專利名稱：微小rna-21的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義核苷酸及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及微小RNA-21 (miRNA-21)的反義寡聚 核苷酸及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微小RNA (microRNA， miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的一類存在于真核生物中的長度約22nt的內(nèi) 源性非編碼小分子單鏈RNA。它通過與靶mRNA的3'UTR結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。 miRNA與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、造血調(diào)控和脂肪代謝等過程密切相關(guān)。研究表明， 一些造 血組織特異性的microRNA與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Calin等[1]最早發(fā)現(xiàn)與血液系統(tǒng) 腫瘤相關(guān)的miRNA是miR-15a和miR-16-l，其基因定位于染色體13ql4。在彌漫性大B細(xì) 胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)患者的腫瘤細(xì)胞中，miR-155是正常B細(xì) 胞的10 30倍[2]。兒童Burkitt淋巴瘤(BL)患者miR-155/BIC RNA表達(dá)是其他兒童白血病 的100倍[3]。當(dāng)某些miRNA在腫瘤中表達(dá)升高時，表明其可能扮演著癌基因的角色。相反， 某些miRNA在腫瘤中表達(dá)降低，提示其可能作為抑癌基因而發(fā)揮作用。此夕卜，microRNA還 與血液系統(tǒng)腫瘤的診斷、治療、預(yù)后等密切相關(guān)。反義技術(shù)是研究基因治療常用的方法之一， 當(dāng)microRNA高水平表達(dá)時，用反義寡核苷酸抑制其活性是目前比較理想的手段。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人在前期研究中，采用實(shí)時定量PCR技術(shù)檢測出人淋巴瘤Raji細(xì)胞中miRNA-21高 表達(dá)，并推測其在血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生過程中有重要的作用。
本發(fā)明的目的是提供 一 種針對成熟miRNA-21的反義寡核苷酸(anti-miRNA-21 oligonucleotides, AMO-miR-21)，它能有效的抑制miRNA-21的表達(dá)，并能直接或間接地抑制 腫瘤的發(fā)生和腫瘤的生長。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用的是反義核苷酸技術(shù)，具體技術(shù)方案是首先提供了一種 miRNA-21的反義寡核苷酸(AMO-miR-21)，其具有如SEQ ID No.l所示的核苷酸序列。
本發(fā)明的反義核苷酸可以經(jīng)過本領(lǐng)域任何已知的保護(hù)性修飾。本發(fā)明選擇microRNA-21為靶基因，導(dǎo)入上述AMO-miR-21 ，研究其對淋巴瘤細(xì)胞生長 和凋亡的影響。結(jié)果表明AMO-miR-21作用于Raji細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡明 顯增加，細(xì)胞內(nèi)microRNA-21表達(dá)水平明顯下調(diào)。說明用AMO-miR-21通過干擾miRNA-21 表達(dá)有效抑制淋巴瘤細(xì)胞生長，同時表明miRNA-21可能作為淋巴瘤基因治療的重要靶點(diǎn)?？?見，本發(fā)明的AMO-miR-21具有直接或間接抑制腫瘤的發(fā)生和腫瘤的生長的作用，可用于制 備預(yù)防或治療腫瘤的藥物，尤其是用于制備預(yù)防或治療血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤(如淋巴瘤)的藥物。
上述藥物的形式可以是現(xiàn)有技術(shù)中的各種劑型，只要其活性成分包括本發(fā)明的 AMO-miR-21 。
上述藥物可以是一種組合物，該組合物包括所述的AMO-miR-21 。 上述組合物可以包括所述的AMO-miR-21和臨床上公知的任一種可藥用的載體； 上述組合物可以和一種或幾種醫(yī)學(xué)上已知的治療藥物組合使用，例如，與其他化療藥物/ 劑組和使用。
本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的有益效果
發(fā)明人確認(rèn)了 microRNA-21作為治療或預(yù)防腫瘤，尤其是淋巴瘤的潛在新靶標(biāo)，并首先 針對該靶標(biāo)提供一種AMO-miR-21作為其特異性抑制的藥物，寡核苷酸AMO-miR-21 。 AMO-miR-21易于合成；由于是以核苷酸序列識別微小RNA miR-21 ，具有極高的特異性，更 低的毒性；AMO-miR-21可與藥用載體組成藥用組合物用于治療或預(yù)防腫瘤，并可以與其他抗 癌化療藥物聯(lián)合使用，取得更有效的抗腫瘤效果。


圖1是AMO-miR-21抑制Raji細(xì)胞活力的量效關(guān)系。
圖2是AMO- miR-21抑制淋巴瘤Raji細(xì)胞生長的時效關(guān)系(0.4pmol/L)。
圖3是細(xì)胞內(nèi)miR-21的相對表達(dá)水平。
圖4是流式細(xì)胞儀檢測AMO-miR-21誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞凋亡。
具體實(shí)施例方式
為更好的說明本發(fā)明的實(shí)施方式，下面結(jié)合實(shí)施具體說明，但是具體實(shí)施例并不在任何意 義上構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。 材料和方法1.1反義寡核苷酸的設(shè)計與合成
從microRNA數(shù)據(jù)庫中獲取人microRNA-21序列，根據(jù)序列互補(bǔ)原理設(shè)計其反義寡核苷酸 序列(AMO-miR-21)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核苷酸序列及隨機(jī)對照序列。反 義序列(SEQIDNo.l): 5，-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3，；隨機(jī)序列(SEQIDNo.2): 5'-CATTAATGTCGGACAACTCAAT-3'，均由大連寶生物有限公司合成，全硫代修飾，HPLC 純化。MTT及DMSO購自Sigma公司，新生牛血清購于杭州四季青生物工程科技有限公司， RPMI-1640培養(yǎng)基購fi G舊CO公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。 1.2細(xì)胞培養(yǎng)
將Raji細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10。/。新生牛血清、無抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于 37QC、體積分?jǐn)?shù)為5%的<:02培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2天換液傳代。實(shí)驗(yàn)選用對數(shù)生長期、 0.2%臺盼藍(lán)拒染率>95%的細(xì)胞 1.3 MTT法篩選反義寡核苷酸的最佳作用濃度 1.4臺盼藍(lán)拒染法檢測不同段時間細(xì)胞的生長狀況
實(shí)驗(yàn)分組及處理同前，反義寡核苷酸組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為0.4nmol/L。于24、 48、 72小時將每組細(xì)胞充分混勻后用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)每組活細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次，取均值。 1.5實(shí)時定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-21水平
實(shí)驗(yàn)分組同前，各組細(xì)胞以5xl04/ml的密度接種于24孔板，每孔400ul，轉(zhuǎn)染終體積500ul， 空白對照組加入與藥物同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。6小時后加入500ul 20%的血清培養(yǎng)基置 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反義寡核苷酸組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為0.4pmol/L。于48小時收集細(xì) 胞，總RNA抽提按Trizol試劑(Invitrogen公司)說明書進(jìn)行，提取的總RNA用紫外分光光 度儀(UVPupland， USA )測A260。 miR-21的相對表達(dá)水平用ACT禾B 2-^"計算。U6 snRNA 作為內(nèi)參照，檢測方法相同。實(shí)時定量PCR包括兩個步驟:逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時PCR，參照-Hairpin-itTMmiRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的說明書操作。 1.6流式細(xì)胞儀計量分析Raji細(xì)胞凋亡情況
實(shí)驗(yàn)分組同前，各組細(xì)胞以5xl0"ml的密度接種于24孔板，每孔400ul，轉(zhuǎn)染終體積500ul， 空白對照組加入與藥物同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。6小時后加入500ul20。/。的血清培養(yǎng)基置于 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反義寡核苷酸組和隨機(jī)對照組的核酸終濃度為0.4pmol/L。 48小時后離心收集 細(xì)胞，采用AnnexinV/PI二重染色，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。1.7統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±"表示，使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析法分析各 組數(shù)據(jù)差異的顯著性。以PO.05為有顯著性差異。 實(shí)施例l MTT法篩選反義寡核苷酸最佳作用濃度
AMO-miR-21在終濃度為0.2pmol/L和0.4nmol/L之間表現(xiàn)出有效抑制Raji細(xì)胞增殖活力的 效應(yīng)，其最佳作用濃度為0.4pmol/L，與隨機(jī)對照組和空白對照組相比有顯著差異(尸O.Ol)。 AMO-miR-21在0.5nmol/L以上的終濃度顯示出的非特異性作用(圖l)， 實(shí)施例2 反義寡核苷酸對細(xì)胞的生長抑制作用
終濃度0.4pmol/L的AMO-miR-21作用于Raji細(xì)胞后24小時開始表現(xiàn)出生長抑制效應(yīng)，持續(xù) 至72小時。隨機(jī)對照組、空白對照組細(xì)胞的生長基本不受影響(圖2)。 實(shí)施例3反義寡核苷酸對細(xì)胞內(nèi)miRNA-21水平的生長抑制作用
終濃度0.%imol/L的AMO-miR-21作用于Raji細(xì)胞48小時后，細(xì)胞內(nèi)miR-21相對于內(nèi) 參U6snRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，戶<0.01 (圖3)。 實(shí)施例4反義寡核苷酸對細(xì)胞凋亡的影響
終濃度0.4nmol/L的反義寡核苷酸作用于Raji細(xì)胞48小時后，經(jīng)AnnexinV/PI二重染色，采 用流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞調(diào)亡率為11.35%。與對照組相比，其調(diào)亡率明顯增加，； O.Ol (圖4)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AMO-miR-21作用于Raji細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯 增加，細(xì)胞內(nèi)microRNA-21表達(dá)水平明顯下調(diào)。說明用AMO-miR-21通過干擾miRNA-21表 達(dá)有效抑制淋巴瘤細(xì)胞生長，同時表明miRNA-21可能作為淋巴瘤基因治療的重要靶點(diǎn)?？梢姡?本發(fā)明的AMO-miR-21具有直接或間接抑制腫瘤的發(fā)生和腫瘤的生長的作用，可用于制備預(yù) 防或治療腫瘤的藥物，尤其是用于制備預(yù)防或治療血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤(如淋巴瘤)的藥物。序列表
<110> 暨南大學(xué)
<120>微小RNA-21的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用
<130> 081201
<160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> misc—feature
<223>從microRNA數(shù)據(jù)庫中獲取人microRNA-21序列，根據(jù)序列互補(bǔ)原理設(shè)計其反 義寡核苷酸序列
<400> 1
tcaacatcag tctgataagc ta 22
<210〉 2
<211〉 22<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223>隨機(jī)i照序列
<400> 2
cattaatgtc ggacaactca at
權(quán)利要求
1、一種微小RNA-21的反義寡聚核苷酸，其特征在于所述反義寡聚核苷酸具有如SEQID No．1所示的序列。
2、 權(quán)利要求1所述微小RNA-21的反義寡聚核苷酸在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的活性成分包括所述的微小 RNA-21的反義寡聚核苷酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為血液系統(tǒng)腫瘤。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為淋巴瘤。
6、 一種組合物，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的微小RNA-21的反義寡聚核苷酸。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于還包括能夠藥用的載體。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組合物，其特征在于還包括化療藥物。
9、 權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述組合物在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微小RNA-21的反義寡聚核苷酸及其應(yīng)用。本發(fā)明的反義寡聚核苷酸AMO-miR-21作用于Raji細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞內(nèi)microRNA-21表達(dá)水平明顯下調(diào)?？捎糜谥苽漕A(yù)防或治療腫瘤的藥物，尤其是用于制備預(yù)防或治療血液系統(tǒng)相關(guān)腫瘤(如淋巴瘤)的藥物。
文檔編號C12N15/11GK101418293SQ20081021963
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者唐杰坷, 李育敏, 王麗鵬, 董大偉, 嘉 費(fèi), 霍毅民 申請人:暨南大學(xué)