專利名稱：L－六氫吡啶羧酸的生物學(xué)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-六氫吡啶羧酸(或2-哌啶羧酸或L-同型脯氨酸)的制備方法以及非常適用于該制備方法的重組大腸桿菌或棒狀桿菌。
背景技術(shù)：
L-六氫吡啶羧酸作為藥品的合成原料很重要。目前，L-六氫吡啶羧酸是通過(guò)光學(xué)拆分L-賴氨酸合成法(J.Chem.Soc.Chem.Commun.1985，633～635)或吡啶甲酸合成法制備的DL-六氫吡啶羧酸來(lái)制備(Method of Enzymol.17B，174～188，1971)。作為光學(xué)拆分方法，已知有使用D-酒石酸的非對(duì)映異構(gòu)體鹽法和利用豬肝D-氨基酸氧化酶分解D型異構(gòu)體并保留L型異構(gòu)體的酶學(xué)方法。
另一方面，已知L-六氫吡啶羧酸生成在動(dòng)物(J.Biol.Chem.Vol.211，851，1954)、植物(J.Amer.Chem.Soc.Vol.74，2949，1952)或微生物(Biochemistry，Vol.1，606～612，1926；特開(kāi)平6-38781號(hào))體內(nèi)，但因蓄積量少，所以利用這些生物生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)方法還沒(méi)有達(dá)到實(shí)用化的程度。由迄今為止對(duì)L-賴氨酸的代謝研究可知，利用賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶(以下，也稱為L(zhǎng)AT)作用下的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)或利用L-賴氨酸-6-脫氫酶(J.Biochem.Vol.105，1002～1008，1989)，可以從L-賴氨酸生成Δ1-哌啶烯-6-羧酸(以下，也稱為P6C)。
雖有報(bào)道稱可以由利用氧化鉑的催化加氫方法將P6C化學(xué)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)，但還沒(méi)有有關(guān)利用P6C的生物學(xué)或酶還原生成L-六氫吡啶羧酸的報(bào)道。另外，已推斷惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)存在從D-賴氨酸開(kāi)始經(jīng)由Δ1-哌啶烯-6-羧酸生成L-六氫吡啶羧酸的代謝途徑(J.Bacteriology，Vol.149，864～871，1982)。但這種生物學(xué)途徑難以用在L-六氫吡啶羧酸的大規(guī)模生產(chǎn)中。
將上述由化學(xué)合成法制備的DL-六氫吡啶羧酸進(jìn)行光學(xué)拆分的方法，使用的光學(xué)拆分劑價(jià)格高且操作繁瑣，另外，在光學(xué)拆分中使用酶的方法由于需使用純化酶，也將導(dǎo)致成本升高。兩種方法均由于這些缺點(diǎn)導(dǎo)致工業(yè)制備方法效率低，且無(wú)法低成本制備L-六氫吡啶羧酸。
此外，以往利用微生物制備L-六氫吡啶羧酸的方法，由于蓄積量低，也難以進(jìn)行實(shí)用化。
發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明人等這次發(fā)現(xiàn)，下述將Δ1-吡咯啉-6-羧酸還原為L(zhǎng)-脯氨酸的吡咯啉-5-羧酸還原酶[EC 1.5.1.2]， 也可將下述P6C有效地還原為相應(yīng)的L-六氫吡啶羧酸。 P6CL-六氫吡啶羧酸另外，還發(fā)現(xiàn)這種還原體系非常適合與其它生物學(xué)P6C生產(chǎn)體系組合使用。
本發(fā)明正是基于這些認(rèn)識(shí)，通過(guò)利用吡咯啉-5-羧酸還原酶的作用，提供有效制備L-六氫吡啶羧酸的方法。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及L-六氫吡啶羧酸的制備方法，該方法包括使用吡咯啉-5-羧酸還原酶進(jìn)行Δ1-哌啶烯-6-羧酸(P6C)的還原的步驟。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，P6C的還原步驟可與使用賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶(LAT)將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為P6C的轉(zhuǎn)換步驟組合。
另外，本發(fā)明也涉及含有可表達(dá)狀態(tài)的LAT編碼基因的重組大腸桿菌或棒狀桿菌。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明


圖1是用于在大腸桿菌中由L-賴氨酸生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸的本發(fā)明相關(guān)質(zhì)粒的概略圖。
圖2是用于在棒狀桿菌中生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸的本發(fā)明相關(guān)質(zhì)粒的概略圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案在本發(fā)明中，稱為“外來(lái)的...基因”時(shí)，不管對(duì)所提及的細(xì)胞或微生物是否為異源或同源，都是指與提及到的細(xì)胞本身不同的細(xì)胞來(lái)源的基因。
本發(fā)明中所說(shuō)的吡咯啉-5-羧酸還原酶(EC 1.5.1.2；以下，也稱為P5C還原酶)已知是參與由精氨酸、谷氨酸合成脯氨酸的代謝途徑的酶，該酶在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的協(xié)助下，如上所示，具有將Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原成脯氨酸的活性。已知P5C還原酶廣泛分布于各種細(xì)菌、植物和動(dòng)物中。
可用于本發(fā)明的P5C還原酶，只要具有將P6C還原為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸的活性，則對(duì)其來(lái)源沒(méi)有限制。P5C還原酶的存在形式可以選自純化物、類似細(xì)胞裂解物的調(diào)制物以及活細(xì)胞中任意一種。而使用調(diào)制物時(shí)，為了按照本發(fā)明進(jìn)行還原，根據(jù)需要可使NADH或NADPH共存。
可是按照本發(fā)明，需用P5C還原酶還原的Δ1-哌啶烯-6-羧酸(P6C)，相當(dāng)于在賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶(LAT)作用下由L-賴氨酸生成的2-氨基己二酸6-半醛經(jīng)非酶脫水閉環(huán)后的形式。通常，該半醛被看作是在水溶液中作為P6C的平衡混合物而存在的化合物，所以在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，P6C和該半醛可以理解為等價(jià)的化合物。因此，在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，P6C能夠以P6C本身、或P6C與該半醛的混合物、或該半醛本身的形式添加，這些形式均包括在本發(fā)明中。
P6C(或2-氨基己二酸6-半醛)可以使用通過(guò)化學(xué)合成方法或生物學(xué)方法等任一方法制備的P6C，但從制備特定光學(xué)異構(gòu)體L-六氫吡啶羧酸的經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，優(yōu)選使用具有與L-六氫吡啶羧酸相對(duì)應(yīng)立體構(gòu)型(具體來(lái)說(shuō)，第2位碳是不對(duì)稱碳)的P6C。
按照本發(fā)明還原P6C的步驟，由在通常進(jìn)行酶反應(yīng)的條件下使P5C還原酶作用于P6C來(lái)實(shí)施。如上所述，P5C還原酶可以采取純化物、類似細(xì)胞裂解物的提取物以及活細(xì)胞中任一形式作用于P6C。然而，考慮到諸如NADH或NADPH等輔酶參與該酶反應(yīng)，因此優(yōu)選使用細(xì)胞裂解物或活細(xì)胞本身。而作為細(xì)胞，在表現(xiàn)出具有將P6C轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸(即，還原)能力的P5C還原酶活性的微生物中，可特別優(yōu)選使用大腸桿菌或棒狀桿菌。已知在大腸桿菌中存在著編碼P5C還原酶的基因proC，而且對(duì)于proC的序列和其表達(dá)情況也已有報(bào)道(參照A.H.Deutch et al.，Nucleic Acids Research，Vol.10，1982，7701-7714)。
因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，對(duì)具有P5C還原酶活性的大腸桿菌或含有可表達(dá)狀態(tài)的上述基因proC的大腸桿菌或其它微生物和P6C，通過(guò)在這些微生物可生存且可產(chǎn)生P5C還原酶活性條件下進(jìn)行溫育，可以將P6C還原為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸。在本說(shuō)明書中，含有或整合可表達(dá)狀態(tài)的特定基因是指，該基因根據(jù)需要以與啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子相伴的形式整合在宿主細(xì)胞的染色體中，或該基因以與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子相伴整合在表達(dá)載體中的形式含在宿主細(xì)胞中。上述產(chǎn)生P5C還原酶活性的條件是指各個(gè)微生物能夠生存的條件，優(yōu)選的是處于可以增殖的培養(yǎng)條件下。這些條件是業(yè)內(nèi)人士眾所周知的條件，并且業(yè)內(nèi)人士以下述實(shí)施例為參照，可以容易地進(jìn)行設(shè)定。
可以將P6C直接添加到上述微生物的懸浮液或培養(yǎng)物中進(jìn)行目的反應(yīng)，但根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選利用賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶(LAT)，通過(guò)將容易入手的L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為P6C的轉(zhuǎn)換步驟與利用上述P5C還原酶的還原步驟組合，將P6C供給到還原步驟。在這種組合中，使用大腸桿菌作為P5C還原酶源時(shí)，通常由于大腸桿菌中不存在催化L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為P6C過(guò)程的酶系，或即使存在其活性也很低，所以需將異源細(xì)胞的LAT酶系與該大腸桿菌的酶系組合?？捎糜谶@種組合中的LAT，只要具有將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為P6C的活性，則對(duì)其來(lái)源沒(méi)有限制，例如優(yōu)選泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)的LAT。作為該微生物的典型代表，例如已知IFO 3084株通?？捎糜贚-賴氨酸的生物分析，并具有LAT活性(Soda et al.，Biochemistry Vol.7，4102-4109，1968；同4110-4119)。此外，一定的泥色黃桿菌因其本身具有的Δ1-哌啶烯-6-羧酸脫氫酶作用，具有將P6C氧化至α-氨基己二酸的能力(Biochem J.Vol.327，59-64，1977)。再者，在P5C還原酶或P6C還原酶活性作用下由P6C生成的L-六氫吡啶羧酸，還有可能通過(guò)某些代謝途徑轉(zhuǎn)換為其它化合物。因此，通常使用該細(xì)菌的酶系時(shí)，不能將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸，而即使發(fā)生轉(zhuǎn)換，有時(shí)也不蓄積L-六氫吡啶羧酸。所以，為了達(dá)到本發(fā)明的目的，優(yōu)選象上述那樣對(duì)異源細(xì)胞(或微生物)間的酶系進(jìn)行組合。作為這種酶系組合的微生物沒(méi)有限定，如在上述大腸桿菌中以可表達(dá)的形式整合編碼泥色黃桿菌LAT的lat基因，反之，將大腸桿菌的proC基因整合到泥色黃桿菌，另外，為了本發(fā)明的其它目的，還可同時(shí)將lat和proC以可表達(dá)形式整合到可適用的宿主微生物中。各個(gè)基因向宿主的整合可以通過(guò)重組質(zhì)粒導(dǎo)入，或者是以可直接表達(dá)的方式整合到宿主的染色體中。而以泥色黃桿菌作為宿主時(shí)，由于該微生物可通過(guò)代謝途徑將生成的L-六氫吡啶羧酸進(jìn)一步代謝，所以根據(jù)需要也可以使用將有關(guān)代謝途徑封閉的變異株。按照本發(fā)明，從酶系的穩(wěn)定性、處理的容易程度、轉(zhuǎn)換效率高等觀點(diǎn)出發(fā)，適于將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸的酶系使用大腸桿菌(根據(jù)情況，也可成為proC的供給源)作宿主，適于使用的是在該宿主中至少整合了泥色黃桿菌的lat而構(gòu)建的重組子。另外，使用大腸桿菌作為宿主時(shí)，除了lat以外也可以整合外來(lái)的proC基因，特別是為了使作為起始原料的L-賴氨酸容易被吸收進(jìn)菌體內(nèi)，優(yōu)選整合編碼外來(lái)大腸桿菌的賴氨酸特異攝入(或透過(guò))酶的基因(也稱為與賴氨酸的吸收有關(guān)的基因)。作為這種基因的代表性例子沒(méi)有限定，如編碼賴氨酸特異性通透酶的基因(lysP)和構(gòu)成參與賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸攝入的LAO系統(tǒng)的蛋白質(zhì)的編碼基因(argT、hisP及hisQ)。例如J.Bacteriol.，Vol.174，3242-3249，1992中報(bào)道通過(guò)多拷貝質(zhì)粒導(dǎo)入lysP的大腸桿菌，其賴氨酸的攝入速度上升了20多倍。
如上所述，可應(yīng)用在本發(fā)明中的酶系或基因的組合體系，其本身可依據(jù)業(yè)內(nèi)人士常用的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA相關(guān)技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建或制作。這樣的技術(shù)例如可參照Sambroo k，F(xiàn)ritsch和Maniatis編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)；《DNA克隆》卷I和II(D.N.Glover編著，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編著，1984)；Mullis等的美國(guó)專利第4683195號(hào)，《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，1984)等。
關(guān)于本發(fā)明中特別優(yōu)選使用的酶系或微生物的構(gòu)建乃至制作，以及關(guān)于使用大腸桿菌(以下，略作E.coli)作為宿主的內(nèi)容，在以下進(jìn)行具體的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于此。宿主和載體系統(tǒng)可以適當(dāng)使用各種市售的宿主和載體，這里，例如作為宿主可以使用大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌BL21或大腸桿菌C600株，作為載體可以使用pET系列或pUC系列。除此之外的載體，優(yōu)選使用通商產(chǎn)業(yè)省“重組DNA技術(shù)工業(yè)化指南”指南第二章第三2.(2)中所述的相應(yīng)載體。Lat基因的克隆和表達(dá)利用疏水色譜、離子交換色譜、凝膠排阻色譜從泥色黃桿菌IFO3084株的培養(yǎng)上清純化出LAT。通過(guò)使用鄰氨基苯甲醛的生色法(Biochemistry，Vol.7，4102～4109，1968)測(cè)定LAT的酶活性。純化LAT的N末端氨基酸序列測(cè)定為KLLAPLAPLRAHAGTRLTQGL，根據(jù)該氨基酸序列設(shè)計(jì)混合引物，通過(guò)PCR從泥色黃桿菌IFO 3084株的基因組DNA中擴(kuò)增lat的DNA片段，再以得到的DNA片段作為基礎(chǔ)，通過(guò)反PCR法獲得由大約1.6kb構(gòu)成的lat全長(zhǎng)基因。lat的DNA序列和LAT的氨基酸序列如序列號(hào)1所示。另外，如有必要的話，有關(guān)lat基因克隆的詳細(xì)情況可以參照與本申請(qǐng)同時(shí)申請(qǐng)的國(guó)際申請(qǐng)PCT/J99/04197。
根據(jù)確定的lat基因堿基序列，制作將lat基因的N末端ATG附近改變?yōu)镹deI位點(diǎn)的正向DNA引物(序列號(hào)2)以及終止密碼下游改變?yōu)锽amHI的反向DNA引物(序列號(hào)3)，ETlaNdeFTCCATATGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGCCCETlaBamRGCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG利用這些引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出lat基因區(qū)的約1.6kbp片段。將該擴(kuò)增片段用限制性酶NdeI和BamHI進(jìn)行消化，得到的產(chǎn)物作為插入DNA溶液。另外，用限制性酶NdeI和BamHI對(duì)表達(dá)載體pET11a(Novagen公司生產(chǎn))進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))將消化的載體與插入DNA溶液連接構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pET1at。pET1at是按可表達(dá)天然LAT蛋白質(zhì)而進(jìn)行設(shè)計(jì)的質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化的菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)pET1at株。
用pUC19替代表達(dá)載體pET11a，并且使用宿主大腸桿菌BL21株時(shí)，根據(jù)上述lat基因的堿基序列，制作將lat基因的N末端ATG附近改變?yōu)镠indIII位點(diǎn)的正向DNA引物(序列號(hào)4)以及終止密碼下游改變?yōu)锽amHI的反向DNA引物(序列號(hào)3)，lathiF19ATAAGCTTGTCCCTTCTTGCCCCGCTCGCETlaBamRGCGGATCCTGTTGCCGCTGGTGCCGGGCAG利用這些引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增lat基因區(qū)的約1.6kbp的片段。將該擴(kuò)增片段用限制性酶HindIII和BamHI進(jìn)行消化，得到的產(chǎn)物作為插入DNA溶液。另外，用HindIII和BamHI對(duì)載體pUC19進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))將消化的載體與插入DNA溶液連接構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pUC1at(參照
圖1)。pUC1at是按可表達(dá)LacZ-LAT融合蛋白而進(jìn)行設(shè)計(jì)的質(zhì)粒。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化的菌株命名為大腸桿菌BL21 pUC1at株。
用添加了L-賴氨酸的培養(yǎng)基(細(xì)菌用胰化蛋白胨1.5％，酵母提取物3.0％，甘油0.5％，pH7.0)分別對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)pET1at株和大腸桿菌BL21pUC1at株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在各自培養(yǎng)基中可以看到有L-六氫吡啶羧酸的蓄積。這意味著在作為宿主的大腸桿菌中存在著還原通過(guò)LAT的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)由L-賴氨酸生成的P6C的酶。
對(duì)該P(yáng)6C還原酶進(jìn)行了研究。從大腸桿菌總基因組的基因信息推測(cè)P5C還原酶也可使P6C還原，進(jìn)而利用作為proC缺失株的proC32變異株大腸桿菌RK4904株(從耶魯大學(xué)的E.coli Genetic Stock Center獲得)，對(duì)proC在L-六氫吡啶羧酸生產(chǎn)中的作用進(jìn)行了研究。首先，為了研究proC(參照序列號(hào)5)的效果，嘗試了將proC導(dǎo)入到pUClat中。制作可擴(kuò)增末端附加KpnI位點(diǎn)且含有proC的約1.5kbp片段的DNA引物(序列號(hào)6和7)，procKpnFAGGGTACCATAAAATCGCGCATCGTCAGGCprocKpnRCCGGTACCGCCACAGGTAACTTTACGGATT利用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。約1.5kbp的該擴(kuò)增片段經(jīng)限制性酶KpnI消化的產(chǎn)物作為插入DNA溶液。另外，用限制性酶KpnI對(duì)pUClat進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))對(duì)消化的載體與插入DNA溶液進(jìn)行連接反應(yīng)。Lat和proC相互正向連接的質(zhì)粒命名為pUClatproC。
用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌RK4904進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的菌株命名為大腸桿菌RK4904pUClatproC菌株。再制作只負(fù)載proC的質(zhì)粒。即，用限制性酶BamHI和HindIII對(duì)pUClatproC進(jìn)行消化，然后用Blunting Kit(TaKaRa生產(chǎn))進(jìn)行平末端化，將自身連接的質(zhì)粒命名為pUCproC。用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌RK4904進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的菌株命名為大腸桿菌RK4904pUCproC株。利用由此構(gòu)建的大腸桿菌RK4904pUC19株、大腸桿菌RK4904pUClat株、大腸桿菌RK4904pUCproC株、以及大腸桿菌RK4904pUClatproC株進(jìn)行L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果只在大腸桿菌RK4904pUClatproC株中發(fā)現(xiàn)有L-六氫吡啶羧酸的蓄積，而在其它菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)。
該結(jié)果表明，lat和proC兩者在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)時(shí)才能促使L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)，而且作為proC編碼的蛋白質(zhì)P5C還原酶也可使P6C還原。據(jù)本發(fā)明人等的了解，迄今為止的文獻(xiàn)中還未報(bào)道過(guò)還原P6C的酶，而本說(shuō)明書是第一次對(duì)此進(jìn)行報(bào)道。lysP基因的克隆以及與lat基因同時(shí)整合根據(jù)上述J.Bacteriol.，vol.174，3242-3249，1992的文獻(xiàn)，賴氨酸向大腸桿菌內(nèi)的摻入速度有可能成為利用大腸桿菌生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸時(shí)生產(chǎn)速度的限速步驟。因此，以下嘗試了將賴氨酸特異性通透酶的編碼基因lysP導(dǎo)入到質(zhì)粒pETlat中。根據(jù)大腸桿菌lysP的基因序列信息(參照序列號(hào)8)，制作可擴(kuò)增末端附加Bg1II、BamHI位點(diǎn)且含有l(wèi)ysP的約2.2kbp片段的DNA引物(序列號(hào)9和10)，lysPBgBmFTGAGATCTGGATCCTGCGTGAACGCGGTTClysPBgBmRGCAGATCTGGATCCCAGAAAGCCGGAACAG利用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)并克隆lysP。約2.2kbp的該擴(kuò)增片段經(jīng)限制性酶Bg1II消化的產(chǎn)物作為插入DNA溶液。另外，用限制性酶Bg1II對(duì)pETlat進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))對(duì)消化的載體與插入DNA溶液進(jìn)行連接反應(yīng)。這樣構(gòu)建的Lat和lysP相互反向連接的質(zhì)粒命名為pETlatlysP，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP株。用該大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP株和其他用預(yù)先制作的pETlat轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)pETlat株進(jìn)行L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)試驗(yàn)，結(jié)果可以確認(rèn)大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP株生產(chǎn)的L-六氫吡啶羧酸比大腸桿菌BL21(DE3)pETlat株多3倍。
約2.2kbp的上述擴(kuò)增片段經(jīng)限制性酶BamHI消化的產(chǎn)物作為插入DNA溶液。另外，用限制性酶BamHI對(duì)pUClat進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))對(duì)消化的載體與插入DNA溶液進(jìn)行連接反應(yīng)。這樣構(gòu)建的Lat和lysP相互正向連接的質(zhì)粒命名為pUClatlysP(參照
圖1)，用該質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌BL21進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為大腸桿菌BL21pUClatlysP株。用該大腸桿菌BL21pUClatlysP株和大腸桿菌BL21pUClat株進(jìn)行L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)試驗(yàn)，結(jié)果可以確認(rèn)大腸桿菌BL21pUClatlysP株生產(chǎn)的L-六氫吡啶羧酸比大腸桿菌BL21pUClat株多3倍。所以，用大腸桿菌作為宿主時(shí)，有希望增強(qiáng)lysP基因的表達(dá)。本發(fā)明的大腸桿菌BL21pUClatlysP于1999年12月20日委托日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1-3號(hào)的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為FERM P-17681，隨后根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，上述保藏移交到該研究所的國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為FERM BP-7326。yeiE基因的導(dǎo)入為了提高BL21pUClatlysP株的L-六氫吡啶羧酸生產(chǎn)能力，嘗試了進(jìn)一步提高lysP活性。通過(guò)大腸桿菌基因組計(jì)劃，已明確了lysP周圍區(qū)域的DNA序列。根據(jù)該DNA序列，可知在lysP的上游存在著與lysP串聯(lián)排列的基因yeiE(參照序列號(hào)11)。由yeiE的氨基酸序列可知yeiE是細(xì)菌中較為保守的lysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。可以推測(cè)該yeiE調(diào)控lysP的轉(zhuǎn)錄，所以通過(guò)將yeiE和lysP一起搭載到質(zhì)粒上，預(yù)計(jì)可使lysP的轉(zhuǎn)錄量增大，L-賴氨酸的攝入能力上升，L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)能力提高。
該質(zhì)粒pUClatlysPL構(gòu)建過(guò)程如下。利用末端附加Bg1II位點(diǎn)的正向DNA引物(序列號(hào)12)以及末端附加kpnI位點(diǎn)的反向DNA引物(序列號(hào)13)進(jìn)行PCR反應(yīng)，ATAGATCTCTTGTTGCCTAAAACCATCCCCAAGTGGTACCCCCCAGAAAGCCGGAACAGCCTC擴(kuò)增含有yeiE和lysP的約1.5kbp片段。該擴(kuò)增片段經(jīng)限制性酶Bg1II和kpnI消化的產(chǎn)物作為插入DNA。另外，用限制性酶BamHI和kpnI對(duì)pUClatlysP進(jìn)行消化，然后使用Ligation Kit version 2(TaKaRa公司生產(chǎn))對(duì)消化的載體與插入DNA進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后的質(zhì)粒命名為pUClatlysPL(參照
圖1)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，轉(zhuǎn)化后的菌株命名為大腸桿菌BL21pUClatlysPL株。argT基因的克隆和導(dǎo)入已知lysP在賴氨酸濃度高時(shí)其表達(dá)被抑制，而賴氨酸濃度低時(shí)受到誘導(dǎo)(J.Bacteriol.Vol.178，5522-5528，1996)。所以，謀劃了導(dǎo)入?yún)⑴c賴氨酸向細(xì)胞內(nèi)摻入的基因。目前，已知在大腸桿菌中存在著使賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸進(jìn)入菌體內(nèi)的系統(tǒng)(LAO系統(tǒng))(Jounal ofBiological Chemistry，Vol.265，p1783-1786，1990)。而通過(guò)基因組計(jì)劃闡明的大腸桿菌的基因argT，由于與已明確在鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中參與LAO系統(tǒng)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.78，p6038-6042，1981)的argT有很高的同源性，所以可以預(yù)料大腸桿菌的argT參與賴氨酸攝入過(guò)程的可能性很高。
因此為了研究argT的效果，如下所述，構(gòu)建了搭載lat和argT的質(zhì)粒pUClatargT。argTkpnFTCGGTACCTCGACATTTTGTTTCTGCCargTkpnRATGGTACCATAAAATTGACCATCAAGG使用以上兩個(gè)引物(序列號(hào)14和15)，以大腸桿菌的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增argT。PCR反應(yīng)條件是將98℃20秒、60℃30秒、68℃1分鐘作為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。約1.5kbp的該擴(kuò)增片段用限制性酶KpnI消化，導(dǎo)入到pUClatlysPL的KpnI位點(diǎn)。在所得質(zhì)粒的ScaI位點(diǎn)導(dǎo)入四環(huán)素抗性基因。即，以pBR322為模板，用末端附加了ScaI位點(diǎn)的引物(序列號(hào)16和17)，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因。TetFTTAGTACTCTTATCATCGATAAGCTTTAATTetRGCAGTACTACAGTTCTCCGCAAGAATTGAT擴(kuò)增片段導(dǎo)入存在于pUClatlysPL的氨芐青霉素抗性基因內(nèi)的ScaI位點(diǎn)，將該質(zhì)粒命名為pUClatlysPLargT-tet。而導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌BL21株命名為大腸桿菌BL21pUClatlysPLargT-tet。argT的DNA序列和氨基酸序列如序列號(hào)18所示。棒狀桿菌中的lat轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建和表達(dá)如上所述，利用表達(dá)lat的大腸桿菌，并通過(guò)由L-賴氨酸向L-六氫吡啶羧酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，可以確立L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)體系。已知在該重組大腸桿菌體系中，賴氨酸向菌體內(nèi)的摻入過(guò)程有時(shí)可能是六氫吡啶羧酸生產(chǎn)的限速步驟，所以希望提供不向培養(yǎng)液中添加L-賴氨酸，而是由細(xì)菌自身生產(chǎn)L-賴氨酸后，再轉(zhuǎn)換為六氫吡啶羧酸的六氫吡啶羧酸直接生產(chǎn)菌。這種愿望可以按照如下所述的策略來(lái)實(shí)施。L-賴氨酸可以通過(guò)谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)大量發(fā)酵生產(chǎn)。因此，如果可將lat插入到已確立為谷氨酸棒桿菌載體體系的pC2質(zhì)粒(PLASMID，Vol.36，62-66，1996)，并導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌ATCC31831后表達(dá)lat，則可以將在菌體內(nèi)生物合成的L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為P6C，進(jìn)而通過(guò)谷氨酸棒桿菌基因組中編碼的proC表達(dá)生產(chǎn)的吡咯啉-5-羧酸還原酶，就可將P6C轉(zhuǎn)換為六氫吡啶羧酸。這種策略的有效性例如可以通過(guò)以下的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。
使用上述pC2質(zhì)粒，如下所述，構(gòu)建了lat表達(dá)質(zhì)粒pClat。ClatBamFGGGGTACCCATGTCCCTTCTTGCCCCGCTClatBamRGGGGATCCCGGGGCCTGTTGCCGCTGGT使用以上兩個(gè)引物(序列號(hào)19和20)，以泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增lat。PCR反應(yīng)條件是將98℃20秒、68℃2分鐘作為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。約1.5kbp的該擴(kuò)增片段用kpnI和BamHI消化，然后與pC2的kpnI、BamHI位點(diǎn)連接(圖2)。利用在大腸桿菌JM109中導(dǎo)入了該質(zhì)粒pClat的菌株，進(jìn)行由L-賴氨酸向六氫吡啶羧酸的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，即可確認(rèn)具有LAT活性。
接下來(lái)用pClat對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，將谷氨酸棒桿菌接種在3ml的L培養(yǎng)基上，于32℃振蕩培養(yǎng)17小時(shí)。將該培養(yǎng)液30μl接種到3ml的L培養(yǎng)基上，于32℃振蕩培養(yǎng)2.5小時(shí)。向培養(yǎng)液中加入1.5μl青霉素G鉀溶液(2mg/ml)，再振蕩培養(yǎng)1.5小時(shí)。從全部培養(yǎng)液中收集菌體，用10％甘油溶液5ml洗滌后，懸浮于10％甘油溶液700μl中，該懸浮液作為電穿孔液。向200μl電穿孔液中加入0.5μl溶解在TE溶液中的質(zhì)粒(200μg/ml)，于12.5kV/cm、25uF、200Ω條件下進(jìn)行電穿孔。加入1ml L培養(yǎng)基，于32℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后，涂在含有卡那霉素(10μg/ml)的平板上，于32℃培養(yǎng)3天，通過(guò)篩選出現(xiàn)的菌落可以得到目的轉(zhuǎn)化株。
在本說(shuō)明書中，棒狀(coryneform)桿菌典型的是屬于棒狀桿菌屬(Corynebacterium)并生產(chǎn)L-賴氨酸的細(xì)菌，但只要符合本發(fā)明目的，無(wú)論屬于哪一種均可在本發(fā)明中加以應(yīng)用。上述各基因或DNA序列的改變體根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于編碼上述各個(gè)酶的基因或DNA，只要是在嚴(yán)格條件下分別與這些序列(例如參照序列號(hào)1、序列號(hào)5、序列號(hào)8、序列號(hào)11和序列號(hào)18)雜交，并通過(guò)它們的表達(dá)而生產(chǎn)的多肽具有各自目的酶活性的話，任意一種改變體均可包含在本發(fā)明中所提到的賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因、吡咯啉-5-羧酸還原酶編碼基因、賴氨酸特異性攝入酶編碼基因以及l(fā)ysP轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因中。
對(duì)于嚴(yán)格條件業(yè)內(nèi)人士眾所周知，例如上述Sambrook等的9.31～9.62頁(yè)中所述的條件。這些改變體以缺失或附加一個(gè)或一個(gè)以上的被認(rèn)為對(duì)各種目的酶活性非必需的或者不會(huì)帶來(lái)壞影響的氨基酸殘基，或者在具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基之間相互進(jìn)行置換，例如在具有堿性側(cè)鏈(賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)、酸性側(cè)鏈(天冬氨酸、谷氨酸等)、中性側(cè)鏈(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸等)、非極性側(cè)鏈(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸等)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸等)的氨基酸殘基之間進(jìn)行置換作為指標(biāo)，通過(guò)其本身已知的點(diǎn)突變、部位特異性誘變法等或化學(xué)合成法等制備。另外，將這種基因?qū)胨拗骷?xì)胞或進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可以按照上述操作或業(yè)內(nèi)人士眾所周知的方法進(jìn)行。
另外，生成的六氫吡啶羧酸是否是L型的確認(rèn)，可以通過(guò)使用手性柱的HPLC法(Agric.Biol.Chem.，Vol.52，1113～1116，1988)進(jìn)行。柱子用DAICEL CHIRAL PAK WH(4.6×250mm，DAICEL生產(chǎn))，流動(dòng)相用0.25mM硫酸銅水溶液，柱溫為50℃、流速為1.0ml/分鐘、檢測(cè)在UV243nm進(jìn)行。在該HPLC條件下，D型六氫吡啶羧酸的保留時(shí)間為11.5分鐘，L型六氫吡啶羧酸的保留時(shí)間為15分鐘。對(duì)通過(guò)本發(fā)明的重組大腸桿菌生產(chǎn)的六氫吡啶羧酸進(jìn)行分析，結(jié)果表明生產(chǎn)的六氫吡啶羧酸的上述保留時(shí)間為15分鐘。
實(shí)施例以下，結(jié)合實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例中的L-六氫吡啶羧酸的定量是在進(jìn)行丹磺酰化后，以脯氨酸作為內(nèi)標(biāo)，通過(guò)高速液相色譜(以下，略為HPLC)進(jìn)行定量。即，用蒸餾水將培養(yǎng)上清稀釋100倍，將其中的10μl移到eppendorf管中，然后向其中加入200μl含有5μg/ml脯氨酸的40mM碳酸鋰緩沖液(pH9.5)和100μl溶解在乙腈中的3.0mg/ml的丹磺酰氯，攪拌并于室溫、暗處反應(yīng)2小時(shí)。加10μl的2％甲胺鹽酸鹽后進(jìn)行攪拌，其上清作為分析樣品。HPLC分析條件如下柱子用YMC-Pack ODS-AA-303(4.6×250mm，YMC生產(chǎn))，流動(dòng)相用含有0.003M L-脯氨酸、0.0015M硫酸銅、0.0039M乙酸銨的33.2％乙腈溶液(用氨水將pH調(diào)至7)，流速為0.8ml/分鐘，室溫，檢測(cè)用激發(fā)波長(zhǎng)366nm、熒光510nm進(jìn)行。在這種條件下，L-六氫吡啶羧酸的保留時(shí)間為13分鐘。實(shí)施例1對(duì)大腸桿菌BL21pUClatlysP(FERM BP-7326)株、大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP株、大腸桿菌C600pUClatlysP株和大腸桿菌BL21pUClatlysPL株進(jìn)行L-六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)試驗(yàn)。將各個(gè)菌株分別接種于3ml含有50μg/ml氨芐青霉素鈉的L培養(yǎng)基(聚胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.2)中，于32℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將這些作為種菌，各取275μl接種于27.5ml含有氨芐青霉素鈉100μg/ml的TB培養(yǎng)基(甘油0.44％，細(xì)菌用胰化蛋白胨1.33％，細(xì)菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)中，分別于32℃振蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。另外，對(duì)于使用大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP等pET型載體的微生物的培養(yǎng)，為了誘導(dǎo)lat，加入100mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)275μl，再于32℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。相對(duì)于此，使用pUC型載體時(shí)不用添加IPTG。向上述培養(yǎng)液中分別加入50％L-賴氨酸鹽酸鹽500μl和溶解在磷酸緩沖液(pH6.8)中的50％甘油250μl，繼續(xù)于32℃振蕩培養(yǎng)。于添加L-賴氨酸鹽酸鹽后的15小時(shí)、39小時(shí)、63小時(shí)、87小時(shí)、120小時(shí)、159小時(shí)再添加50％L-賴氨酸鹽酸鹽500μl和溶解在磷酸緩沖液(pH6.8)中的50％甘油250μl。于15小時(shí)、39小時(shí)、63小時(shí)、87小時(shí)、120小時(shí)、159小時(shí)、207小時(shí)取100μl樣品，用HPLC對(duì)L-六氫吡啶羧酸進(jìn)行定量。定量結(jié)果表明，各菌株在培養(yǎng)液中蓄積的L-六氫吡啶羧酸的濃度如下大腸桿菌BL21pUClatlysP 10g/l大腸桿菌BL21(DE3)pETlatlysP 26g/l大腸桿菌C600pUClatlysP 0.8g/l大腸桿菌BL21pUClatlysPL 15g/l實(shí)施例2為了闡明P5C還原酶在L-六氫吡啶羧酸生產(chǎn)中的作用，對(duì)以proC缺失株大腸桿菌RK4904株作為宿主的重組菌株大腸桿菌RK4904pUC19株、大腸桿菌RK4904pUClat株、大腸桿菌RK4904pUCproC株、以及大腸桿菌RK4904pUClatproC株進(jìn)行了L-六氫吡啶羧酸生產(chǎn)性能的研究。將各個(gè)菌株分別接種于3ml含有氨芐青霉素鈉50μg/ml的L培養(yǎng)基(聚胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl0.5％，葡萄糖0.1％，pH7.2)中，于32℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將這些作為種菌，各取275μl接種于27.5ml含有氨芐青霉素鈉50μg/ml的TB培養(yǎng)基(甘油0.44％，細(xì)菌用胰化蛋白胨1.33％，細(xì)菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)中，分別于32℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。向上述培養(yǎng)液中分別加入50％L-賴氨酸鹽酸鹽500μl和溶解在磷酸緩沖液(pH6.8)中的50％甘油500μl，繼續(xù)于32℃振蕩培養(yǎng)。于40小時(shí)時(shí)取100μl樣品，用HPLC對(duì)L-六氫吡啶羧酸進(jìn)行定量。定量結(jié)果表明，只有大腸桿菌RK4904pUClatproC菌株蓄積了0.765g/l的L-六氫吡啶羧酸，而在其它菌株中沒(méi)有看到六氫吡啶羧酸蓄積。實(shí)施例3使用大腸桿菌C600pUClatlysP株對(duì)培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行研究。使用培養(yǎng)基組成中用各種碳源替換TB培養(yǎng)基(甘油0.44％，細(xì)菌用胰化蛋白胨1.33％，細(xì)菌用酵母提取物2.67％，KH2PO40.21％，K2HPO41.14％)的甘油的培養(yǎng)基。對(duì)于作為碳源的甘油、丙酮酸鈉、檸檬酸、丙酸、馬來(lái)酸、乳酸、DL-蘋果酸進(jìn)行了研究。向250ml體積的三角燒瓶中加入25ml的培養(yǎng)基，于32℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)的L-六氫吡啶羧酸的蓄積量分別為4.8g/l、3.3g/l、2.8g/l、2.6g/l、3.5g/l、4.7g/l、4.7g/l。表明在本發(fā)明中作為碳源也可以使用有機(jī)酸。實(shí)施例4 由菌體破碎物生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸將大腸桿菌RK4904pUC19株、大腸桿菌RK4904pUClat株、大腸桿菌RK4904pUCproC株、以及大腸桿菌RK4904pUClatproC株分別接種于3ml含有氨芐青霉素鈉50μg/ml的L培養(yǎng)基中，于32℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將這些作為種菌，各取275μl接種于50ml的含有氨芐青霉素鈉50μg/ml的L培養(yǎng)基中，于32℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。對(duì)該培養(yǎng)液進(jìn)行離心，用0.85％NaCl洗滌菌體，將加了2ml BugBuster(Novagen)的上清作為菌體破碎液。向這些菌體破碎液100μl中加入1ml含有L-賴氨酸-HCl 20μmol、2-酮戊二酸20μmol、磷酸吡哆醇0.075μmol、以及β-NAD+200μmol的0.2M磷酸緩沖液(pH7.2)，于32℃放置15小時(shí)。將這些反應(yīng)液5μl點(diǎn)到TLC板上(Merck Art.13143)，用展開(kāi)液(1-丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1)展開(kāi)后，進(jìn)行茚三酮顯色。結(jié)果可以確認(rèn)，只有在大腸桿菌RK4904pUClatproC株菌體破碎液中出現(xiàn)了L-六氫吡啶羧酸斑點(diǎn)。這表明通過(guò)在質(zhì)粒上編碼的lat基因生成的LAT和由proC生成的吡咯啉-5-羧酸還原酶，即使在試管反應(yīng)中也能夠生產(chǎn)L-六氫吡啶羧酸。實(shí)施例5與pUClatlysPLargT-tet同樣，構(gòu)建在pUClatlysPL的ScaI位點(diǎn)導(dǎo)入了四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒pUClatlysPL-tet，并進(jìn)行如下的轉(zhuǎn)換反應(yīng)。
將大腸桿菌BL21pUClatlysPLargT-tet株和大腸桿菌BL21pUClatlysPL-tet株的冷凍種菌接種于含有25μg/ml四環(huán)素的L培養(yǎng)基(3ml/離心沉淀管)中，于32℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)18小時(shí)。將500μl這些種菌接種于含有25μg/ml四環(huán)素的TB培養(yǎng)基(27.5ml/離心沉淀管)中，于32℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)660nm處的OD值分別為3.98和9.38。從各培養(yǎng)液分別取4.71ml和2.00ml，通過(guò)離心分離回收菌體，向回收的菌體中加入25mM磷酸緩沖液(pH6.8)1ml，再添加20％L-賴氨酸溶液20μl、20％甘油20μl，于32℃開(kāi)始轉(zhuǎn)換反應(yīng)。并于反應(yīng)開(kāi)始2小時(shí)后、7小時(shí)后、24小時(shí)后分別取100μl樣品，用HPLC對(duì)六氫吡啶羧酸和賴氨酸的量進(jìn)行定量。
轉(zhuǎn)換反應(yīng)2小時(shí)后、7小時(shí)、24小時(shí)時(shí)的六氫吡啶羧酸的蓄積量，大腸桿菌BL21pUClatlysPLargT-tet株分別為0.36g/l、0.73g/l、2.0g/l，相對(duì)于此，大腸桿菌BL21pUClatlysPL-tet株則分別為0.88g/l、1.3g/l、1.4g/l。可以看出，大腸桿菌BL21pUClatlysPL-tet株的六氫吡啶羧酸生產(chǎn)速度漸漸變得緩慢，與此相對(duì)，大腸桿菌BL21pUClatlysPLargT-tet株的六氫吡啶羧酸生產(chǎn)速度雖然在起始時(shí)不太好，但能維持大致一定的六氫吡啶羧酸生產(chǎn)速度。該六氫吡啶羧酸生產(chǎn)速度完全對(duì)應(yīng)于賴氨酸的減少速度。由該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確認(rèn)argT基因在六氫吡啶羧酸生產(chǎn)中的效果。實(shí)施例6進(jìn)行棒狀桿菌的lat轉(zhuǎn)化株谷氨酸棒桿菌ATCC31831 pClat株的培養(yǎng)試驗(yàn)。作為對(duì)照，對(duì)攜有沒(méi)有插入lat的質(zhì)粒的谷氨酸棒桿菌ATCC31831 pC2株也進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。將兩個(gè)菌株的瓊脂平板上的菌落分別接種到裝有3ml含有20μg/ml卡那霉素的L培養(yǎng)基的試管中，于32℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上培養(yǎng)18小時(shí)。將275μl所得培養(yǎng)液分別接種于裝有27.5ml含有20μg/ml卡那霉素的TB培養(yǎng)基的250ml體積的三角燒瓶中，于32℃在旋轉(zhuǎn)振蕩器上進(jìn)行正式培養(yǎng)，并于培養(yǎng)開(kāi)始后5、15、39、63小時(shí)分別添加550μl溶解于磷酸緩沖液(pH6.8)的50％甘油。在添加甘油開(kāi)始起135小時(shí)后終止培養(yǎng)，用HPLC對(duì)培養(yǎng)上清中的六氫吡啶羧酸進(jìn)行定量。結(jié)果表明，谷氨酸棒桿菌ATCC31831pClat株在添加最初的甘油后135小時(shí)蓄積了大約0.7g/l的六氫吡啶羧酸。另外，對(duì)照谷氨酸棒桿菌ATCC31831 pC2株中沒(méi)有看到有六氫吡啶羧酸的生產(chǎn)。這表明即使在棒狀桿菌中通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入的lat基因也可進(jìn)行表達(dá)，以及棒狀桿菌的吡咯啉-5-羧酸還原酶(基因proC)可以將通過(guò)LAT并由賴氨酸轉(zhuǎn)換的P6C還原為六氫吡啶羧酸。
序列表序列表<110>美露香株式會(huì)社(Mercian Corporation)<120>L-六氫吡啶羧酸的生物學(xué)制備方法<130>K-42Mercian<150>JP11/373389<151>1999-12-28<160>20<210>1<211>2663<212>DNA<213>泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)<220><400>1cccgggtgtc attgaatacc agcaggtcgc caggttgcag cagctggtcc agatcgcgca 60cctggcgatc ctccagcgca gccggtgccg gcggcaccag cagcaggcgg ctggccgaac 120gctccggcag cggcgcctgg gcaatcagtt cgggaggcag gtggtaggca aaatcggact 180tcttcaacgc cggcagctcg atacaacggg ggcgtcagtt tacgcccctg taccgcctgt 240gccctcaccg ctcgaacttg gtgcccagga tcaccgccgt ggtggtgcgc tcgaccccat 300cagtggcgcc gatggcatcg gtcagctcgt ccatcgccgc cacgccatcg acggcggcca 360tcgccaccag gtcatgcgcg ccactgaccg aatgcaggct gcgcaccgca gcaatggcct 420gcagcgcccg cacgaccgcc ggcattttct tcggcatcac ggtgatggag atatgcgcgc 480ggacctgctg gcgctccatc gcctggccaa ggcgcacggt gtagccggcg attattccgc 540tgtgctgcag ccgctcgatc cggctctgca ccgtggtccg cgacaccccg agccggcgcg 600ccagcgccgc ggtcgaggcg cgcgcatcct cacgcaacag gtcaagcaac tgtgcatccg 660cctgggaaat ggtcactttg tcgaaaacct ttcgtcaatc cgccgaaacc ggccattgat 720ttgagcagat tcgcactgcc atttgtagtg cgttaacggt tacaactaac actagacaca 780atcagcacgg attcagc atg tcc ctt ctt gcc ccg ctc gcc ccg ctc cgc 830Met Ser Leu Leu Ala Pro Leu Ala Pro Leu Arg1 5 10gcc cat gcc ggc acc cgc ctt acc cag ggc ctg tct gac ccg cag gtc878Ala His Ala Gly Thr Arg Leu Thr Gln Gly Leu Ser Asp Pro Gln Val15 20 25gag cag ctg gcc gcc aac cac cct gac ctg cgc gcc gcc atc gac gcc926Glu Gln Leu Ala Ala Asn His Pro Asp Leu Arg Ala Ala Ile Asp Ala30 35 40gct gcc gac gaa tac gcg cgc atc aaa ccg cag gcc gcg gca ttg ctg974Ala Ala Asp Glu Tyr Ala Arg Ile Lys Pro Gln Ala Ala Ala Leu Leu45 50 55gac ctg gat gaa agc gcg cag atc gcc gcc gtg cag gat ggc ttc gtc 1022Asp Leu Asp Glu Ser Ala Gln Ile Ala Ala Val Gln Asp Gly Phe Val60 65 70 75aac ttc tat gcc gat gat gcg gtg gtg ccc tat atc gcc ctg gcc gcc 1070Asn Phe Tyr Ala Asp Asp Ala Val Val Pro Tyr Ile Ala Leu Ala Ala80 85 90cgc ggg ccg tgg gtg gtc agc ctg aag ggc gcg gtg ctg tat gac gcc 1118Arg Gly Pro Trp Val Val Ser Leu 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Sequence)<220><223>為了將泥色黃桿菌賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(lat基因)的N末端ATG附近改變?yōu)镹deI位點(diǎn)而合成<400>2tccatatgtc ccttcttgcc ccgctcgccc<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>為了將泥色黃桿菌賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(lat基因)的終止密碼子下游改變?yōu)锽amHI位點(diǎn)而合成<400>3gcggatcctg ttgccgctgg tgccgggcag30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>為了將泥色黃桿菌賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因(lat基因)的N末端ATG附近改變?yōu)镠indIII位點(diǎn)而合成<400>4ataagcttgt cccttcttgc cccgctcgc 29<210>5<211>1837<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><400>5atttagccac gactacgttg cacttccagc caccacttct ccagctccgc ggcaaaggcc 60tggcggtcac gttgtgaaag gctatctggt ccgccggtct ggatcccact ggcacgtaag 120gtatccataa aatcgcgcat cgtcaggcgc tcacgaatgg tcgctggcgt gtaacgttcg 180ccgcgcggat taagcgccgc agcgcctttc tcgatggctt cagcagccaa aggtatatct 240gcggtgatca ccaaatcgcc cgcttcacac tgccggacaa tttcgttatc ggcaacgtcg 300aaacctgccg cgacgcgcag cgtacgaata aatcgcgatg gcggcacgcg taaactctgg 360tttgctacca gtaccagcgg catctgcata cgttccgccg cgcgatacaa 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權(quán)利要求
1.一種制備L-六氫吡啶羧酸的方法，該方法包括利用吡咯啉-5-羧酸還原酶進(jìn)行Δ1-哌啶烯-6-羧酸的還原的步驟。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，吡咯啉-5-羧酸還原酶來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)或棒狀(coryneform)桿菌。
3.權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其中，Δ1-哌啶烯-6-羧酸由利用賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶的L-賴氨酸的轉(zhuǎn)換步驟獲得。
4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中，賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶來(lái)自泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)。
5.權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其中，進(jìn)行Δ1-哌啶烯-6-羧酸的還原的步驟以及利用賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶的L-賴氨酸向L-六氫吡啶羧酸的轉(zhuǎn)換步驟，是使用由賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因轉(zhuǎn)化的具有吡咯啉-5-羧酸還原酶活性的大腸桿菌或棒狀桿菌實(shí)施的。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，大腸桿菌或棒狀桿菌至少含有一種選自外來(lái)的吡咯啉-5-羧酸還原酶編碼基因和外來(lái)的參與賴氨酸攝入的基因中的基因。
7.一種重組大腸桿菌或棒狀桿菌，其特征在于，含有可表達(dá)狀態(tài)的賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。
8.權(quán)利要求7所述的重組大腸桿菌，其特征在于，至少還含有一種可表達(dá)狀態(tài)的選自外來(lái)的吡咯啉-5-羧酸還原酶編碼基因和外來(lái)的參與賴氨酸攝入的基因中的基因。
9.權(quán)利要求8所述的重組大腸桿菌，其特征在于，參與賴氨酸攝入的基因是賴氨酸特異性通透酶編碼基因。
10.權(quán)利要求8所述的重組大腸桿菌或棒狀桿菌，其特征在于，參與賴氨酸攝入的基因是賴氨酸特異性通透酶編碼基因，并且在其上游還含有串聯(lián)排列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的編碼序列。
11.一種制備L-六氫吡啶羧酸的方法，該方法包括在含有L-賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求7～10任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌或棒狀桿菌，然后提取蓄積在培養(yǎng)物中的L-六氫吡啶羧酸的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供包括利用吡咯啉－5－羧酸還原酶還原Δ
文檔編號(hào)C12N15/54GK1415015SQ00817982
公開(kāi)日2003年4月30日 申請(qǐng)日期2000年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者藤井匡, 有德保秀, 向原學(xué), 成田隆夫, 上松仁, 一色邦夫 申請(qǐng)人:美露香株式會(huì)社