK50E和eIF5Al siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(治療組由3只小鼠組成5Α-1、5Α-2和5A-3)。在腫瘤內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行注射以防止回流，緩慢速度的注射用于提高吸收。附圖8中的數(shù)據(jù)顯示了組中所有小鼠的腫瘤體積。附圖9中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)指示統(tǒng)計(jì)顯著性(* = ρ < 0. 025 ；η = 3)。附圖10顯示了 eIF_5Al質(zhì)粒和eIF_5Al siRNA的共同施用降低了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的重量。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組的平均腫瘤重量+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)指示統(tǒng)計(jì)顯著性(* = ρ < 0. 05 ;n = 3)。2X0. Iml 的 JET-PEI (PolyPlus)用于體內(nèi)測試。N/P 比例是 8。PEI/DNA/siRNA 復(fù)合物在5%葡萄糖中0. Iml的總體積中形成。形成復(fù)合物的方案如下。1.使成分達(dá)到室溫。保持無菌。2.將 20 μ g 的質(zhì)粒 DNAQmg/mL， 10 μ 1)禾口 10 μ g siRNA (lmg/mL, 10 μ 1)稀釋到25 μ 1的總體積。使用無菌水來補(bǔ)足差額。3.通過添加25 μ 1 10%的葡萄糖調(diào)節(jié)DNA溶液的體積到50 μ 15%葡萄糖。輕輕地渦旋并簡短地離心。4.將4. 8 μ 1的invivo JETPEI稀釋到25 μ 1 10%葡萄糖的總體積。用無菌水調(diào)節(jié)體積到50 μ 1，以5%葡萄糖的終濃度結(jié)束。輕輕地渦旋并簡短地離心。5.立即添加50 μ 1稀釋的PEI到50 μ 1稀釋的DNA中(不逆轉(zhuǎn)順序)。簡短地渦旋，立即旋轉(zhuǎn)沉淀。6.注射之前孵育15分鐘。復(fù)合物穩(wěn)定6小時(shí)。無CpG的克隆載體和pCpG質(zhì)粒獲自hvivoGen。這些質(zhì)粒完全缺乏CpG 二核苷酸，稱為PCpG。這些質(zhì)粒在體外和體內(nèi)產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，相比之下，基于CMV的質(zhì)粒容許體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。PCpG質(zhì)粒含有一些組件，其要么天然地缺少CpG 二核苷酸、被修飾除去了所有的Cp(iS、或是完全地合成的，例如編碼可選擇標(biāo)記物或報(bào)告物的基因。根據(jù)在形成遺傳密碼的十六種二核苷酸之中CG是僅有的非必需二核苷酸并且可以被替換的事實(shí)，這些新等位基因的合成得以成為可能。八個(gè)密碼子含有編碼五種不同氨基酸的CG。所有八種密碼子可以由編碼相同氨基酸的至少兩個(gè)密碼子的備選者替代，來產(chǎn)生編碼具有保持與野生型相同的氨基酸序列、并因而與它們的野生型對(duì)應(yīng)物一樣有活性的蛋白質(zhì)的新的等位基因。這些新的等位基因可以在命名為pMOD的質(zhì)粒中分別地獲得，從所述質(zhì)粒上可以容易地切下它們。pCpG質(zhì)粒容許體內(nèi)的持久表達(dá)，是利用表達(dá)TLR9的細(xì)胞系研究在體內(nèi)和體外 CpGs對(duì)基因表達(dá)的影響、以及它們對(duì)先天和獲得性免疫系統(tǒng)的影響的重要工具?？蛰d體pCpG-mcs (Invivogen)是沒有表達(dá)的基因產(chǎn)物、僅有多克隆位點(diǎn)的載體，被用作對(duì)照載體。HA-標(biāo)簽化的eIF5AlK5°K cDNA亞克隆到pCpG-LacZ載體 (Invivogen)的NcoI和NheI位點(diǎn)中，所述載體中已經(jīng)除去了 LacZ基因，來產(chǎn)生治療載體pCpG-eIF5Al (K50R)。利用Endo-Free Qiagen試劑盒制備DNA0測量內(nèi)毒素水平，為
<0. 03EU/ μ g, DNA 是在水中 2mg/ml。實(shí)驗(yàn)中使用的對(duì)照SiRNA是來自Dharmacon的微陣列證實(shí)的非靶向?qū)φ?siRNA(D-001810-01)。用修飾(siSTABLE)來獲得siRNA以防止血清中的降解。針對(duì)人類eIF5Al的3' UTR設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中使用的eIF5Al siRNA。在eIF5Al siRNA 和小鼠eIF5Al之間沒有相似性，因而siRNA應(yīng)當(dāng)僅抑制人類(而不是小鼠的)eIF5Al。該 siRNA也與eIF5A2沒有相似性(人類或小鼠的)。用修飾(siSTABLE)來獲得siRNA以防止血清中的降解。所述eIF5Al siRNA具有以下靶序列5，GCU GGA CUC CUC CUA CAC A (UU)3siSTABLE siRNA以lmg/ml溶解在水中(以等分量保存在-20C)。長度(1)和寬度(w)的腫瘤尺寸利用數(shù)字卡尺每周測量2-3次。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積1 =長度；最小的尺寸W=寬度；最大的尺寸腫瘤體積(mm3) = l2*w*0. 5統(tǒng)計(jì)分析Student' s t_測驗(yàn)被用于統(tǒng)計(jì)分析。顯著性被認(rèn)為是高于95%的可信水平(ρ
<0. 05)。實(shí)施例8 :eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延遲了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起腫瘤收縮。在另一個(gè)研究中，SCID小鼠再次用KAS細(xì)胞皮下地注射。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。對(duì)照小鼠用含有pCpG-mGs (空載體)和對(duì)照siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(對(duì)照組6-1、6-2和6-3)。治療的小鼠用含有1 離1抗性質(zhì)粒？0 61正5六1—(2(^8 的質(zhì)粒DNA)和eIF5Al siRNA(10 μ g的siRNA)的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(治療組G-4、G-5和G-6)。附圖11中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)指示統(tǒng)計(jì)顯著性(* = ρ < 0. 025 ；η =幻。在21天內(nèi)給予六次注射(紅色箭頭)。實(shí)施例9 靜脈內(nèi)(i. v.)的 eIF5Al siRNA 和腫瘤內(nèi)(i. t.)的 PEI/eIF5AlK50R 質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮(組2B)。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療，50微克對(duì)照 siRNA(對(duì)照組)或人類eIF5Al siRNA(治療組)的初始尾部注射。隨后對(duì)照小鼠用含有 pCpG-mcs (空載體；對(duì)照組G-1、G_2和G-幻的PEI復(fù)合物每周2次地通過腫瘤內(nèi)注射來治療。隨后，治療的小鼠隨后通過用含有RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K(20 μ g質(zhì)粒DNA) 的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射來治療(治療組G-4、G-5和G-6)。對(duì)照小鼠繼續(xù)通過每周一次的i. v.注射接受對(duì)照siRNA(對(duì)照組R-l、R-2和R-3)。治療的小鼠繼續(xù)通過每周一次的i. v.注射接受人類eIF5Al siRNA (20 μ g)(治療組R-4、R-5和R-6)。附圖12 中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。在21天的時(shí)間內(nèi)給予PEI/DNA的六次壁內(nèi)注射(紅色箭頭)和siRNA的四次i. v.注射(藍(lán)色箭頭)。附圖13提供了來自實(shí)施例8和9的結(jié)果的總覽。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。 附圖13中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中小鼠的平均腫瘤體積+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)指示治療組和對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性(** = ρ < 0. 01 ；= ρ < 0. 001 ；η = 3)。形成PEI復(fù)合物的方案1.使成分達(dá)到室溫。保持無菌。2.將質(zhì)粒DNA或質(zhì)粒DNA+siRNA稀釋到25 μ 1的總體積。使用無菌水來調(diào)整體積。 a)對(duì)于僅有質(zhì)粒DNA的復(fù)合物將20 μ g的質(zhì)粒DNAQmg/ml的10 μ 1)稀釋到25 μ 1的總體積。使用無菌水來補(bǔ)
足差額。b)對(duì)于質(zhì)粒DNA+siRNA復(fù)合物將20 μ g 的質(zhì)粒 DNA (2mg/ml 的 10 μ 1)，10 μ g 的 siRNA (lmg/ml 的 10 μ 1)稀釋到25 μ 1的總體積。使用無菌水來補(bǔ)足差額。3.通過添加25 μ 1的10%葡萄糖(PEI試劑盒提供的)將DNA溶液的體積調(diào)整到 50 μ 1 5%葡萄糖。輕輕地渦旋并簡短地離心。4.將in vivo JETPEI稀釋到10%葡萄糖的25 μ 1總體積。a)對(duì)于僅有質(zhì)粒DNA的復(fù)合物將3. 2 μ 1的in vivo JETPEI稀釋到10%葡萄糖的25 μ 1的總體積。用無菌水調(diào)節(jié)體積到50 μ 1，以5%葡萄糖的終濃度結(jié)束。輕輕地渦旋并簡短地離心。b)對(duì)于質(zhì)粒DNA+siRNA復(fù)合物將4. 8 μ 1的in vivo JETPEI稀釋到10%葡萄糖的25 μ 1的總體積。用無菌水調(diào)節(jié)體積到50 μ 1，以5%葡萄糖的終濃度結(jié)束。輕輕地渦旋并簡短地離心。5.立即添加50 μ 1稀釋的PEI到50 μ 1稀釋的DNA中(不逆轉(zhuǎn)順序)。簡短地渦
旋，立即旋轉(zhuǎn)沉淀。6.注射之前孵育15分鐘。復(fù)合物穩(wěn)定6小時(shí)。對(duì)于siRNA的尾靜脈注射，起始的siRNA注射是50微克。siRNA在PBS中稀釋到 0. 4mg/mL· 125 μ 1每只小鼠(50 μ g)注射到尾靜脈中。血清穩(wěn)定的siRNA的隨后的注射以 20 μ g每只小鼠每周兩次地給予。siRNA在PBS中稀釋到0. 4mg/ml。每只小鼠50 μ 1 (20 μ g) 注射到尾部靜脈中。附圖1 顯示了 eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用引起了腫瘤收縮。SCID 小鼠用KAS細(xì)胞皮下地注射。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。治療的小鼠用含有RNAi 抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K和eIF5Al siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(治療組 G-4、G-5和G-6)。在21天的時(shí)間內(nèi)給予六次注射。開始治療后四十二天，處死小鼠，打開腫瘤位點(diǎn)下的皮膚，檢查腫瘤生長的證據(jù)。在組2A治療的小鼠中的任何一只中沒有觀察到腫瘤生長。
附圖13C顯示了靜脈內(nèi)(i. v.)的eIF5Al siRNA和腫瘤內(nèi)(i. t.)的PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療，50微克人類eIF5Al siRNA的初次注射(治療組)。 小鼠隨后通過用含有RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射來治療(治療組R-4、R-5和R-6)。通過每周一次的i. v.注射，小鼠繼續(xù)接受人類eIF5Al siRNA。治療在處理開始后21天結(jié)束。開始治療后四十二天，處死小鼠，打開腫瘤位點(diǎn)下的皮膚，檢查腫瘤生長的證據(jù)。在治療組的一只小鼠中沒有腫瘤生長的證據(jù)(組2B)。實(shí)施例10 :eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的靜脈內(nèi)共同施用延遲了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療，50微克對(duì)照 siRNA (對(duì)照組)或人類eIF5Al siRNA (治療組)的初始注射。隨后用含有pCpG-mcs (空載體；對(duì)照組A1、A2和A3)的PEI復(fù)合物，或含有RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K的PEI復(fù)合物(治療組；A4、A5和A6) 每周兩次地靜脈內(nèi)(紅色箭頭)或腹膜內(nèi)注射(綠色箭頭) 治療小鼠。小鼠繼續(xù)通過i. v.注射(藍(lán)色箭頭)每周一次地接受對(duì)照siRNA(對(duì)照組Al、 A2和A3)或人類eIF5Al siRNA(治療組A4、A5和A6)。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。附圖14中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。實(shí)施例11 靜脈內(nèi)(i. v.)的eIF5Al siRNA和靜脈內(nèi)(i. v.)或腹膜內(nèi)(i. p.)的 PEI/eIF5AlK5°κ質(zhì)粒復(fù)合物的施用延緩了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療，50微克對(duì)照siRNA(對(duì)照組)或人類eIF5Al siRNA(治療組)的初始注射。對(duì)照小鼠隨后用含有 pCpG-mcs (空載體；對(duì)照組是三只小鼠B1、B2和B3)的PEI復(fù)合物 每周一次地靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射來治療。治療的小鼠隨后用含有RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K(治療組B4、 B5和B6)的PEI復(fù)合物 每周一次地靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射來治療。小鼠通過每周一次的 i. v.注射繼續(xù)接受對(duì)照siRNA (對(duì)照組B1、B2和B3)或人類eIF5Al siRNA (治療組是三只小鼠B4、B5和B6)。實(shí)驗(yàn)以50 μ g的起始siRNA注射開始(附圖15中圖形上的第2天)。 隨后的注射使用每周一次的20微克siRNA。siRNA裸露地給予，S卩，沒有遞送運(yùn)載體。PEI 復(fù)合物含有20yg的質(zhì)粒DNA。i. p.給予起始的PEI注射，i. v.給予隨后的注射。附圖15 中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。附圖16提供了實(shí)施例10和11的總覽。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。一組小鼠接受每周一次的對(duì)照siRNA(對(duì)照；組A)或eIF5Al siRNA(治療的；組A)i.v.注射，以及含有pCpG-mcs的PEI復(fù)合物(對(duì)照；組A)或含有 RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K的PEI復(fù)合物(治療的；組A)的i. v.或i. p.注射。第二組小鼠用含有pCpG-mcs (空載體)和對(duì)照siRNA的PEI復(fù)合物(對(duì)照；組B)、或含有RNAi 抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK50E和eIF5Al siRNA的PEI復(fù)合物(治療的；組B) 每周2次地給予i.v.或i.p.注射。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中小鼠的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)指示治療組和對(duì)照組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性(* = ρ < 0. 05 ；= ρ < 0. 001 ；n = 3)。制備PEI復(fù)合物和siRNA的方案是早先實(shí)施例中描述的。實(shí)施例12 :eIF5Al質(zhì)粒和eIF5Al siRNA的共同施用延遲了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起腫瘤收縮。
SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。對(duì)照小鼠用含有pCpG-mcS(空載體)和對(duì)照siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(對(duì)照組有 3只小鼠對(duì)照1、對(duì)照2和對(duì)照3)。治療的小鼠用含有RNAi抗性質(zhì)粒pCpG-eIF5AlK5°K* eIF5Al siRNA的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射(治療組含有4只小鼠5A_1、5A_2、 5A-3和5A-4)。PEI復(fù)合物的腫瘤內(nèi)注射含有20 μ g的質(zhì)粒DNA和10 μ g的siRNA。附圖 17中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。實(shí)施例13 靜脈內(nèi)(i. v.)的 eIF5Al siRNA 和腫瘤內(nèi)(i. t.)的 PEI/eIF5AlK5°K 質(zhì)粒復(fù)合物的施用引起了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的腫瘤收縮。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療，50微克的對(duì)照siRNA(對(duì)照組有三只小鼠對(duì)照1、對(duì)照2和對(duì)照3)或人類eIF5Al siRNA(治療組有3 只小鼠5Α-1、5Α-2、5Α-3)的起始注射。對(duì)照小鼠隨后用含有pCpG-mcs (20 μ g)的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射來治療(對(duì)照組1-3)。治療的小鼠隨后用含有RNAi抗性質(zhì)粒 pCpG-eIF5AlK50E(20yg)的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射來治療(5A-1、5A_2、5A_3)。 對(duì)照小鼠繼續(xù)通過每周兩次的尾靜脈i. ν注射來接受對(duì)照siRNA (20 μ g)。治療的小鼠繼續(xù)通過每周兩次的尾靜脈i. ν注射來接受人類eIF5Al siRNA(20yg)。在腫瘤內(nèi)注射之前 48小時(shí)給予注射。siRNA作為裸露的siRNA來給予，S卩，沒有遞送運(yùn)載體。附圖18中顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組中所有小鼠的腫瘤體積。實(shí)施例14 由EFl或似9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eIF5AlK5°K質(zhì)粒與eIF5Al siRNA的共同施用延遲了多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的生長并引起腫瘤收縮。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。小鼠用含有對(duì)照載體(Gl和6 或由B^啟動(dòng)子(G3和G4)或EFl啟動(dòng)子(G5和G6)驅(qū)動(dòng)的eIF5Al質(zhì)粒，以及對(duì)照siRNA (Gl、G3、G5)或h5Al siRNA (G2、G4、G6)的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射。顯示的數(shù)據(jù)是每個(gè)組的平均腫瘤體積+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。注意出四啟動(dòng)子意圖作為B 細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。然而，雖然發(fā)現(xiàn)在這項(xiàng)研究中使用的B^啟動(dòng)子/mCMV增強(qiáng)子在體外驅(qū)動(dòng)KAS細(xì)胞中的HA-eIF5AlK5°K的高表達(dá)，它看起來不是B細(xì)胞特異性的(可能由于CMV 增強(qiáng)子)。參見附圖19。實(shí)施例15 :eIF5Al siRNA的共同施用提高了由EFl或似9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的eIF5AlK5°K 質(zhì)粒對(duì)多發(fā)性骨髓瘤皮下腫瘤的抗腫瘤作用，并產(chǎn)生了降低的腫瘤負(fù)荷。SCID小鼠皮下地注射KAS細(xì)胞。當(dāng)觀察到明顯的腫瘤時(shí)啟動(dòng)治療。小鼠用含有對(duì)照載體(Gl和6 或由B^啟動(dòng)子(G3和G4)或EFl啟動(dòng)子(G5和G6)驅(qū)動(dòng)的eIF5Al質(zhì)粒，以及對(duì)照siRNA (Gl、G3、G5)或h5Al siRNA (G2、G4、G6)的PEI復(fù)合物每周2次地腫瘤內(nèi)注射。在開始處理后對(duì)天處死小鼠，移除皮下腫瘤并稱重。顯示的數(shù)據(jù)是所有組的平均腫瘤重量+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差。參見附圖20。實(shí)施例16 :eIF5Al siRNA協(xié)同地提高肺腺癌細(xì)胞中源自Ad_eIF5A的感染的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。A549細(xì)胞用Ad-LacZ或Ad_eIF5A感染。通過在添加病毒之后立即向細(xì)胞添加轉(zhuǎn)染介質(zhì)，用對(duì)照siRNA或靶向人類eIF5Al的siRNA (h5Al)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用siRNA轉(zhuǎn)染和用病毒感染后四小時(shí)，培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞孵育72小時(shí)，之后用Armexin/PI標(biāo)記來檢測細(xì)胞凋亡的細(xì)胞。注意這個(gè)細(xì)胞系中eIF5Al的過量表達(dá)，由于限制DHS和DOHH的數(shù)量而引起未羥丁賴氨酸化的eIF5Al的積累，因而產(chǎn)生與eIF5AK5°K的過量表達(dá)過量表達(dá)相同的促細(xì)胞凋亡效果。這些數(shù)據(jù)表明，也在非骨髓瘤腫瘤類型中觀察到了由同時(shí)的羥丁賴氨酸化eIF5A的抑制和未羥丁賴氨酸化的eIF5A的過量表達(dá)所引起的細(xì)胞凋亡中的協(xié)同效應(yīng)。參見附圖21。實(shí)施例17 質(zhì)粒pExp5A的構(gòu)建ρΕχρδΑ是具有降低的CpG 二核苷酸的表達(dá)質(zhì)粒，被設(shè)計(jì)以驅(qū)動(dòng)人類eIF5AlK5°K主要在B細(xì)胞譜系的細(xì)胞中的表達(dá)。載體來源于pCpG-LacZ，一種完全缺乏CpG 二核苷酸的質(zhì)粒(Invivogen)。在大腸桿菌中復(fù)制和選擇所需的所有組件都沒有CpG 二核苷酸。來自 CpG-LacZ載體的原始的CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和LacZ基因分別被人類最小B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子(B29/CD79b ；Invivogen)和人類eIF5AlK5°K替代，以驅(qū)動(dòng)eIF5AlK5°K的B細(xì)胞特異性表達(dá)。B^ DHS4.4 3'增強(qiáng)子已經(jīng)被導(dǎo)入質(zhì)粒中eIF5Al表達(dá)盒的下游，以增強(qiáng)似9啟動(dòng)子的活性和降低在非B細(xì)胞中的表達(dá)(Malone et al. 2006. B29 gene silencing in pituitary cells is regulated by its 3' enhancer. J. Mol. Biol. 362 :173-183)。B29 最小啟動(dòng)子、 eIF5AlK5°K*B29 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子的摻入向載體中引入了 32個(gè)CpG 二核苷酸。用于大腸桿菌中的表汰的組件復(fù)制起點(diǎn)大腸桿菌R6K γ Ori0*由于R6K Y復(fù)制起點(diǎn)的存在，pCpG質(zhì)?？梢詢H在表達(dá)pir突變體基因的大腸桿菌突變菌株中擴(kuò)增。它們將不會(huì)在標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌菌株中復(fù)制。因此，PCpG質(zhì)粒與大腸桿菌GTl 15菌株，一種在Dcm甲基化方面也是缺陷的(Invivogen) pir突變體，一起提供。細(xì)菌啟動(dòng)子EMI，細(xì)菌EM7啟動(dòng)子的無CpG的版本?？蛇x擇標(biāo)記物Ze0CinTM抗性基因；沒有CpG的合成的等位基因。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的組件哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子用于B細(xì)胞中的組織特異性表達(dá)的人類_167bp最小 B29(⑶79b)啟動(dòng)子。合成的內(nèi)含子(I 140)也在5' UTR中存在。多腺苷酸化信號(hào)晚期SV40多腺苷酸化信號(hào)的無CpG 二核苷酸的版本。3'增強(qiáng)子人類B29 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子。MAR 兩個(gè)無CpG的基質(zhì)附著區(qū)域(MAR)存在于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄單元之間。一個(gè)MAR來自于人類IFN-β基因的5'區(qū)域，一個(gè)來自β-珠蛋白基因的5'區(qū)域。ρΕχρδΑ的預(yù)計(jì)的序列在附圖23中提供(3371bp)。eIF5AlK50E的氨基酸序列*K5°K突變是下劃線的。MADDLDFETGDAGASATFPMQCSALRKNGFVVLKGRPCKIVEMSTSKTGRHGHAKVHLVGIDIFTGKKYEDICPSTHNMDVPNIKRNDFQLIGIQDGYLSLLQDSGEVREDLRLPEGDLGKEIEQKYDCGEEILITVLSAMTEEAAVAIKAMAKρΕχρδΑ的構(gòu)建構(gòu)建概述步驟1 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子的克隆和向pGEM T easy(Promega)中的亞克隆-產(chǎn)生 pGEM-4. 4enh #8。步驟2 最小似9啟動(dòng)子向pCpG-LacZ (Invivogen)中的亞克隆——產(chǎn)生B29-5 #3。
步驟3 :HA-eIF5AlK50E 向載體中的亞克隆——產(chǎn)生 B29-5#3_eIF5AlK5°K步驟4 在pCpG-mcs (Invivogen)中新的多克隆位點(diǎn)的產(chǎn)生——產(chǎn)生 pCpGLinker4。步驟5 :B29 DS4. 4 3' 增強(qiáng)子向pCpG_Linker4中的亞克隆——產(chǎn)生 pCpG-DHS4. 4。步驟6 啟動(dòng)子+HA_eIF5AlK5°K+SV40pA表達(dá)盒向pCpG_DHS4. 4中的亞克隆—— 廣生 pExp-5。步驟7 在pExp-5中的HA_eIF5AlK5°K用非-HA eIF5AlK50E替換——產(chǎn)生最終的載 體 pExp5A。詳細(xì)的構(gòu)津步驟1 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子的克隆和向pGEM T easy (Promega)中的亞克 隆-產(chǎn)生 pGEM-4. 4enh #8。B29 DHS4.4 3'增強(qiáng)子利用以下引物從分離自KAS細(xì)胞(人類多發(fā)性骨髄 瘤細(xì)胞系)的基因組DNA通過PCR克隆正向5，-CAGCAAGGGAGCACCTATG-3，和反向 5，-GTTGCAGTGAGCGGAGATG-3’。引物利用人類CD79B/GH-1基因間區(qū)域的序列(登記號(hào) AB062674)來設(shè)計(jì)。產(chǎn)生的608bp PCR片段亞克隆到pGEM T easy克隆載體(Promega) 中弁測序。Komatsu et al. 200z. Nove丄 regulatory regions round downstream oi the rat B29/Ig-b gene. Eur. J. Biochem. 269 :1227-1236.pGEM-4. 4enh #8 中 B29 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子 PCR 片段(297bp)的序列
ACCACCCTGGGCCAGGCTGGGCCAAGCCAGGCGGCCCCTGTGTTTTCCCCAGTCTCTGGGCTGCTGGAGGGAACCAG — TGGCTCTACTGAGCCGGAGCCCTTCCTTTCCT GCTCCTTTGCATAG TGGCACTAATTCCGTCCTCCTACCTCCACCAGGGACCTAGGCAGCCGGGTAGATGGTGGGAGGAGGCTTCACTTCTCCCCCAAGCAGGGTCTCCACCTGCTT OlなOCTOCOC TGGGTTGGGGGAGGCCTTGGCTTTACCTAAAGACTTTTTAACACCTCTO +4. 4區(qū)域含有幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)
OCT-X GCTGCTTTGCATAfipGEM-4. 4enh #8 中的 B29 DHS4. 4 3'增強(qiáng)子 PCR 片段(297bp)與人類 CD79B/GH-1 基因間區(qū)域的序列(登記號(hào)AB062674)的比對(duì)。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含靶向eIF5Al的3'末端的eIF5Al siRNA，表達(dá)載體的復(fù)合物，所述表達(dá)載體包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸，其中所述突變體eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化，和其中所述siRNA和所述表達(dá)載體復(fù)合到聚乙烯亞胺來形成復(fù)合物。
2.一種組合物，包含靶向目標(biāo)基因來抑制所述目標(biāo)基因在受試者中的內(nèi)源表達(dá)的 siRNA ；和處在RNAI抗性質(zhì)粒中、編碼能在所述受試者中表達(dá)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中所述siRNA和所述質(zhì)粒復(fù)合到聚乙烯亞胺來形成復(fù)合物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述siRNA具有附圖25中所示的序列，其中編碼所述突變體eIF5Al的多核苷酸是eIF5AlK5°K。
4.權(quán)利要求3的組合物，包含組織特異性啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的組合物，包含B細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述B細(xì)胞啟動(dòng)子是B29。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述表達(dá)載體包含pCpG質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述eIF5AlsiRNA和所述包含突變體eIF5Al多核苷酸的表達(dá)載體獨(dú)立地復(fù)合到聚乙烯亞胺。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述eIF5AlsiRNA和所述包含突變體eIF5Al多核苷酸的表達(dá)載體一起復(fù)合到聚乙烯亞胺。
10.—種組合物，其包含靶向eIF5Al的3'末端的eIF5Al siRNA和表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸，其中所述突變體eIF5Al不能被羥丁賴氨酸化， 和其中所述siRNA和所述表達(dá)載體被遞送給受試者來治療癌癥。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤。
12.—種治療癌癥的方法，包括向受試者施用權(quán)利要求10的組合物。
13.一種治療癌癥的方法，包括向受試者施用權(quán)利要求1的組合物。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物靜脈內(nèi)地、腹膜內(nèi)地或腫瘤內(nèi)地施用。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述靶向eIF5Al的3'末端的siRNA和所述包含編碼突變體eIF5Al的多核苷酸的表達(dá)載體經(jīng)由不同的途徑遞送。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物以約0.15mg/kg到約1.5mg/kg的劑量每周兩次注射來提供。
17.權(quán)利要求12的方法，其中所述組合物以約0.75mg/kg到約1. 5mg/kg的劑量每周兩次注射來提供。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向內(nèi)源基因的SIRNA來敲除或敲低宿主中內(nèi)源基因的表達(dá)、以及處在遞送運(yùn)載體/表達(dá)載體中編碼所述基因的多核苷酸向宿主遞送來提供所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在宿主中的表達(dá)的組合用途。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102282259SQ200980116212
公開日2011年12月14日 申請日期2009年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日
發(fā)明者C·A·泰勒, R·S·東德羅, 約翰·E·湯普森 申請人:森尼斯科技術(shù)公司